重组的机制仍未被完全确定，但涉及dna序列的拷贝、切割和共价连接。重组可以发生在两个不同dna分子之间(分子间重组)或单个dna分子的两个区域之间(分子内重组)。
本发明提供了一种将所需遗传元件插入到任何靶基因组中的方法，所述方法包括将如本文中所述形成的同源侧接的遗传元件重组到所述靶基因组中。
本发明还涉及用于病毒和基于病毒的载体的快速遗传操作的技术。所述靶dna可以是病毒基因组，例如疱疹病毒基因组如cmv。
根据本发明的一种情况，提供了一种用于构建dna重组片段的不基于pcr的方法，所述dna重组片段具有靶dna的基于重组的操作所需的与所述靶dna内的所需遗传操作位点同源的必需的侧接区。
用于dna病毒(疱疹病毒)基因组的操作的本发明的概述以图形示出。附图含有将本发明付诸实施的实例。
本发明的一种情况包括下述步骤：
a)鉴定所述靶dna中用于遗传元件的所需插入位点(概述图，a)；
b)对存在于待靶向用于遗传操作的dna内所述位点上游的所选限制性内切核酸酶的内源的(本源的)半位点进行定位，并由此确定上游同源区的5'范围(概述图，a)；
c)对存在于待靶向用于遗传操作的dna内所述位点下游的同一所选限制性内切核酸酶的内源的(本源的)半位点进行定位，并由此确定下游同源区的3'范围(概述图，a)；
d)合成侧接区基因盒(frc)，其引起所述上游和下游半位点的并置，从而导致形成侧接有所述上游和下游同源区的所述所选限制性内切核酸酶的完整限制性位点(概述图，b)；以及
e)将所述frc插入到包含用于操作所述靶dna的遗传元件的质粒载体中，在所述质粒载体上提供所述必需的侧接同源区，用于在所述所需插入位点处在所述靶dna内的重组(概述图，c和d)。
本发明的第二种情况利用了异源的(非本源的)半位点，其不存在于所述侧接靶基因组的本源dna序列中。这种异源(非本源)的半位点的使用是本发明的这两种版本之间的唯一区别。如果用于所述靶dna的遗传操作的重组技术不需要在所述dna重组片段的末端处具有本源序列，则可以使用非本源的半位点。
本发明的这种修改方案包括下述步骤：
a)鉴定所述靶dna中用于遗传元件的所需插入位点；
b)选择所选限制性内切核酸酶的异源的(非本源的)半位点，其中限制性位点的选择是基于在与待靶向的dna区域侧接的上游和下游同源区内不存在完整形式的所述限制性位点；
c)合成frc，其包括上游和下游同源区并引起被它们的非本源半位点隔开的所述上游和下游侧接同源区的并置，从而导致形成侧接有所述同源区的所述所选限制性内切核酸酶的完整限制性位点；以及
d)将所述frc插入到包含用于操作所述靶dna的遗传元件的质粒载体中；在所述载体上提供所述必需的侧接同源区，用于在所述靶位点处在所述基因组内的重组。
所述方法还包括以下步骤：通过使用所选限制性内切核酸酶在所述frc内切开来将所述载体线性化以形成重组片段，由此使所述重组片段具有所述必需的侧接同源区，以在所述靶位点处在所述基因组内指导重组。
所述限制性内切核酸酶位点可以在它不存在于在所述靶dna的操作期间使用的所述侧接同源区或遗传元件内的基础上进行选择。
在某些实施方式中，所述上游和下游同源区的长度为至少50个核苷酸(例如高效的基于e/t的重组所需的尺寸)。在其他实施方式中，所述区域的长度为至少500个核苷酸(例如高效的crispr/cas9重组所需的尺寸)。其他重组技术可以需要其他的同源区尺寸。
使用本发明制造的重组片段可以例如使用基于e/t的重组或基于crispr/cas9的重组或其他重组技术(例如基于reca的技术)来插入。
在一种情况下或实施方式中，本发明可以提供一种产生用于病毒基因组的遗传操作的重组片段的方法，所述方法使用基于e/t或基于crispr/cas9的重组或其他重组技术(例如基于reca的技术)将按照本文中描述的方法形成的质粒载体或重组片段重组到病毒基因组中。
在其他情况或实施方式中，本发明可用于针对新发传染病(eid)病原体的基于疱疹病毒的疫苗的快速构建。大多数生物学上重要的(即致死且可传播的)“高风险”病原体：1)从世界上的eid“热点”地区(通常是较低纬度地区的政治上不稳定的发展中国家)爆发；2)从少量“高价值”野生动物物种(啮齿动物、蝙蝠和非人类灵长动物)直接地或通过家畜(马、猪等)间接地“以动物传播方式”(即从动物到人类)传播到人类；并且3)作为以前从未遇到过的rna病毒存在。到目前为止，没有在野生动物物种或家畜中控制这些高风险病原体出现的稳健的手段。已知所试验的大多数病毒高风险病原体可以通过疫苗接种在免疫学上靶向，通常使用它们的主要表面蛋白作为靶抗原。在温带地区对抗狂犬病的经验也显示，野生动物的有效的疫苗接种能够阻止从动物向人类的传播。然而，在eid“热点”地区存在的更极端条件下，野生动物(或参与传播的家畜)的疫苗接种目前是不可克服的难题，因为常规的疫苗接种需要每只动物单独接种以诱导免疫。
本发明提供了一种快速构建重组的病毒或基于病毒的疫苗的方法，所述方法包括通过基于crispr/cas9的重组将按照本文中描述的方法形成的质粒载体或重组片段重组到病毒基因组中的步骤。当与有效的预先监督相组合时，这种实施方式将提供在人类中建立起eid威胁之前预先在源头处消除即将来临的eid威胁的手段。
在一种情况和实施方式中，本发明与快速重组技术例如crispr/cas9相组合，被用于构建基于疱疹病毒的“单发”疫苗，其在单次给药后能够提供耐久的长期持续的保护性免疫力水平。
在另一种情况或实施方式中，本发明与快速重组技术例如crispr/cas9相组合，被用于构建“自传播”(sd)疫苗。sd疫苗利用了基于疱疹病毒的复制型载体通过它们的动物宿主群体传播的能力，而不需直接接种每只动物。在这种实施方式中，本发明被用于快速生产针对鉴定到的eid病原体威胁的sd疫苗，其可用于接种所涉及的动物物种的有限数量的“创始”动物。由于sd疫苗被工程化改造成表达来自于目标eid病原体的靶抗原，因此所述sd疫苗从疫苗接种的动物向未疫苗接种的动物的传播引起eid特异性免疫力在整个所靶向的动物群体中的协同传播。
在一种情况或实施方式中，本发明与crispr/cas9或用于单发或sd疫苗的快速构建的类似的快速重组技术相组合，用作能够对eid热点地区的野生动物(或参与传播的家畜)中的高风险病原体进行有效的免疫靶向的手段。
与crispr/cas9技术相组合，本发明将复制型疱疹病毒用于疫苗构建。这与基于bac的方法相反，基于bac的方法使用作为bac维持的单一疱疹病毒基因组。除了提高疫苗构建的速度之外，这种将遗传上不一致的病毒混合物作为遗传背景用于基于crispr/cas9的克隆的做法，减少了与基于bac的克隆相伴的潜在问题，基于bac的克隆必需使用单一亲代基因型，其在某些情况下可能不知不觉地被弱化。
所述疫苗可以包含基于疱疹病毒的载体，例如基于cmv的载体。
所述基于cmv的载体可以选自但不限于人cmv(hcmv)、猿cmv(sccmv)、恒河猴cmv(rhcmv)、黑猩猩cmv(ccmv)、鼠cmv(mcmv)、大猩猩cmv(gocmv)和猪cmv(pcmv)。
所述基于疱疹病毒的载体可以另外地选自但不限于牛疱疹病毒4(bohv-4)、马疱疹病毒2(ehv-2)、鼬疱疹病毒1(mushv-1)。
本发明还提供了用于构建由本文所描述的载体构成、包含或包括所述载体的疫苗的技术。
本发明还提供了包含本文中所描述的疫苗或载体以及可药用载体的组合物。
本发明还提供了生产疫苗以治疗患有传染病或处于变成被传染病感染的风险下的对象的方法，所述方法包括选择需要治疗的对象，并向所述对象给药本文中所描述的重组载体、疫苗或组合物。
所述对象可以是例如人类或动物(例如野生动物或家畜)。
本发明还提供了生产本文中所描述的疫苗、载体或组合物的方法，其用于预防或治疗疾病。
本发明可适用于兽医学和人类的传染病控制以及人类和动物医学。
在一些情况和实施方式中，本发明涉及重组系统的改进，其产生于用于插入到靶基因组内的必需dna重组片段(遗传元件)的新的不依赖于pcr的生产方法。
在另一种情况下，本发明提供了一种dna重组片段的不依赖于pcr的生产方法，所述dna重组片段具有靶dna的基于重组的操作所需的与所述靶dna内的所需遗传操作位点同源的必需侧接区，所述方法包括下述步骤：
a)对存在于待靶向用于遗传操作的dna内所述位点上游和下游的所选限制性内切核酸酶的相应的内源(本源)“半位点”进行定位。或者，可以使用待靶向的dna区域内不存在的非内源(非本源)半位点。
b)合成(使用任何现有的dna合成技术)frc，其引起所选“半位点”的并置，从而导致形成所述所选限制性内切核酸酶的完整限制性位点。
c)将所述frc插入到环形载体中，所述载体包含用于操作所述靶dna的遗传元件。
d)通过使用所述所选限制性内切核酸酶在所述基因盒内切开来将所述载体线性化(如果正使用的所述重组需要线性化的话)以形成重组片段，由此所述重组片段具有必需的侧接同源区，用于在所述靶位点处在所述基因组内的重组。
所述上游和下游侧接臂可以如附图中所示放置。
在插入到含有在操作期间将要插入到所述靶dna分子中的任何其他遗传信息的环形dna载体中之后，使用所述限制性酶的切割产生具有所需上游和下游同源区的重组片段(如果正使用的所述重组系统需要线性化的话)。
正如对于分子生物学领域的普通技术人员来说显而易见的，所述内切核酸酶可以是稀有切点切割酶(rarecutter)并且不存在于所述靶dna的操作期间使用的侧接同源区或遗传元件内。稀有切点切割酶是具有在基因组中仅仅稀少出现的识别序列的限制性酶。例如，具有8个核苷酸识别位点的稀有切点切割酶平均每48个bp(65,536bp)切割一次。
在本发明中内源(本源)“半位点”的使用能够将所需dna修饰插入到靶基因组内，而不在所述侧接同源区的末端处向所述靶基因组添加任何附加的异源信息。
本发明还提供了在鉴定到新发疾病威胁后对抗eid病原体的方法，所述方法包括使用本文中所描述的一个或多个方法步骤快速合成重组的病毒或基于病毒的疫苗的步骤。
本发明可以提供产生cmv载体的方法，所述载体例如用于癌症的治疗或基于传染性病原体的疾病的治疗。
本发明的不同情况和实施方式可以分开或一起使用。
本发明的其他特定和优选的情况被阐述在独立和从属权利要求中。从属权利要求的特征在适合时可以与独立权利要求的特征组合，并且可以以除了权利要求中明确阐述的组合之外的方式进行组合。
现在将参考附图，通过实例更具体地描述本发明。
所述示例性实施方式被足够详细地描述，以使本领域普通技术人员能够具体化并执行本文中描述的系统和过程。重要的是理解实施方式可以以许多可替选形式提供，并且不应被解释为限于本文中阐述的实例。
因此，尽管实施方式可以以各种不同方式修改并采取各种不同的可选形式，但其特定实施方式被显示在图中并作为实例在下文中详细描述。并非旨在限于所公开的特定形式。相反，应该包括落于权利要求书的范围之内的所有修改形式、等同形式和可替选形式。在全部附图和详细描述中，在适合时，示例性实施方式的要素一致地用相同的编号表示。
除非另有定义，否则在本文中使用的所有术语(包括技术和科学术语)应该如本领域中所惯用的进行解释。还应该理解，除非在本文中明确地如此定义，否则习惯用语中的术语也应该如相关领域中所惯用的而不是在理想化或过于正式的意义上进行解释。
第1页——ez-重组系统的概述
ez-重组系统的概述
a)疱疹病毒基因组内用于遗传元件插入的位点的图示。“a”(5'-aaac-3')和“c”(反向链上的5'-aaac-3')表示稀有切点(8nt切割酶)(在这种情况下是pme1：gtttaaac)的内源的“半位点”，其在用于插入的靶位点的上游和下游内源序列内平均每256nt出现一次。所述特定8nt限制性酶序列的选择是基于i)它不存在于侧接区中，并且ii)不存在于含有用于插入的异源遗传元件的自杀类载体内。
b)然后合成侧接区基因盒(frc)，其具有“新的”单一pme1位点和用于插入到pminiori(自杀类载体)中的必需限制性位点(e和f)(使用ampr载体——基因合成通常由来自于invitrogen的geneart进行)。
c)将所述frc克隆到含有用于插入到疱疹病毒基因组中的遗传元件的相应miniori(自杀类载体)中。
d)得到的质粒的示意图。
e)使用pme1消化将所述重组片段线性化，其含有用于在疱疹病毒基因组内基于e/t的重组的必需的侧接同源区(hr)。5'磷酸残基被示出以指示dna链取向。
第2和3页——具体实施。实施例1。使用本发明将ebov的gp克隆在内源rhcmvrh25启动子控制之下，由此产生在rhcmvrh25启动子下表达ebovgp的重组rhcmv。
ez重组系统ii的具体实施
a)将ebovgp插入在恒河猴巨细胞病毒(rhcmv)基因组内以置于内源rh25(ul9)(晚期)启动子的控制之下的示意图。“a”(5'-aaac-3')和“c”(反向链上的5'-aaac-3')表示在用于插入的靶位点上游和下游的侧接同源区(hr)中的pme1(gtttaaac)的内源的“半位点”。选择pme1是基于i)它不存在于侧接区中，并且ii)不存在于含有用于插入的ebovgp的自杀类载体内。
b)合成frc，其具有“新的”单一pme1位点和用于插入到pminiori(自杀类载体)中的必需限制性位点(nhe1和mfe1)(使用来自于invitrogen的geneart的ampr载体)。
c)将所述frc克隆到含有用于插入到rhcmv基因组中的ebovgp的pminiori(自杀类载体)中。
d)得到的质粒的示意图。
e)使用pme1消化将所述重组片段线性化，其含有用于在rhcmv基因组内基于e/t的重组所必需的侧接hr。5'磷酸残基被示出以指示dna链取向。
f)通过dna凝胶电泳进行的多个ecori消化的rhcmvebov(prh25)bac克隆的基因组表征确认了不存在任何总体遗传重排。
g)然后将bacdna电穿孔到rhcmv可感染的恒河猴成纤维细胞中，以重建作为复制型病毒的rhcmvebov疫苗。将病毒纯化，并通过被感染的细胞裂解物的蛋白质印记分析确认ebovgp靶抗原的表达。
第4和5页——具体实施。实施例2。使用本发明将ebov的gp克隆在内源rhcmvrh220启动子的控制之下，由此产生在rhcmvrh220启动子之下表达ebovgp的重组rhcmv。
在rh220内源启动子控制之下的gpebov的克隆
a)将ebovgp插入在恒河猴巨细胞病毒(rhcmv)基因组内以置于内源rh220(us28.5)(e)启动子的控制之下的示意图。“a”(5'-aaac-3')和“c”(反向链上的5'-aaac-3')表示在用于插入的靶位点上游和下游的侧接同源区(hr)中的pme1(gtttaaac)的内源的“半位点”。选择pme1是基于i)它不存在于侧接区中，并且ii)不存在于含有用于插入的ebovgp的自杀类载体内。
b)合成frc，其具有“新的”单一pme1位点和用于插入到pminiori(自杀类载体)中的必需限制性位点(nhe1和mfe1)(使用来自于invitrogen的geneart的ampr载体)。
c)将所述frc克隆到含有用于插入到rhcmv基因组中的ebovgp的pminiori(自杀类载体)中。
d)得到的质粒的示意图。
e)使用pme1消化将所述重组片段线性化，其含有用于在rhcmv基因组内基于e/t或crispr的重组所必需的侧接hr。5'磷酸残基被示出以指示dna链取向。
f)通过dna凝胶电泳进行的多个ecori消化的rhcmvebov(prh220)bac克隆的基因组表征确认了不存在任何总体遗传重排。
g)然后将bacdna电穿孔到rhcmv可感染的恒河猴成纤维细胞中，以重建作为复制型病毒的rhcmvebov疫苗。将病毒纯化，并通过被感染的细胞裂解物的蛋白质印记分析确认ebovgp靶抗原的表达。
第6和7页——具体实施。实施例3。使用本发明将ebov的gp克隆在异源人类ef1α启动子的控制之下，由此产生在人类ef1α启动子控制之下表达ebovgp的重组rhcmv。
ez重组系统ii的具体实施。
a)将ebovgp插入在恒河猴巨细胞病毒(rhcmv)基因组内以置于异源启动子的控制之下的示意图。“a”(5'-aaac-3')和“c”(反向链上的5'-aaac-3')表示在用于插入的靶位点上游和下游的侧接同源区(hr)中的pme1(gtttaaac)的内源的“半位点”。选择pme1是基于i)它不存在于侧接区中，并且ii)不存在于含有用于插入的ebovgp的自杀类载体内。
b)合成frc，其具有“新的”单一pme1位点和用于插入到pminiori(自杀类载体)中的必需限制性位点(mfe1)(使用来自于invitrogen的gene-art的ampr载体)。
c)将所述frc克隆到含有用于插入到rhcmv基因组中的ebovgp的pminiori(自杀类载体)中。
d)得到的质粒的示意图。
e)使用pme1消化将所述重组片段线性化，其含有用于在rhcmv基因组内基于e/t的重组所必需的侧接hr。5'磷酸残基被示出以指示dna链取向。
f)通过dna凝胶电泳进行的多个ecori消化的rhcmvebov(pef1α)bac克隆的基因组表征确认了不存在任何总体遗传重排。
第8页——使用将ebov的gp克隆在异源人类ef1α启动子的控制之下作为实例，旨在使用crispr/cas9技术的ez重组系统的概述
用于构建重组片段以使用crispr/cas9技术将ef1α-gp插入到rhcmv中(rh213与rh214之间)的ez重组系统的概述
a)对于crispr/cas9重组来说，需要>500nt的hr区(russell等，2015)。因此，所选的pme1半位点位于所需插入位点(*)(在216,232与216,233之间)的上游634bp(nt215,598)和下游731bp(nt216,964)。
b)合成frc，其具有“新的”单一pme1位点以及用于插入到pminiorief1α/ebovgp(自杀类载体)的ecori中的mfe1位点(使用ampr载体——基因合成由来自于invitrogen的geneart进行)。
c)将所述frc克隆到用于插入到rhcmv基因组中的ef1αebov/gpminiori中。注：在5'utrhr中存在内源ecori位点要求使用mfe1来克隆到pminiorief1α/ebovgp的ecori位点中。
d)得到的质粒的示意图。注：在“用于插入的遗传元件”上，ef1αebovgporf以x到y的方向运行。
e)使用pme1消化将所述重组片段线性化，其现在含有在rhcmv基因组内用于基于crispr/cas9的重组的必需侧接同源区(hr)。
f)在存在tk(丙氧鸟苷)负选择的情况下，通过共表达flp重组酶(使用flp表达质粒)，从重组rhcmv病毒基因组移除侧接有frt的kanr+tk/gfp基因盒。5'磷酸残基被示出以指示dna链取向。(*)用于rhcmv基因组内的遗传元件插入的位点(编号基于malouli等，2012；acc#jq795930)，其在rh213和rh214基因间区中。“a”(5'-aaac-3')和“c”(反向链上的5'-aaac-3')表示pme1：gtttaaac(稀有的8nt切割酶)的内源的“半位点”。
尽管在本文中已参考附图详细公开了本发明的说明性实施方式，但应该理解，本发明不限于所示的确切的实施方式，并且本领域技术人员可以在其中进行各种不同的改变和修改而不背离本发明的范围。参考文献
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