本
技术实现要素：
是关于用以改造细胞，使细胞携带特定基因的系统、试剂盒及方法；以及利用这些经改造的细胞做为治疗药剂，以治疗有需要的个体的用途。
背景技术：
piggybac(pb)转位子(transposon)是一种可移动的遗传组件(mobilegeneticelement)，能通过“剪贴”机制有效率地在载体及基因组(genome)之间移动。在移动过程中，pb转位酶会辨识位于转位子载体二端的转位子特定反向末端重复序列(transposon-specificinvertedterminalrepeatsequences,itrs)，进而将内含物由原始位置有效率地整合(integrate)至ttaa基因组位置。pb转位子系统的活性可使位于pb载体的二个itrs间的特定基因轻易地移动至标的基因组中。
pb转位子的特点包含：(1)无携带基因的长度限制；已知pb转位子可促使长达100kbp(kilobase)的dna片段移动至标的细胞中；(2)转置具可逆性；将仅会表达pb转位酶的载体暂时性地转染至包含插入pb载体的基因组中，可将转位子由基因组中移除；以及(3)pb转位子可广泛应用于不同物种；对ttaa具有专一性的pb转位子可对各式物种进行基因改造，举例来说，昆虫细胞及哺乳动物细胞。此外，相较于病毒载体，pb转位子的免疫原性(immunogenicity)较低，较不易引发过敏反应。
免疫系统对人类健康极为重要。免疫系统发生缺陷或无法正常作用会降低个体消灭异常体细胞及侵入性病原菌的能力，进而造成肿瘤或感染等疾病。另一方面，当免疫系统过度活化时，则会攻击及伤害自体组织，引发自体免疫疾病及发炎反应。因此，调控免疫细胞的表达、功能或作用(例如转入(introduce)外源性基因)，以(i)提升或降低免疫细胞的基因表达，或(ii)增加或抑制免疫细胞的功能，提供了一种用以预防及/或治疗免疫相关疾病的方法。然而，免疫细胞无法稳定表达外源性基因的特性往往限制了其于细胞治疗方面的应用。
因此，相关领域亟需一种经改良的表达系统及方法，以使免疫细胞有效且稳定地表达外源性dna序列(例如基因)，进而应用于细胞治疗以预防或治疗免疫相关疾病。
发明内容
发明内容旨在提供本发明内容的简化摘要，以使阅读者对本发明内容具备基本的理解。此发明内容并非本发明内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键组件或界定本发明的范围。
本发明内容是关于一种于活体外将一外源性dna序列整合至一细胞的基因组的方法。该方法包含：(i)得到一转位子系统，其包含：(a)一第一载体，包含一由seqidno:1所组成的核苷酸序列的第一反向重复；位于该第一反向重复下游的外源性dna序列；及一位于该外源性dna序列下游且包含由seqidno:2所组成的核苷酸序列的第二反向重复；以及(b)一第二载体，包含一可操作式地连接至一核酸的启动子，其中该核酸可编码出一具有seqidno:4的氨基酸序列的转位酶；以及(ii)将第一及第二载体转入该细胞。待转位酶于该细胞中被表达后，即可催化由第一载体将外源性dna序列剪切下来的反应，并整合至该细胞的基因组，以将外源性dna序列整合至细胞的基因组中。
本发明内容涉及一用以将一外源性dna序列整合至细胞基因组的试剂盒。该试剂盒包含(i)一容器；(ii)一转位子系统，包含(a)一第一载体，包含一由seqidno:1所组成的核苷酸序列的第一反向重复，一位于该第一反向重复的下游且具有由seqidno:2所组成的核苷酸序列的第二反向重复，以及一位于该第一反向重复与该第二反向重复之间、可使外源性dna序列转入的克隆位置；以及(b)一第二载体，包含一可操作式地连接至一核酸的启动子，其中该核酸可编码出一具有seqidno:4的氨基酸序列的转位酶；以及(iii)一随附的操作说明，以指示如何使用本发明转位子系统。该转位酶可催化由第一载体剪切下外源性dna序列的反应，并将其整合至细胞的基因组中。
此外，本发明内容还涉及一种用以治疗一罹患或疑似罹患免疫相关疾病的个体的方法。该方法包含利用本发明活体外方法(较佳是利用本发明试剂盒)，将一外源性dna序列整合至一免疫细胞的基因组中，以改造该免疫细胞；再对个体投予一有效量的前述经改造的免疫细胞，以改善或减缓免疫相关疾病的病征。
在参阅下文实施方式后，本领域技术人员当可轻易了解本发明的基本精神及其它发明目的，以及本发明所采用的技术手段与实施方式。
附图说明
图1a为一柱状图，其是关于将以酶剪切/连接法制备的辅助质粒及dna供体(环状形式)共转染至hek293细胞后，对匀霉素(hygromycin)具有抗性的hek293细胞群(colony)的数量；
图1b是一柱状图，其是关于将以酶剪切/连接法制备的辅助质粒及dna供体(线状形式)共转染至hek293细胞后，对匀霉素具有抗性的hek293细胞群的数量；
图1c为依据本发明内容实施例1所阐述的柱状图，其是关于将以商业化试剂盒制备的辅助质粒及dna供体共转染至hek293细胞后，对匀霉素具有抗性的hek293细胞群的数量；
图2a是一柱状图，其是关于将以酶剪切/连接法制备的辅助质粒及dna供体共转染至jurkatt细胞后，对匀霉素具有抗性的jurkatt细胞群的数量；
图2b为依据本发明内容实施例2所阐述的柱状图，其是关于将以商业化试剂盒制备的辅助质粒及dna供体共转染至jurkatt细胞后，对匀霉素具有抗性的jurkatt细胞群的数量；以及
图3为依据本发明内容实施例3所阐述的柱状图，其是关于特定dna供体及辅助质粒于初代人类t细胞所产生的转位功效。
具体实施方式
为了使本发明内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施方式与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，也可利用其它具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。
1.定义
除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含义与本领域技术人员所理解与惯用的意义相同。此外，在不和上下文冲突的情形下，本说明书所用的单数名词涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时也涵盖该名词的单数型。具体而言，在本说明书与权利要求书中，单数形式“一”(a)及“一”(an)包括复数参考值，但依据上下文而另有指示者除外。此外，在本说明书与权利要求书中，“至少一”与“一或更多”等表述方式的意义相同，两者都代表包含了一、二、三或更多。
虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，视本领域技术人员的考虑而定。除了实验例之外，或除非另有明确的说明，当可理解此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其它相似者)均经过“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随权利要求书所公开的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。
在本发明内容中，“转位子”(transposon或transposableelement)一词是指一多核苷酸，其可由一供体多核苷酸(例如，一载体)剪下后，整合至一标的位置(例如，细胞的基因组或额外染色体(extrachromosome))，以改变其于基因组中的位置。转位子为包含一核苷酸序列的多核苷酸，其中该核苷酸序列的二端分别具有顺式作用(cis-acting)核苷酸序列，其中至少一顺式作用核苷酸序列是位于该核苷酸序列的5'端，且至少一顺式作用核苷酸序列是位于该核苷酸序列的3'端。位于转位子各端的顺式作用核苷酸序列包含至少一反向重复(invertedrepeat,ir)；转位酶(较佳是哺乳动物piggybac家族的转位酶)可结合至该反向重复。在一较佳实施方式中，转位子为源自蛾的micro-piggybac转位子。
在本发明内容中，“转位酶”(transposase)一词是指一多肽，其可催化由一供体多核苷酸(例如一微环(minicircle)构建体)剪切出转位子的反应，接着将该转位子整合至一标的细胞的基因组或额外染色体dna中。较佳地，转位酶会结合至反向重复序列。
在本发明内容中，“多肽”(polypeptide)一词是指一具有任何长度的氨基酸聚合物。因此，多肽的定义包含肽(peptide)、寡肽(oligopeptide)、蛋白(protein)、抗体(antibody)及酶(enzyme)。“多肽”(polypeptide)一词也包含多肽的转译后修饰，举例来说，醣化(glycosylation，例如加入一醣类)、乙酰化(acetylation)及磷酸化(phosphorylation)等。
“载体”(vector)一词在本说明书是指一核酸分子，其可传送与其连结的另一核酸分子。示例性的载体包含，但不限于，细菌、质粒、噬菌体、粘粒(cosmid)、附加体(episome)、病毒及可插入的dna片段，例如可通过同源重组(homologousrecombination)插入宿主细胞的基因组的片段。
在本说明书中，“质粒”(plasmid)一词是指环状的双股dna，可接受一外来的dna片段，且能于原核或真核细胞中进行复制。
“微环”(minicircle)、“微环dna”(minicircledna)及“微环核苷酸序列”(minicirclenucleicacidsequence)在本说明书为可互换的词汇，皆是指一不包含任何复制所需的质粒/载体骨架的核苷酸序列，例如原核生物的抗生素抗性基因及原核生物的复制原点。可以细菌质粒于活体内制备微环，其是利用质粒中重组酶辨识位点间的分子内重组来产生一不具有细菌质粒骨架dna的微环dna载体。依据本发明内容一实施方式，是利用酶剪切/连结法来制备本发明微环。依据本发明内容另一实施方式，是利用商业化试剂盒(微环dna制备试剂盒,systembiosciences,ca,usa)来制备本发明微环。
在本发明内容中，“转入”(introduce)一词是指将一多核苷酸(例如本发明转位子系统的微环核苷酸序列或辅助载体)转入一细胞或生物体。多核苷酸的核酸可以是裸露的dna或rna、与不同蛋白连接的dna或rna，或插入一载体的dna或rna。“转入”(introduce)一词在本发明内容涵盖了最广泛的范围；举例来说，转入包含以下方法所达成的传送功效：转染法(transfection，利用物理及/或化学处理将一多核苷酸转入一真核细胞)、转化法(transformationmethod，利用物理及/或化学处理将一多核苷酸转入一原核细胞)、病毒法/病毒转导法(viralmethod/viraltransductionmethod，以病毒或病毒载体将一多核苷酸转入一真核及/或原核细胞)、接合法(conjugationmethod，通过细胞-细胞直接接触或细胞间的细胞质桥，将一多核苷酸由一细胞转入另一细胞)及融合法(fusionmethod，融合二细胞，包含同型细胞融合及异型细胞融合)。
“改造”(engineer)在本发明内容是指处理一细胞，造成该细胞产生可侦测的变化，其中该处理包含，但不限于，插入一与细胞异源(heterologous)/同源(homologous)的多核苷酸及/或多肽，以及使一细胞原生的多核苷酸及/或多肽产生突变。
在本发明内容中，“转位”(transposition)一词是指一复杂的基因重组过程，包含一多核苷酸(转位子)由一位点移动或复制到另一位点，该移动/复制常发生于基因组内、基因组之间、dna构建体(例如质粒、杆粒(bacmid)及粘粒)之间，或是基因组及dna构建体之间。依据本发明内容实施方式，转位是发生于基因组及dna构建体之间，其中多核苷酸(例如本发明转位子系统的表达组)是由本发明转位子系统的微环核苷酸序列转移至宿主细胞(例如免疫细胞)的基因组。
“转位功效”(transpositionefficacy)在本发明内容是指在一群宿主细胞中，包含转入多核苷酸的宿主细胞的数量。一般来说，可将一用以编码报告蛋白(例如β-gal)的多核苷酸转染至标的细胞来决定转位功效。据此，可通过分析转入多核苷酸的基因产物(例如检测具有β-gal活性的细胞数量)来决定转位功效。依据本发明内容一实施方式，转入的多核苷酸是一匀霉素抗性基因，因此可通过检测对匀霉素具有抗性的细胞数量来决定转位功效。
在本发明内容中，“免疫细胞”(immunecell)一词是指会影响免疫反应的细胞。免疫细胞是源自造血来源的细胞，包含淋巴细胞(例如b细胞及t细胞)、自然杀手细胞及髓质性细胞(例如单核细胞(monocyte)、巨噬细胞(macrophage)、嗜酸性细胞(eosinophil)、肥大细胞(mastcell)、嗜碱性细胞(basophil)及粒性白细胞(granulocyte))。
在本发明内容中，“免疫相关疾病”(immune-relateddisease)是指一疾病及/或病状，其中免疫系统涉及了该疾病的致病机制，或是适度的刺激或抑制可治疗及/或预防该疾病。例示式的免疫相关疾病包含，但不限于，肿瘤、感染性疾病、过敏、自体免疫疾病、移植物抗宿主疾病(graft-versus-hostdisease)或发炎性疾病。
“个体”(subject)一词是指包含人类的动物，其可接受本发明方法的治疗。除非特定指出，否则“个体”(subject)一词同时意指男性及女性。
2.发明叙述
本发明内容是关于用以改造细胞、使细胞携带特定基因(例如治疗蛋白的基因)的系统、方法及/或试剂盒。经改造后的细胞可作为一种治疗药剂，据以对可接受特定基因产物治疗的疾病及/或病状产生治疗功效。
如上所述，本发明内容提供了一种可于活体外将一外源性dna片段整合至一细胞的基因组的方法。该dna序列可编码出一对抗生素具有抗性的蛋白(antibioticresistanceprotein)、一sirna、一报告蛋白(reporterprotein)、一细胞激素(cytokine)、一激酶(kinase)、一抗原(antigen)、一具有抗原特异性的受体(antigen-specificreceptor)、一细胞激素受体(cytokinereceptor)或一自杀多肽(suicidepolypeptide)。举例来说，外源性dna序列可编码出一种对肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen)具有专一性的受体。经由本发明方法改造后的t细胞，可辨识且具专一性地毒杀会表达该肿瘤相关抗原的肿瘤细胞。在另一实施例中，外源性dna序列可编码出一种对匀霉素具有抗性的蛋白，以建立对匀霉素具有抗性的细胞株。或者是，外源性dna序列可不具任何生物功能，而是通过将自身片段插入一必要基因中，以阻断另一基因的功能。举例来说，外源性dna序列可编码出一反义rna(anti-senserna)，以缄默pd-1或t细胞特异受体(tcellspecificreceptor,tcr)的基因表达。
首先，取得一转位子系统来执行本发明方法。
该转位子系统包含一第一载体，其是包含一具有由seqidno:1所组成的核苷酸序列的第一反向重复，一位于该第一反向重复下游的外源性dna片段，以及一位于该外源性dna序列下游，且具有由seqidno:2所组成的核苷酸序列的第二反向重复。该第一载体可更包含一非原核生物启动子，其是可操作式地连接至该外源性dna序列。举例来说，该非原核生物启动子可以是巨细胞病毒(cytomegalovirus,cmv)启动子、劳斯肉瘤病毒(roussarcomavirus,rsv)启动子、猿猴病毒(simianvirus,sv40)启动子、鼠乳腺瘤病毒(mousemammarytumorvirus,mmtv)启动子、磷酸甘油激酶(phosphoglyceratekinase,pgk)启动子、鸡第二型活性(chickenbeta-active)启动子、延长因子1-α(elongationfactor1-alpha,ef1-α)启动子、人类h1启动子(humanh1promoter)或u6启动子(u6promoter)。在一实施例中，该第一载体更包含一增强子(enhancer)、一沉默子(silencer)或一绝缘子(insulator)。
在一特定实施方式中，该第一载体是一不包含细菌于复制时所需的原核生物序列的微环dna。在排除外源性dna序列后，该微环dna的序列长度为500-1,500bp。举例来说，在排除外源性dna序列后，该微环dna的序列长度可以是700-1,200bp或800-1,000bp。
一般来说，原核生物dna常被视为一种免疫刺激性抗原，会引发宿主产生免疫反应而降低第一载体携带的外源性dna的表达功效。因此，相较于其它包含原核生物dna序列的转位子/表达系统来说，缺少原核生物序列的微环dna可使本发明转位子系统更有效率地将外源性dna转入宿主细胞(例如一真核生物的细胞)进行表达。此外，相较于传统的转位子/表达系统，本发明转位子系统由于微环dna缺少原核生物dna序列，具有较小的体积/长度。
本发明转位子系统还包含一第二载体(例如，一辅助质粒)，其包含一可操作式地连接至一核酸的启动子，其中该核酸可编码出一转位酶。该转位酶可辨识并结合至第一载体的第一反向重复及第二反向重复。举例来说，该转位酶可以是thyplgmh、mycpbase、tplgmh或hahypbase。在一特定实施方式中，该转位酶具有seqidno:4的氨基酸序列，其是由seqidno:3编码而得。可依据本领域技术人员所熟知的方法或依据yaa-jyuhnjamesmeiret.al.(aversatile,highlyefficient,andpotentiallysaferpiggybactransposonsystemformammaliangenomemanipulations,faseb,2013:27,4429-4443)所述方法来制备辅助质粒。
位于该第二载体的启动子是选自由巨细胞病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、猿猴病毒启动子、鼠乳腺瘤病毒启动子、磷酸甘油激酶启动子、鸡第二型活性启动子、延长因子1-α启动子、人类h1启动子及u6启动子所组成的群组。在一特定实施方式中，启动子是巨细胞病毒启动子。
在执行本发明方法时，是将第一载体及第二载体转入一细胞中。示例性的转入方法包含，但不限于，磷酸钙共沉淀(calciumphosphateco-precipitation)、电穿孔(electroporation)、核转染(nucleofection)、细胞挤压(cellsqueezing，轻压细胞膜)、超音波穿孔(sonoporation，利用高强度超音波于细胞膜形成孔洞)、光转染(opticaltransfection，利用高聚焦雷射于细胞膜制造一微小孔洞)、基因交付(impalefection，将dna连接至一纳米纤维表面并注入细胞中)、基因枪(genegun，将dna连接至一惰性固体的纳米粒子后，注入标的细胞核内)、磁转染(magnetofection，利用磁力将dna送至标的细胞内)、病毒转染(viraltransduction，利用病毒作为载体，将dna送至标的细胞内)或以树枝状聚合物(dendrimer)、脂质体(liposome)及阳离子聚合物(cationicpolymer)进行转染。在一实施例中，是利用非脂质体的化学方法(
第一载体及第二载体在转入细胞时的重量比约为2:1到1:1。依据一实施方式，在将外源性dna转入一上皮细胞时，第一载体(例如微环dna)与第二载体的重量比约为2:1到1:1。依据另一实施方式，在将外源性dna转入一永生化t细胞时(immortaltcell)，微环核苷酸序列与辅助质粒的重量比约为2:1到1:1。依据再另一实施方式，在将外源性dna转入一初代t细胞时，微环核苷酸序列与辅助质粒的重量比约为2:1到1:1。
第二载体于细胞表达转位酶后，该转位酶可催化由第一载体剪切出外源性dna序列的反应，并将剪切出来的外源性dna整合至细胞的基因组中。
本发明方法所使用的细胞可以是一免疫细胞。更具体来说，该免疫细胞可是t细胞、b细胞、树突细胞(dendriticcell)、巨噬细胞或肥大细胞。
在另一实施方式中，该细胞是一干细胞。举例来说，干细胞可以源自骨髓(bonemarrow)、脂肪组织(adiposetissue)、周边血(peripheralblood)、脐带血(umbilicalcordblood)或牙髓(dentalpulp)。在一特定方法中，该细胞是一人类细胞。
为执行上述方法，本发明内容还提供一可将外源性dna序列整合至细胞的基因组的试剂盒。该试剂盒包含一容器，其是包含上述本发明转位子系统；以及一随附的操作说明，以指示如何使用本发明转位子系统。如上所述，本发明转位子系统包含一第一及一第二载体。
第一载体包含一具有由seqidno:1所组成的核苷酸序列的第一反向重复，一位于该第一反向重复下游且具有由seqidno:2所组成的核苷酸序列的第二反向重复，以及一位于该第一反向重复与该第二反向重复之间、可使外源性dna序列转入的克隆位置。
本发明试剂盒的第一载体可更包含一非原核生物的启动子，其是位于第一反向重复的下游及克隆位置的上游。在将外源性dna插入克隆位置后，非原核动物的启动子即可操作式地连接至该外源性dna序列。举例来说，非原核生物的启动子可以是巨细胞病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、猿猴病毒启动子、鼠乳腺瘤病毒启动子、磷酸甘油激酶启动子、鸡第二型活性启动子、延长因子1-α启动子、人类h1启动子或u6启动子。在一实施例中，第一载体更包含一增强子、一沉默子或一绝缘子。
本发明试剂盒还包含一第二载体，即一辅助质粒，其是包含一可操作式地连接至一核酸的启动子，其中该核酸可编码出一转位酶。举例来说，该转位酶可以是thyplgmh、mycpbase、tplgmh或hahypbase。在一特定实施方式中，该转位酶具有seqidno:4的氨基酸序列。
如本发明方法所述，本发明试剂盒的第二载体包含一启动子，其是选自由巨细胞病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、猿猴病毒启动子、鼠乳腺瘤病毒启动子、磷酸甘油激酶启动子、鸡第二型活性启动子、延长因子1-α启动子、人类h1启动子及u6启动子所组成的群组。在一特定实施方式中，该启动子是巨细胞病毒启动子。
在本发明内容中，“使用操作说明”(instruction)一词包含了书册、录制物、图表或任何传达媒介(例如磁带、cd、vcd或dvd)，可用以告知或指示使用者如何使用本发明转位子系统。使用操作说明可固定于容器上，或与包含本发明转位子系统的容器分开包装。
本发明试剂盒可更包含一用以稳定转位子系统及/或进行细胞转染的缓冲溶液。举例来说，缓冲溶液可以是磷酸盐缓冲生理食盐水(phosphate-bufferedsaline,pbs)、包含tris的生理食盐水(tris-basedsaline)、tris-edta缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicacid)缓冲液或n,n-双(2-羟乙基)-2-胺基乙磺酸(n,n-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonicacid,bes)缓冲液。
如上所述，本发明内容提供了一种用以治疗罹患或疑似罹患免疫相关疾病的个体的方法。该方法包含利用本发明试剂盒来改造一细胞，使该细胞携带一适用于治疗该免疫相关疾病的基因；以及对该个体投予一有效量的经改造的细胞，以治疗该免疫相关疾病。在一实施例中，基因为可辨识cd19的嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor,car)，可通过改造cart细胞来治疗急性淋巴性白血病。
罹患或疑似罹患免疫相关疾病的个体为一哺乳类动物，包含人类、小鼠、大鼠、兔子、猴子及猪。在一特定实施方式中，个体为人类。当治疗的个体为人类时，本发明方法的经转入/转染的免疫细胞较佳是源自该个体本身。或者是，本发明方法的经转入/转染的免疫细胞是源自一供体。
依据本发明内容某些实施方式，本发明方法可用以治疗一免疫抑制疾病，例如肿瘤或感染性疾病。在这些实施方式中，本发明转位系统可包含一免疫增强基因，藉以提升该个体的免疫反应。
依据本发明内容某些实施方式，本发明方法可用以治疗一因免疫反应过度活化所造成的疾病(例如自体免疫疾病)或因免疫反应异常所造成的疾病(例如过敏、移植物抗宿主疾病或发炎性疾病)。在这些实施方式中，本发明转位系统可包含一免疫抑制基因，以抑制该个体的免疫反应。
下文提出多个实验例来说明本发明的某些实施方式，以利本领域技术人员操作本发明，且不应将这些实验例视为对本发明范围的限制。据技术人员在阅读了此处提出的说明后，可在不需过度解读的情形下，完整利用并实践本发明。此处所引用的所有公开文献，其全文皆视为本说明书的一部分。
实施例
材料及方法
细胞培养
本研究是利用人类胚胎肾脏细胞株293(hek293)、人类jk永生化t淋巴球(jurkatt)及初代人类t细胞进行相关分析。将hek293细胞培养于包含10％胎牛血清、2mml-谷氨酰胺(l-glutamine)、1倍非必要氨基酸(nonessentialaminoacid)、1倍青霉素/链霉素(penicillin/streptomycin)及1mm丙酮酸钠(sodiumpyruvate)的mem细胞培养液中。将jurkatt细胞及初代人类t细胞培养于包含2mml-谷氨酰胺、10％胎牛血清、1mm丙酮酸钠及0.1mm非必要氨基酸的rpmi1640细胞培养液中。所有的细胞皆培养于包含5％co2的37℃环境中。
制备条件培养液(conditionedmedium)
将jurkat细胞以每毫升2x106个细胞的密度于新鲜细胞培养液中培养24小时，之后收集并过滤细胞培养液，作为条件培养液。
制备质粒及/或表达构建体
pbs-cassette
由pcdna3.1_hygro_lacz载体(invitrogen)剪切出包含由sv40启动子启动的匀霉素抗性基因的dna片段。以xmni及sapi酶剪切后，将dna片段克隆至pbluescriptskii的smai位置，藉以建构pbs-hygro。为进一步插入对卡那霉素(kanamycin)具有抗性的基因及复制原点cole1，将pzero-2.1(invitrogen)中的apoi_afliii片段克隆至pbs-hygro的ecorv位置，以建构pbs-cassette。
mini-piggybac_long(长式mini-piggybac)
以限制酶smai及ecorv剪切pbs-cassette后，将剪切片段插入源自pbsii-itr1的pxlbaciipubnlsegfp中。制得的构建体mini-piggybac_long的5’及3’端分别具有308bp及238bp的末端重复(terminalrepeat,tr)。
利用xmni剪切构建体mini-piggybac_long，以制备线状的mini-piggybac_long。
mini-piggybac_short(短式mini-piggybac)
以pcii及acli剪切mini-piggybac_long构建体，以klenow酶(nebiolabs)处理后，利用t4dna连接酶(nebiolabs)进行自我连接反应，据以制备不包含胺芐青霉素(ampicillin)抗性基因及f1复制原点的mini-piggybac_short。
利用bgli剪切mini-piggybac_short以制备线状的mini-piggybac_short。
micro-piggybac_long(长式micro-piggybac)
利用以下四对引子所组成的pcr混合物来制得短式piggybac末端重复区域(terminalrepeatdomain,trd)(即pxl-bacii中的746～8083’ltr及1426～14605’ltr)：pb-11-kpni(seqidno:5)、pb-5-正向(seqidno:6)、pb-6-反向(seqidno:7)及pb-12-saci(seqidno:8)。将包含67bp5’、40bp3’trd及swai与xhoi限制酶位置的扩增子(amplicon)，以kpni及saci克隆至pbs-skii中，以制备ppbendaatt。以xhoi将由上述pbs-cassette得到的表达基因组插入ppbendaatt的短式piggybacktrd之间，以制备micro-piggybac_long。
利用xmni剪切micro-piggybac_long，以制备线状的micro-piggybac_long。
micro-piggybac_short(短式micro-piggybac)
以acc65i及afliii剪切micro-piggybac_long，以移除胺芐青霉素抗性基因及f1复制原点。使剩余的dna片段自我连接，以制备不含胺芐青霉素抗性基因及f1复制原点micro-piggybac_short。该构建体也称为微环基因组(minicirclecassette)。
利用xmni剪切micro-piggybac_short，以制备线状的micro-piggybac_short。
minicircle-micropb-cassette
或者是，可利用mc-easy环状微环dna制备试剂盒来制备micro-piggybac_short(即微环基因组)。此种方法是以kpni、saci及xmni剪切micro-piggybac_long后，将包含micro-piggybac的左(microl)及右(micror)反向重复的kpni-saci片段(3993bp)插入pmc.bespx-mcs1的ecorv限制酶位置，以制备pmc-micropb-cassette。依照使用操作说明，以mc-easycircle环状微环dna制备试剂盒由pmc-micropb-cassette制备minicircle-micropb-cassette。制得的minicircle-micropb-cassette不包含氨苄青霉素抗性基因及f1复制原点。
辅助质粒
依据yaa-jyuhnjamesmeiret.al.(aversatile,highlyefficient,andpotentiallysaferpiggybactransposonsystemformammaliangenomemanipulations,faseb,2013:27,4429-4443)所述方法来建构辅助质粒pcmv-thyplgmh、pcmv-mycpbase、pcmv-tplgmh及pcmv-hahypbase。此公开文献的全文视为本发明内容的一部分。
转位试验
hek293细胞
将八成满的细胞种植于24孔盘中，细胞密度为每孔洞1x105个细胞。进行细胞转染时，以fugene6(roche,florence,sc)将300纳克的dna混合物转染至细胞中。各dna混合物包含100纳克的辅助质粒(即pcmv-thyplgmh、pcmv-mycpbase、pcmv-tplgmh或pcmv-hahypbase)、不同量的dna供体(即mini-piggybac_long、mini-piggybac_short、micro-piggybac_long、micro-piggybac_short、pmc-micropb-cassette或minicircle-micropb-cassette；最少的供体量为100纳克)，以及使最终dna含量达300纳克的pcdna3.1。转染后，取十五分之一的经转染的细胞至100毫米盘，再以匀霉素筛选14天。利用包含4％三聚甲醛(paraformaldehyde)的pbs固定10分钟后，以0.2％亚甲蓝(methyleneblue)染色1小时，以计数细胞群。经匀霉素筛选14天后，仅计算直径为0.5毫米的细胞群。
jurkatt细胞
将每毫升1x106个细胞培养24小时后，进行核转染。各核转染反应皆是将6微克的dna混合物转染至1x106个细胞中。各dna混合物包含2.5微克的辅助质粒(即pcmv-thyplgmh、pcmv-mycpbase、pcmv-tplgmh或pcmv-hahypbase)、不同量的dna供体(即mini-piggybac_long、mini-piggybac_short、micro-piggybac_long、micro-piggybac_short、pmc-micropb-cassette或minicircle-micropb-cassette；最少的供体量为2.0微克)，以及使最终dna含量达6微克的pcdna3.1。经核转染24小时后，将30个悬浮于50微升上述条件培养液的活细胞，以1.2毫克的匀霉素于96孔盘进行筛选。每2到3天，缓慢加入等体积的条件培养液，避免影响细胞群。各反应皆是以匀霉素对10,200个活细胞进行筛选。经匀霉素筛选6或7天后，利用光学显微镜来计算各反应的细胞群的数量，以得到其转位活性。
初代t细胞
在进行核转染前一天，以rpmi全细胞培养液(rpmicompletemedium)解冻人类初代细胞(humanprimarycell，cd8+cd45ra+)。培养至隔日后，对细胞进行核转染。各核转染反应皆是将2.2微克的dna混合物转染至悬浮于20微升的all-in-one核转染缓冲液(gf1001,genomefrontier,biosciences)的1x105个细胞中。各dna混合物包含0.8微克的辅助质粒(即pcmv-hahypbase或pcmv-thyplgmh)、不同量的供体质粒(即mini-piggybac_long、mini-piggybac_short、micro-piggybac_long或micro-piggybac_short；最大的供体量为1.4微克)，以及使最终dna含量达2.2微克的pcdna3.1。核转染24小时后，以500微升的包含刺激物(pha及每毫升50微克的il-2)及每毫升1.0毫克匀霉素的rpmi1640全细胞培养液培养经转染的细胞。经匀霉素筛选22天后，计算存活细胞数以得到转位活性。
实施例1于hek293细胞的转位活性
本实施例将分析各dna供体及辅助质粒于hek293细胞的转位活性。结果分别阐述于图1a-1c。
如图1a所示，不论共转染的dna供体为何，相较于以pcdna3.1、pcmv-tplgmh或pcmv-mycpbase进行转染的细胞，经pcmv-thyplgmh转染的细胞会形成最多的对匀霉素具有抗性的细胞群。该结果指出，thyplgmh为测试转位酶中，转位活性最高的转位酶。至于dna供体，四种测试的dna供体(即mini-piggybac_long、mini-piggybac_short、micro-piggybac_long及micro-piggybac_short)于hek293细胞中具有相似的转位活性(图1a)。令人讶异地，当dna供体是以其线状形式转染至hek293细胞时，micro-piggybac(即micro-piggybac_short或micro-piggybac_long)的转位活性会显著地高于mini-piggybac(即mini-piggybac_short或mini-piggybac_long)的转位活性(图1b)，其中micro-piggybac_short具有最高的转位活性。
进一步检测以mc-easy环状微环dna制备试剂盒所制得的微环的转位活性。图1c的结果指出，当与pcmv-thyplgmh共转染时，minicircle-micropb-cassette的活性是pmc-micropb-cassette活性的2.7倍。
整体来看，这些结果指出转位活性会随着dna供体全长或其trd的长度增加而减少；相较于其它测试的转位酶，thyplgmh具有最高的转位活性。因此，相较于其它的dna供体及辅助质粒，pcmv-thyplgmh与micro-piggybac微环(即micro-piggybac_short或minicircle-micropb-cassette)的组合于hek293细胞中能产生最高的转位功效。
实施例2于jurkatt细胞的转位活性
接着于jurkatt细胞中检测pcmv-thyplgmh及micro-piggybac微环的转位活性。结果分别阐述于图2a-2b。
如图2a所示，相较于以其它dna供体及辅助质粒共转染的细胞，由pcmv-thyplgmh及micro-piggybac_short共转染的细胞可产生显著较高量的匀霉素抗性细胞群。
与图1c呈现相似的结果，相较于其它dna供体/辅助质粒组合，pcmv-thyplgmh与minicircle-micropb-cassette的组合可产生最高的转位功效(图2b)。
实施例3于初代人类t细胞的转位活性
除了上述细胞株(即hek293细胞及jurkatt细胞)外，也利用初代人类t细胞来分析特定dna供体及辅助质粒的转位活性。
如图3所示，于经pcmv-thyplgmh及短式或长式micro-piggybac(即micro-piggybac_short或micro-piggybac_long)转染的细胞可观察到最佳的转位活性。
总结上述，本发明内容提供了一种转位子系统及方法，可用以将一外源性基因整合至一细胞(特别是一免疫细胞)的基因组中。相较于其他dna及辅助质粒的组合，pcmv-thyplgmh及micro-piggybac微环(不论是由酶剪切/连接法制备的micro-piggybac_short，或是由mc-easy环状微环dna制备试剂盒制得的minicircle-micropb-cassette)或micro-piggybac_long的组合可产生最高的转位功效。因此，本发明内容还提供了一种用以治疗不同疾病(例如免疫相关疾病)的方法，其是通过将一治疗基因有效转入有需要的个体体内，来达到治疗的目的。
虽然上文实施方式中揭露了本发明的具体实施例，本领域技术人员，当可对其进行各种更动与修饰。上文的说明书、实施例及实验数据对本发明内容作为示例性实施方式中的结构及使用方式做了完整的描述。尽管上文已描述本发明内容中各样的实施方式有一定程度的特性，或参照一或多个各别的实施方式，本领域技术人员仍能在不悖离本发明内容精神及范围情形下，对已公开的实施方式进行众多修改。
序列表
<110>吴琼媛
<120>转位子系统、试剂盒及其用途
<130>18fap0132cpt
<150>us62/267,270
<151>2015-12-14
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ileleuaspgluglnasnvalilegluglnproglyserserleuala
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