本发明可包括在生物技术领域中，并且其包括提高重组蛋白表达效率的手段和方法，特别在昆虫蛹中，特别地在粉纹夜蛾(trichoplusiani,t.ni)蛹中重组蛋白的工业化生产，包括其优化。此外，本发明还涉及包含杆状病毒的蛹本身，用杆状病毒或杆粒感染、转化、转导或转染的蛹。
现有技术
杆状病毒表达载体系统(bevs)是一种用于生产重组蛋白，例如，被用作疫苗、治疗分子或诊断试剂的蛋白的得到确认的方法。由于其过表达和快速发展的潜力，bevs是用于生产任何目的的重组蛋白的最具吸引力的选择之一。在工业上用于重组蛋白表达的使用最好的杆状病毒载体基于以草地贪夜蛾9(sf9)或21(sf21)昆虫细胞作为合适的表达宿主的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(acmnpv)，(nettleship,j.e.,assenberg,r.,diprose,j.m.,rahman-huq,n.,owens,r.j.recentadvancesintheproductionofproteinsininsectandmammaliancellsforstructuralbiology.j.struct.biol.2010,172,55–65)，以及粉纹夜蛾(t.ni)昆虫幼体作为活生物工厂(gomez-casadoe,gomez-sebastians,
最近，已描述了新的杆状病毒载体。例如，wo2012/168493和wo2012168492描述了用于在昆虫和昆虫细胞中表达重组蛋白的重组dna元件。
全世界，在将低价值基质桑树的叶子转化成高价值的基于蛋白质的产品：蚕丝的过程中每年生产了约70,000吨蚕丝。由于它们加速的代谢，昆虫是非常有效的蛋白制造者。鳞翅目例如家蚕(b.mori，桑蚕)或粉纹夜蛾(拟尺蠖(cabbagelooper))是两种在生物技术中最常使用的昆虫。在不到2周内，它们在尺寸上生长约5000倍且每只家蚕昆虫生产长于一千米的蚕丝。虽然来自丝腺的细胞可成产约80μg蛋白/细胞/天，最好的哺乳动物细胞培养系统生产仅约50pg蛋白/细胞/天。
因此，由于生产多功能化、可扩展性、自动化可能性、效率和发展速度，昆虫作为活生物工厂，构成昆虫细胞、常规发酵技术和植物衍生蛋白的有前途的替换物，并且。例如，昆虫作为活生物工厂避免了在例如昆虫细胞中用于表达蛋白质的生物反应器的必要性。由于它们效率低、昂贵、技术上的复杂性(其花费多年去构建，难于验证、需要质量的个人去它们的操作，它们很容易污染并且是不可靠的)，生物反应器是生产新的和现有的重组蛋白的技术和经济障碍。此外，它们面临有限的可扩展性的问题。
家蚕的幼虫已经被广泛地用作使用杆状病毒表达载体系统表达重组蛋白的活生物工厂(wang,dn；liu,jw；yang,gz；zhang,wj；wu,xf.2002.cloningofanti-lpsfactorcdnafromtachypleustridentatus,expressioninbombyxmorilarvaeanditsbiologicalactivityinvitro.molecularbiotechnology,21(1),1-7；wu,xf；kamei,k；sato,h；sato,s；takano,r；ichida,m；mori,h；hara,s.2001.high-levelexpressionofhumanacidicfibroblastgrowthfactorandbasicfibroblastgrowthfactorinsilkworm(bombyxmoril.)usingrecombinantbaculovirus.proteinexpressionandpurification,21(1),192-200；kulakosky,pc；hughes,pr；wood,ha.1998.n-linkedglycosylationofabaculovirus-expressedrecombinantglycoproteinininsectlarvaeandtissueculturecells.glycobiology,8(7),741-745；suzuki,t；kanaya,t；okazaki,h；ogawa,k；usami,a；watanabe,h；kadonookuda,k；yamakawa,m；sato,h；mori,h；takahashi,s；oda,k.1997.efficientproteinproductionusingabombyxmorinuclearpolyhedrosisviruslackingthecysteineproteinasegene.journalofgeneralvirology,78,3073-3080；sumathy,s；palhan,vb；gopinathan,kp.1996.expressionofhumangrowthhormoneinsilkwormlarvaethroughrecombinantbombyxmorinuclearpolyhedrosisvirus.proteinexpressionandpurification,7(3),262-268；u.reis,b.blum,b.u.vonspecht,h.domdey,j.collins,antibodyproductioninsilkwormcellsandsilkwormlarvaeinfectedwithadualrecombinantbombyxmorinuclearpolyhedrosisvirus,biotechnology(ny)10(1992)910–912)。
粉纹夜蛾的幼虫也已经被用于重组蛋白的表达(perez-martin,e.,gomez-sebastian,s.,argilaguet,j.m.,sibila,m.,fort,m.,nofrarias,m.,kurtz,s.,escribano,j.m.,segales,j.,rodriguez,f.,2010.immunityconferredbyanexperimentalvaccinebasedontherecombinantpcv2capproteinexpressedintrichoplusiani-larvae.vaccine28(11),2340–2349)；gomez-casadoe,gomez-sebastians,
在桑蚕中，比较研究表明，对于大多数蛋白质，在幼虫中而不是蛹中获得最高的表达量(akihirousamietal(akihirousami,seijiishiyama,chiakienomoto,hironobuokazaki,keikohiguchi,mashahiroikeda,takeshiyamamoto,mutsumisugai,yukikoishikawa,yumikohosaka,teruyukikoyama,yonekotobita,syokoebihara,toshikomochizuki,yoshimiasanoandhidekazunagaya,comparisonofrecombinantproteinexpressioninabaculovirussystemininsectcells(sf9)andsilkworm,j.biochem.2011；149(2):219–227；chazarras,aznar-cervantess,sánchez-del-campol,cabezas-herreraj,xiaofengw,cenisjl,rodríguez-lópezjn,purificationandkineticpropertiesofhumanrecombinantdihydrofolatereductaseproducedinbombyxmorichrysalides,applbiochembiotechnol.2010nov；162(7):1834‐46)。另外，已经描述了在桑蚕中蛹对杆状病毒感染的易感性的下降(journalofgeneralvirology(1992),73,3195-320)。此外，在幼虫中，杆状病毒的感染通常是口服进行的，而不是通过接种(注射)来进行规模生产。蛹不能被口服感染，所以它们必须手动注射，其是繁琐的且耗时的。此外，桑蚕蛹被厚茧覆盖，在病毒的接种发生之前必须(手动地)除去厚茧，这通常是乏味的过程。
连同在桑蚕蛹中一般较低的蛋白表达产量以及在其操作中的困难，导致通常偏好使用幼虫进行重组蛋白的生产。
在其他系统中能够发现类似的缺点，比如刻克罗普斯蚕蛾蛹。在刻克罗普斯蚕蛾蛹中某种蛋白的表达低于在粉纹夜蛾幼虫中的表达(hellers,m.andsteiner,h.；insectbiochem.molec.biol.,vol22,bo.1,pp.35-39,1992)。此外，刻克罗普斯蚕蛾飞蛾难于饲养，是严格的一化性的(它们每年具有一代)，它们每周期具有十分少量的卵并且它们具有高密度茧(在病毒的接种发生之前必须(手动地)去除厚茧，这通常是乏味的过程)。所有这些缺点使刻克罗普斯蚕蛾蛹对于重组蛋白表达成为一个差的系统，特别是用于重组蛋白的低效率、可扩展性以及自动化系统。
为了使用bevs在昆虫中表达重组蛋白，特别是使用bevs在昆虫中工业化表达重组蛋白，需要更高效和容易地自动化(扩大规模)系统。
在深入研究之后，本发明的发明人已找到了针对上述问题的解决方案，也就是属于鳞翅目的蛹中的蛋白表达系统，更优选地属于粉纹夜蛾种，其在幼虫中表达更高效并且此外允许几乎完全的自动化(扩大规模)，其增加了效率并降低了与重组蛋白表达相关的成本，特别地在工业规模上。
因此，本发明涉及优选地属于鳞翅目，更优选地属于粉纹夜蛾种的蛹(蝶蛹)与衍生自苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(acmnpv)的杆状病毒载体相结合的使用以生产用于诊断、疫苗和治疗性治疗的重组蛋白。来自粉纹夜蛾种的蛹(蝶蛹)用于重组蛋白表达，特别是来自粉纹夜蛾种的蛹(蝶蛹)用于重组蛋白表达的工业用途尚未报道。
发明概述
本发明提供了一种包含来源于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(acmnpv)的重组杆状病毒和/或转移载体/杆粒的蛹。
此外，本发明提供了一种蛹，其包含允许在杆状病毒感染期间获得高于内源水平的用作转录调节因子的表达高于内源水平的蛋白ie-1、ie-0和/或其片段的核酸序列以及可操作地连接于适合于驱动重组蛋白的表达的任何启动子的重组同源区(hr)。
本发明还涉及本发明的蛹用于重组蛋白的表达的用途。
进一步，本发明提供了一种用于生产至少一种重组蛋白的方法，包括如下步骤：
(a)提供蛹；
(b)用来源于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(acmnpv)的重组杆状病毒接种步骤(a)的蛹；
(c)将步骤(b)的接种的孵育足以使至少一种重组蛋白表达的一段时间；
(d)获取包含至少一种重组杆状蛋白的蛹；
(e)任选地，收获至少一种重组蛋白；以及
(f)任选地，纯化至少一种重组蛋白。
此外，本文提供了一种能够自动化以减少用于生产属于鳞翅目的无丝蛹的操作的方法，包括如下步骤：
(a)提供包含于蚕茧中的蛹；
(b)优选地，通过特别地设计的装置，用次氯酸盐溶液，优选地，次氯酸钠，处理包含于蚕茧中的蛹；以及
(c)获取无丝(以及，任选地，外部消毒)的蛹。
一种用于生产重组杆状病毒的方法，包括如下步骤：
(a)提供蛹；
(b)用适合于生产来源于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(acmnpv)的重组杆状病毒的转移载体/杆粒转染步骤(a)的蛹；
(c)将步骤(b)的接种蛹孵育足以使重组杆状病毒产生的一段时间；
(d)获取包括重组杆状病毒的蛹；
(e)任选地，收获重组杆状病毒；以及
(f)任选地，纯化重组杆状病毒。
本发明还涉及包括精密泵、移动机械臂和适合于将液体注射入属于鳞翅目，优选地属于粉纹夜蛾(trichoplusia)属、尺蠖(rachiplusia)属、夜蛾(spodoptera)属、实夜蛾(heliothis)属、烟草天蛾(manduca)属、棉铃虫(helicoverpa)属、黑色女巫蛾(ascalapha)属或眉纹天蚕蛾(samia)属，更优选地属于粉纹夜蛾(trichoplusia)属、尺蠖(rachiplusia)属、夜蛾(spodoptera)属、实夜蛾(heliothis)属或棉铃虫(helicoverpa)属，甚至更优选地属于粉纹夜蛾(trichoplusiani)种、尺蠖(rachiplusianu)种、草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)种、烟芽夜蛾(heliothisvirescens)种、棉铃虫(helicoverpaarmigera)种、谷实夜蛾(helicoverpazea)种、烟草天蛾(manducasexta)种、黑色女巫蛾(ascalaphaodorata)种或眉纹天蚕蛾(samiacynthia)种的蛹中的(可移动的)针的装置。
附图的简要描述
图1：大量的一次性使用的粉纹夜蛾昆虫饲养舱。在昆虫饲养舱中生长的第五龄期幼虫。
图2：由家蚕和粉纹夜蛾鳞翅目形成的茧(图像的左部)与无丝的蛹(图像的右部)的比较。
图3：用于从粉纹夜蛾茧中除去丝的半自动装置。包含两个容器以及将一次性使用的饲养舱配置在其中的机械臂的机器示意图。第一容器含有次氯酸以及通过含有茧的饲养舱投射液体的系统(它有助于更有效地溶解围绕蛹的丝)。第二容器是洗涤蛹，并将水喷洒在碟蛹上。在该容器的顶部是分配空气以干燥蛹的系统。在过程的结束时，蛹没有丝且准备用于感染或冷藏储存直到使用。
图4：用于生产绿色荧光蛋白(gfp)的杆状病毒表达盒。a)使用多角体蛋白启动子(例如，seqidno.:23)的常规杆状病毒表达盒。b)tb表达盒包含编码在多角体蛋白启动子的控制下表达的反式激活因子ie1和ie0的ac-ie-01cdna；增强子序列hr1和驱动gfp表达的嵌合启动子p6.9-p10(例如,seqidno.:17以及编码gfp的核酸序列，例如，seqidno.:38)。
图5：通过注射重组杆状病毒的机械手自动接种粉纹夜蛾蛹。a)接种机械手的示意图。b)配置昆虫蛹的小窝的矩阵示意图。这些包含蛹的小窝具有穿孔的顶部并且可堆叠以促进蛹向生产实验室运输，并与接种机械手兼容。在同一面板中包含蛹且具有顶部的小窝的真实照片图像。c)用与机械臂相连的针的蛹接种的示意图。
图6：通过使用常规杆状病毒tb(-)(多角体蛋白启动子，例如，seqidno.:23)或tb-修饰的杆状病毒tb(+)的感染的蛹中gfp蛋白的表达产量的对比分析。a)从用tb(-)或tb(+)杆状病毒感染的蛹中提取的sds-page分离蛋白的考马斯蓝染色。(-)相当于来自未感染的对照蛹的提取物。b每种杆状病毒感染的蛹中获得的gfp产物产量的定量分析，以mg/g蛹生物量表示。
图7：用于生产来自猪圆环病毒2型的衣壳蛋白(cap)(例如，seqidno.:26)或来自流感病毒的凝血素(ha)(例如，seqidno.:30)的杆状病毒表达盒。a)使用多角体蛋白启动子的常规杆状病毒表达盒。b)tb表达盒包含编码在多角体蛋白启动子的控制下表达的反式激活因子ie1和ie0的ac-ie-01cdna；增强子序列hr1和驱动上面提到的蛋白表达的嵌合启动子p6.9-p10。
图8：通过使用常规杆状病毒tb(-)(多角体蛋白启动子，seqidno.:10，seqidno.:28)或tb-修饰的杆状病毒tb(+)(例如，seqidno.:27或29)的感染的蛹中cap蛋白(例如，seqidno.:26)的表达量的对比分析。a)从用tb(-)或tb(+)杆状病毒感染的蛹中提取的sds-page分离蛋白的考马斯蓝染色。(-)相当于来自未感染的对照蛹的提取物。b)每种杆状病毒感染的蛹中获得的cap产物产量的定量分析，以mg/g蛹生物量表示。
图9：通过使用常规杆状病毒tb(-)(多角体蛋白启动子，seqidno.:10)或tb-修饰的杆状病毒tb(+)(例如，seqidno.:31)的感染的蛹中ha蛋白(例如，seqidno.:30)的表达量的对比分析。a)从用tb(-)或tb(+)杆状病毒感染的蛹中提取的sds-page分离蛋白的考马斯蓝染色。(-)相当于来自未感染的对照蛹的提取物。b)每种杆状病毒感染的蛹中获得的ha产物产量的定量分析，以mg/g蛹生物量表示。
图10：用于生产gfp、cap(seqidno.:26)、ha(seqidno.:30)和来自在粉纹夜蛾幼虫和蛹中兔出血症病毒(rhdv，seqidno.:32或33)的vp60蛋白的杆状病毒表达盒。tb表达盒的示意图包括编码在多角体蛋白启动子的控制下表达的反式激活因子ie1和ie0的ac-ie-01cdna的；增强子序列hr1和驱动上面提到的蛋白表达的嵌合启动子p6.9-p10。
图11：在感染的蛹和幼虫中gfp蛋白的表达产量的对比分析。a)从用tb(+)感染的蛹(p)或感染的幼虫(l)中提取的sds-page分离蛋白的考马斯蓝染色。(-)相当于来自未感染的对照蛹的提取物。b)从感染的蛹和幼虫中获得的gfp产物产量的定量分析，mg/g昆虫生物量表示。
图12：在感染的蛹和幼虫中cap蛋白的表达产量的对比分析。a)从用tb(+)感染的蛹(p)或感染的幼虫(l)的蛹中提取的sds-page分离蛋白的考马斯蓝染色。(-)相当于来自未感染的对照蛹的提取物。b)从感染的蛹或幼虫获得的cap产物产量的定量分析，以mg/g昆虫生物量表示。
图13：在感染的蛹和幼虫中ha蛋白的表达产量的对比分析。a)从用tb(+)感染的蛹(p)或感染的幼虫(l)中提取的sds-page分离蛋白的考马斯蓝染色。(-)相当于来自未感染的对照蛹的提取物。b)从感染的蛹和幼虫中获得的ha产物产量的定量分析，以mg/g昆虫生物量表示。
图14：在感染的蛹和幼虫中rhdv衣壳vp60蛋白(g1和rhdvb)的表达产量的对比分析。a)从用tb(+)感染的蛹(p)或感染的幼虫(l)中提取的sds-page分离蛋白的考马斯蓝染色。(-)相当于来自未感染的对照蛹的提取物。b)从用tb(+)杆状病毒感染的蛹或幼虫中获得的rhdv衣壳蛋白产物产量的定量分析，以mg/g昆虫生物量(l)表示。(-)相当于来自未感染的对照蛹的提取物。b)从感染的蛹和幼虫中获得的rhdv衣壳蛋白产物产量的定量分析，以mg/g昆虫生物量表示。
图15：用表达来自rhdvg1和rhdvb的vp60蛋白的tb(+)杆状病毒感染粉纹夜蛾蛹之后形成的vlps。在每种杆状病毒的最佳生产时间从感染的蛹提取提取物进行vlp纯化。通过使用负染色的电子显微镜观察样本。图片显示了在两个放大率下的vlps。用两种杆状病毒获得的vlps呈现了相同的大小和形状。显微照片代表分析的区域。
图16：在没有昆虫细胞培养物下从感染的蛹中获取病毒接种体的流程的原理图实例。
图17：以三个步骤从感染的蛹获取纯化的重组蛋白的上游和下游处理流程的原理图实例。a)生产粉纹夜蛾蝶蛹，它们的操作以及可选地运往最终目的地(例如，制药公司)进行重组蛋白生产。b)存储蛹，使用本发明的装置机械的接种重组杆状病毒、孵育和冷冻昆虫生物质，其能够在原位处理之前存储几个月，或能够容易地运往其他地方进行下游处理。c)通过冷冻生物质的常规手段(包括均质化、切向流过滤和蛋白纯化)进行下游处理。
图18：通过在昆虫细胞和昆虫蛹中使用常规杆状病毒和topbac改良的杆状病毒，在昆虫细胞中猪圆环病毒cap蛋白表达产量的比较。
图19：从感染的蛹获取病毒接种物的流程的原理图实例。
图20：从感染的蛹获取纯化的重组蛋白的下游处理流程的原理图实例。
发明的详细描述
定义
如本文中所使用的，“蛹”指经历转化的一些昆虫的生命阶段。蛹阶段发现于经历完全变态的昆虫(全变态昆虫)中。这些昆虫经历四个生命阶段：胚胎、幼虫、蛹和成虫。蝴蝶的蛹还称作蝶蛹。昆虫可用茧覆盖它们保护蛹，茧是保护许多昆虫的蛹的丝纺成的套管。
如本文中所使用的，“杆状病毒”指用于无脊椎动物的感染性病毒家族，主要感染昆虫和节肢动物。“重组杆状病毒”通过诸如同源重组或转座进一步引入重组dna。重组杆状病毒可来源于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(acmnpv)。
如本文中所使用的，“表达盒”包含参与某基因表达的重组dna元件，如基因本身和/或控制该基因的表达的元件(例如启动子)。例如，在本发明中有用的表达盒包含如下重组dna元件：
1.允许表达重组蛋白的核酸序列，例如本说明书下面描述的重组蛋白，以及优选地控制它的表达的核酸序列(至少一个启动子)；以及
2.允许在杆状病毒感染昆虫细胞或昆虫期间得到的所述调节因子的正常，即，内源的水平以上表达的如ie-1和ie-0的杆状病毒转录调节因子表达的核酸序列。在一些实施方式中，表达盒进一步包含增强子同源区(hr)，例如hr1，可操作地连接到编码重组蛋白的所述序列的启动子。形成本发明的表达盒的一部分的重组dna元件可以存在于单核酸分子中。形成表达盒的一部分的重组dna元件可以存在于不同的核酸分子中。优选地，不同的核酸分子存在于相同的细胞中。
如本文中所使用的，“重组dna”指通过组合或插入一条或更多条dna链而设计的人造dna的形式，从而组合通常不会一起存在的dna。
如本文中所使用的，“重组dna元件”指在重组dna中的功能元件，如启动子、增强子或基因。
如本文中所使用的，“转录调节因子”指具有通过例如结合到增强子或阻遏物区和/或募集参与转录的进一步的蛋白以调节特定基因的转录的能力的调节蛋白。ie-1及其剪接变体ie-0是在杆状病毒感染期间内源性表达的转录调节因子。蛋白ie-1、ie-0和/或其片段的表达水平可通过本领域技术人员常规已知的方法(如定量pcr以及蛋白质印迹分析)在mrna和蛋白水平测定。
根据本发明，可重组地表达ie-1、ie-0和/或其片段以在杆状病毒感染期间将这些蛋白的总水平提高到高于内源水平。例如，这能够通过引入内源性基因的更多拷贝或操作内源性基因的启动子的表达来实现。内源性基因的进一步拷贝能在如polh或pb29的合适的启动子的控制下作为转基因被引入。
ie-1、ie-0及其片段可由seqidno:1(也被称为ac-ie-01)至seqidno:5的核酸编码。seqidno:1是编码ie-1和ie-0的ac-ie-01cdna，seqidno:2是编码ie-1的编码序列(cds)以及seqidno:3是编码ie-0的cds。seqidno:4和5是保持催化转录调节活性的ie-1和ie-0各自的n-端结构域的cds。由seqidno:2-5编码的蛋白分别由seqidno:6-9表示。
本发明中提及的核苷酸和氨基酸序列应当与其序列同一性或相似性的程度分别如使用具有默认参数的emboss针确定(http://www.ebi.ac.uk/tools/psa/emboss_needle/)的其他核酸或氨基酸序列相区别。生成这样的突变体的方法包括随机或定点诱变、位点饱和诱变、基于pcr的片段组装、dna改组、体外或体内同源重组，以及基因合成的方法。
如本文中所使用的，“变体”是其核酸或氨基酸序列与亲本的核酸或氨基酸序列的一个或多个位置不同的核酸或氨基酸，由此差异可能是核酸或氨基酸残基的添加、缺失和/或替换。
如本文中所使用的，“同源区”(hr)由在它们的中心附近带有不完全的30-bp回文结构的约70-bp的重复单元组成。例如，在acmnpv基因组中的同源区在八个位置重复，每侧重复2至8个。同源区已被认为是转录增强子和杆状病毒dna复制的起源。
如本文中所使用的，“增强子区”指通过转录调节因子的结合增加相关基因的转录水平的控制序列。
如本文中所使用的，“重组蛋白”指起源于重组dna的蛋白。这样的蛋白能够为了人类或动物的利益被使用，并且可具有工业、商业或治疗用途。
如本文中所使用的，“可操作地连接”指两个核酸序列，其以例如转录调控的方式影响另一个的方式连接。
如本文中所使用的，“启动子”指rna聚合酶能够结合以启动转录的dna序列。该序列可进一步含有如转录因子的调节转录的各种各样蛋白的结合位点。启动子序列可由紧密地定位于dna序列中并且可由接头或间隔区分开的不同的启动子片段(不同的或相同的片段)组成。这样的启动子称作嵌合启动子。
如本文中所使用的，“转移载体”是允许将遗传信息插入杆状病毒基因组的载体(也就是用作携带遗传物质的载具的dna分子)。
如本文中所使用的，“杆粒”指当转染入细胞或昆虫中时足以生成杆状病毒的含有dna序列的质粒构建体。
如本文中所使用的，“克隆载体”指适合于克隆的任何载体，其通常包含限制性位点、用于细菌增殖的复制起点以及选择标记的存在。
可用于本发明的内容中的克隆载体优选地除了(i)用于表达高于内源水平的蛋白ie-1、ie-0和/或其片段的序列之外，还包含(ii)重组同源区(hr)连接于(iii)适合于驱动重组蛋白表达的启动子。例如，克隆载体可包含编码重组蛋白的核酸序列(还被称作“供体载体”，也就是包含表达盒的载体)。或者，克隆载体缺少这样的序列。
如本文中所使用的，“疫苗”可被定义为优选地包含向特定疾病提供主动获得性免疫的生物制剂。
如本文中所使用的，术语“约”意思是指示值±其值的1％，或者术语“约”意思是指示值±其值的2％，或者术语“约”意思是指示值±其值的5％，术语“约”意思是指示值±其值的10％，或者术语“约”意思是指示值±其值的20％，或者术语“约”意思是指示值±其值的30％；优选地术语“约”意思是精确的指示值(±0％)。
详细说明
本发明提供了一种包含重组杆状病毒和/或转移载体/杆粒的蛹。本发明出人意料地显示了将重组杆状病毒引入昆虫蛹，并且特别地导致杆状病毒转录调节因子高于内源水平表达的序列以及优选地引入增强子同源区(hr)、启动子或启动子的组合，能够将重组蛋白的生产提高到前所未有的水平。这表明该系统用于体内表达重组蛋白，尤其是体内工业化生产重组蛋白的有用性。
本发明的蛹
本发明提供了一种包含重组杆状病毒和/或转移载体和/或杆粒的蛹。重组杆状病毒和/或转移载体和/或杆粒优选地来源于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(acmnpv)。优选地，所述蛹属于鳞翅目，优选地属于粉纹夜蛾(trichoplusia)属、尺蠖(rachiplusia)属、夜蛾(spodoptera)属、实夜蛾(heliothis)属、烟草天蛾(manduca)属、棉铃虫(helicoverpa)属、黑色女巫蛾(ascalapha)属或眉纹天蚕蛾(samia)属，优选地属于粉纹夜蛾(trichoplusia)属、尺蠖(rachiplusia)属、夜蛾(spodoptera)属、实夜蛾(heliothis)属或棉铃虫(helicoverpa)属，优选地属于粉纹夜蛾(trichoplusiani)种、尺蠖(rachiplusianu)种、草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)种、烟芽夜蛾(heliothisvirescens)种、棉铃虫(helicoverpaarmigera)种、谷实夜蛾(helicoverpazea)种、烟草天蛾(manducasexta)种、黑色女巫蛾(ascalaphaodorata)种或眉纹天蚕蛾(samiacynthia)种。甚至更优选地，蛹属于粉纹夜蛾种。在优选的实施方式中，本发明的蛹不属于家蚕种。在优选的实施方式中，本发明的蛹不属于刻克罗普斯蚕蛾种。
在优选的实施方式中，本发明的蛹是属于粉纹夜蛾属，优选地属于粉纹夜蛾种，其包含来源于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(acmnpv)的重组杆状病毒和/或转移载体/杆粒。
本发明的蛹，特别地粉纹夜蛾的蛹，为重组蛋白的表达提供几个优势，特别地在自动化或可扩展的过程中。例如，一对粉纹夜蛾的飞蛾夫妇可在每周期产约1.000只卵。此外，由粉纹夜蛾蛹产生的茧不像覆盖其他种(比如，例如，家蚕或刻克罗普斯蚕蛾)的蛹的茧那么厚，这使得粉纹夜蛾的蛹特别地适合它们在自动化和可拓展的生产过程(重组蛋白的工业生产)中使用。因此，蛹优选地被来源于苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(acmnpv)的重组杆状病毒和/或转移载体和/或杆粒感染的粉纹夜蛾蛹提供了用于重组蛋白生产的高效的、可扩展的并且容易自动化的系统。该系统进一步的优势是它的高生产率(比生物反应器高产20倍)技术简单、容易实施和验证、成本降低(相对于生物反应器的使用固定投资减少>90％)、商品成本较低、短的发展时间(杆状病毒系统、蛋白难于生产的高效率，以及生产的产品的高质量和安全性。
本申请的发明人出人意料地发现了在蛹中，特别地属于鳞翅目，优选地属于粉纹夜蛾(trichoplusia)属、尺蠖(rachiplusia)属、夜蛾(spodoptera)属、实夜蛾(heliothis)属、烟草天蛾(manduca)属、棉铃虫(helicoverpa)属、黑色女巫蛾(ascalapha)属或眉纹天蚕蛾(samia)属，优选地属于粉纹夜蛾(trichoplusia)属、尺蠖(rachiplusia)属、夜蛾(spodoptera)属、实夜蛾(heliothis)属或棉铃虫(helicoverpa)属，优选地属于粉纹夜蛾(trichoplusiani)种、尺蠖(rachiplusianu)种、草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)种、烟芽夜蛾(heliothisvirescens)种、棉铃虫(helicoverpaarmigera)种、谷实夜蛾(helicoverpazea)种、烟草天蛾(manducasexta)种、黑色女巫蛾(ascalaphaodorata)种或眉纹天蚕蛾(samiacynthia)种的蛹中的重组蛋白的表达与幼虫中的表达相当甚至更高。。
公布为wo2012/168492的专利申请公开了重组杆状病毒和转移载体和杆粒，其可包含在本发明的蛹中。
根据本发明的包含在蛹中的重组杆状病毒和/或转移载体和/或杆粒可优选地包括重组dna。例如，根据本发明的包含在蛹中的重组杆状病毒和/或转移载体和/或杆粒包含编码重组蛋白的核酸序列，其中重组蛋白优选地选自包含亚单位单体疫苗、亚单位多聚体疫苗、类病毒颗粒、治疗性蛋白、抗体、酶、细胞因子、凝血因子、抗凝血剂、受体、激素、诊断蛋白试剂以及绿色荧光蛋白(gfp)的组，和/或其中重组蛋白优选地不是由蛹内源性产生的蛋白，如下所述。例如，根据本发明的包含在蛹中的重组杆状病毒和/或转移载体和/或杆粒包含允许在杆状病毒感染期间获得高于内源水平的用作转录调节因子的表达高于内源水平的蛋白ie-1、ie-0和/或其片段的核酸序列(例如，可以通过在重组杆状病毒中存在允许表达蛋白质ie-1，ie-0和/或其片段的核酸序列的额外拷贝来获得高于内源水平的表达)。优选地，根据本发明的包含在蛹中的重组杆状病毒和/或转移载体和/或杆粒还包含可操作地连接于适合于驱动重组蛋白的表达的任何启动子的重组同源区(hr)。
本发明的可包含于蛹中的转移载体优选地除了(i)用于表达高于内源性水平的蛋白ie-1、ie-0和/或其片段的序列之外，还包含(ii)重组同源区(hr)连接于(iii)适合于驱动重组蛋白表达的启动子。在一个优选的方面，转移载体包含编码所述重组蛋白的核酸序列，然而在另一个优选的实施方式中，转移载体没有这样的序列。在一个优选的实施方式中，转移载体是杆粒。
转移载体和/或杆粒可来源于任何商业上可获得的杆状病毒表达系统
本发明的蛹(其特别地属于鳞翅目，优选地属于粉纹夜蛾(trichoplusia)属、尺蠖(rachiplusia)属、夜蛾(spodoptera)属、实夜蛾(heliothis)属、烟草天蛾(manduca)属、棉铃虫(helicoverpa)属、黑色女巫蛾(ascalapha)属或眉纹天蚕蛾(samia)属，优选地属于粉纹夜蛾(trichoplusia)属、尺蠖(rachiplusia)属、夜蛾(spodoptera)属、实夜蛾(heliothis)属或棉铃虫(helicoverpa)属，更优选地属于粉纹夜蛾(trichoplusiani)种、尺蠖(rachiplusianu)种、草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)种、烟芽夜蛾(heliothisvirescens)种、棉铃虫(helicoverpaarmigera)种、谷实夜蛾(helicoverpazea)种、烟草天蛾(manducasexta)种、黑色女巫蛾(ascalaphaodorata)种或眉纹天蚕蛾(samiacynthia)种，或对acmnpv感染敏感的任何其他的鳞翅目，甚至更优选地属于粉纹夜蛾属和粉纹夜蛾种)可包含允许在杆状病毒感染期间获得高于内源水平的用作转录调节因子的表达高于内源水平的蛋白ie-1、ie-0和/或其片段的核酸序列。优选地通过重组杆状病毒将以上描述的重组dna元件导入蛹中。
根据本发明允许在杆状病毒感染期间获得高于内源水平的用作转录调节因子的表达高于内源水平的蛋白ie-1、ie-0和/或其片段的核酸序列优选地选自包含如下组成的组：
(a)包含在seqidno:1-5中任一条所示的核酸序列的核酸；
(b)具有与seqidno:1-5中任一条所示的核酸序列至少70％，优选地至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％以及最优选地至少95％序列一致性并且编码用作在重组杆状病毒中的转录调节因子的蛋白的核酸序列；
(c)编码包含在seqidno:6-9中任一条所示的氨基酸序列的氨基酸的核酸序列；以及
(d)具有与seqidno:6-9中任一条所示的氨基酸序列至少70％，优选地至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％以及最优选地至少95％序列相似性性并且能够用作在重组杆状病毒中的转录调节因子的氨基酸序列的核酸序列。
seqidno:1-5的变异体的序列与seqidno:1-5的序列至少70％，优选地至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％以及最优选地至少95％一致。
seqidno:6-9的变异体的序列与seqidno:6-9的序列至少70％，优选地至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％以及最优选地至少95％相似。
本发明的蛹可进一步包括核酸序列和/或重组杆状病毒和/或转移载体和/或杆粒，其进一步包含可操作地连接于适合于驱动重组蛋白的表达的任何启动子的重组同源区(hr)。
重组同源区(hr)优选地是由seqidno:21(hr1)所示的序列。
驱动所述重组蛋白的表达的启动子优选地选自由如下的核酸组成的组：
(a)包含在seqidno:10-14中任一条所示的，优选地在seqidno:11-13中任一条所示的核酸序列的核酸；以及
(b)能够用作重组杆状病毒中的启动子且具有与seqidno:10-14中任一条所示的，优选地与seqidno:11-13中任一条所示的核酸序列，至少70％，优选地至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％以及最优选地至少95％序列一致性的核酸序列。
在优选的实施方式中，包含重组启动子、编码转录调节因子的序列和增强子区的组合的核酸序列(包含在本发明的蛹中的核酸序列)选自由seqidnos:15-20组成的组。本发明的重组启动子、编码转录调节因子的序列和增强子区不需要形成单分子部分，反而，只要他们可操作地相连，即包含在蛹的同一细胞中，这些序列可形成不同分子的部分。
本发明的蛹和/或重组杆状病毒和/或转移载体和/或杆粒可进一步包括编码重组蛋白的核酸序列。该核酸序列优选地可操作地连接于允许表达高于内源水平的蛋白ie-1、ie-0和/或其片段的核酸序列以及优选地重组同源区(hr)，已经在上面描述了这些序列。
优选地，重组蛋白选自由亚单位单体疫苗、亚单位多聚体疫苗、类病毒颗粒、治疗性蛋白、抗体、酶、细胞因子、凝血因子、抗凝血剂、受体、激素、诊断蛋白试剂以及绿色荧光蛋白(gfp)组成的组。
在优选的实施方式中，重组蛋白是类病毒颗粒蛋白，其优选选自由如下组成的组：
(a)猪圆环病毒衣壳蛋白，优选地来自2型猪圆环病毒(例如，seqidno.:26)，
(b)口蹄疫病毒vp1、vp3或vp0蛋白，
(c)犬细小病毒vp1和vp2蛋白，
(d)猪细小病毒vp1和vp2蛋白，
(e)人诺瓦克病毒(基因组i或ii)衣壳蛋白，
(f)杯状病毒衣壳蛋白，
(g)人乳头瘤病毒l1蛋白，优选地来自人乳头瘤病毒16，
(h)戊型肝炎e2蛋白，
(i)传染性法氏囊病病毒vp1、vp2和vp3蛋白，
(j)星状病毒orf2编码的蛋白，
(k)流感病毒ha(例如，seqidno.:30)、na和m1蛋白，
(l)乙型肝炎核心和表面抗原，
(m)兔杯状病毒vp60蛋白，优选地来自兔出血症病毒rhdvb和rhdvg1(例如，seqidnos.:32和33)。
(n)人细小病毒vp1和vp2蛋白
例如，重组蛋白可能是：
·猪圆环病毒衣壳蛋白，优选地来自2型猪圆环病毒，其例如由seqidno:26的氨基酸序列代表的或由seqidno:25的核酸序列所编码的。
·口蹄疫病毒(fmdv)vp1、vp3和vp0蛋白，例如，其序列由如下序列指示或者能够衍生自如下序列：
-fmdv血清型o全基因组：genbankjx570650.1
-fmdv血清型a全基因组：genbankhq832592.1
-fmdv血清型c全基因组：genbankay593810.1
-fmdv血清型sat1全基因组：genbankay593846.1
-fmdv血清型sat2全基因组：genbankjx014256.1
-fmdv血清型asia1全基因组：genbankhq631363.1
·犬细小病毒vp1和vp2蛋白，例如，其序列由如下序列指示或者能够衍生自如下序列：
-用于衣壳蛋白vp1的犬细小病毒vp1基因，部分cds，菌株:1887/f/3。genbank：ab437434.1
-用于衣壳蛋白vp1的犬细小病毒vp1基因，部分cds，菌株:1887/m/2。genbank：ab437433.1。
-犬细小病毒vp2基因,完整cds，菌株:hni-2-13。genbank：ab120724.1。
-犬细小病毒vp2基因,完整cds，菌株:hni-3-4。genbank：ab120725.1。
-犬细小病毒vp2基因,完整cds，菌株:hni-3-11。genbank：ab120726.1。
-犬细小病毒vp2基因,完整cds，菌株:hni-4-1。genbank：ab120727.1。
-犬细小病毒vp2基因,完整cds，菌株:hni-1-18。genbank：ab120728.1。
-犬细小病毒vp2蛋白(vp2)基因,完整cds。genbank：dq354068.1。
-犬细小病毒vp2基因,完整cds，菌株:hcm-6。genbank：ab120720.1。
-犬细小病毒分离株台中vp2基因,完整cds。genbank：ay869724.1。
-犬细小病毒vp2基因,完整cds，菌株:hcm-8。genbank：ab120721.1。
-犬细小病毒1型蛋白vp1和vp2：genbankab518883.1
-犬细小病毒2a型vp1和vp2。genbank：m24003.1
-犬细小病毒2b型vp2：genbankfj005265.1
-犬细小病毒2c型vp2：genbankfj005248.1
·猪细小病毒vp1和vp2蛋白，例如，其序列由如下序列指示或者能够衍生自如下序列：
-猪细小病毒693a株。genbank：jn400519.1
-猪细小病毒8a株。genbank：jn400517.1
·人细小病毒vp1和vp2蛋白，例如，其序列由如下序列指示或者能够衍生自如下序列：
-人细小病毒b19vp1完整的cds。genbank：af264149.1
-人细小病毒b19分离株vn115ns1(ns1)，7.5kda蛋白(ns1)，vp1(vp1)，9.5kda蛋白(vp1)，以及vp2(vp2)基因，完整的cds。genbank：dq357065.1
-b19病毒分离株fobevp1(vp1)以及vp2(vp2)基因，完整的cds。genbank：ay768535.1
-b19病毒分离株br543ns1(ns1)、vp1(vp1)和vp2(vp2)基因，完整的cds。genbank：ay647977.1
-人细小病毒4分离株ves065csfns1、vp1和vp2基因，完整的cds。genbank：hq593532.1
-人细小病毒4分离株ves085csfns1基因，部分cds；以及vp1和vp2基因，完整的cds。genbank：hq593531.1
-人细小病毒b19分离株bb-2ns1、vp1和vp2基因，完整的cds。genbank：kf724387.1
·人诺如病毒(基因组i或ii)衣壳蛋白，例如，其序列由如下序列指示或者能够衍生自如下序列：
-诺沃克病毒：genbankm87661，np056821
-南安普顿病毒：genbankl07418
-墨西哥病毒：genbanku22498
-濑户病毒：genbankab031013
-千叶病毒：genbankab042808
-洛兹达雷病毒：genbankx86557
-雪山病毒：genbanku70059
-夏威夷病毒：genbanku07611
·兔出血症病毒vp60蛋白，例如，其序列由如下序列指示或者能够衍生自如下序列：
-rhdvast/89全基因组：genbank：z49271.2
-rhdvn11全基因组：genbank：km878681.1
-rhdvcbval16全基因组；genbank：km979445.1
-seqidno.:32
-seqidno.:33
·人乳头瘤病毒l1蛋白，例如，其序列由如下序列指示或者能够衍生自如下序列：
-hpv6:genbank：jn252323.1
-hpv11:genbank：jq773411.1
-hpv16:genbankdq155283.1
-hpv18:genbankfj528600.1
·戊型肝炎e2蛋白，例如，其序列由如下序列指示或者能够衍生自如下序列：
-戊型肝炎病毒，完整基因组ncbi参考序列：nc_001434.1
-猪戊型肝炎病毒分离株itfae11衣壳蛋白基因。genbank：jn861806.1
·传染性法氏囊病病毒vp1、vp2和vp3蛋白，例如，其序列由如下序列指示或者能够衍生自如下序列：
-传染性法氏囊病病毒vp1(vp1)基因，完整cds。genbank：ay099457.1
-传染性法氏囊病病毒分离株ptvp1基因，完整cds。genbank：dq679814.1
-传染性法氏囊病病毒分离株oe/g2vp1基因，完整cds。genbank：dq679813.1
-传染性法氏囊病病毒分离株oa/g1vp1基因，完整cds。genbank：dq679812.1
-传染性法氏囊病病毒分离株holvp1基因，完整cds。genbank：dq679811.1
-传染性法氏囊病病毒tl2004株vp1基因，完整cds。genbank：dq118374.1
-传染性法氏囊病病毒分离株ca-k785vp1基因，完整cds。genbank：jf907705.1
-传染性法氏囊病病毒分离株d495vp1基因，完整cds。genbank：jf907704.1
-传染性法氏囊病病毒a-bh83株vp1mrna，完整cds。genbank：eu544149.1
-传染性法氏囊病病毒cro-pa/98株vp1基因，完整cds。genbank：eu184690.1
-传染性法氏囊病病毒vp2mrna，完整cds。genbank：ay321509.1
-传染性法氏囊病病毒vp2、vp3、vp4基因，完整cds。genbank：m97346.1
-传染性法氏囊病病毒vp2基因，完整cds。genbank：af508177.1
·杯状病毒衣壳蛋白，例如，其序列由如下序列指示或者能够衍生自如下序列：
-猫杯状病毒衣壳蛋白基因，完整cds。genbank：l09719.1
-猫杯状病毒衣壳蛋白基因，完整cds。genbank：l09718.1
-用于衣壳蛋白rna(orf2)的人杯状病毒hu/nlv/wortley/90/uk，hu/nlv/wortley/90/uk株。genbank：aj277618.1
-用于衣壳蛋白rna(orf2)的人杯状病毒hu/nlv/thistlehall/90/uk，hu/nlv/thistlehall/90/uk株。genbank：aj277621.1
-用于衣壳蛋白rna(orf2)的人杯状病毒hu/nlv/valetta/95/malta，hu/nlv/valetta/95/malta株。genbank：aj277616.1
-人杯状病毒nlv/stav/95/nor衣壳蛋白基因，完整cds。genbank：af145709.1
-牛肠道杯状病毒株bo/cv500-oh/2002/us衣壳蛋白基因，完整cds。genbank：ay549155.1
-人杯状病毒nlv/mora/97/se衣壳蛋白基因，完整cds。genbank：ay081134.1
-人杯状病毒nlv/potsdam196/2000/de衣壳蛋白基因，完整cds。genbank：af439267.1
-人杯状病毒nlv/1581-01/swe衣壳蛋白基因，完整cds。genbank：ay247442.1
-人杯状病毒hu/nlv/gii/md134-10/1987/us衣壳蛋白基因，完整cds。genbank：ay030313.1
·星状病毒orf2-编码的蛋白，例如，其序列由如下序列指示或者能够衍生自如下序列：
-猪星状病毒4orf1b基因，部分cds；以及orf2基因，完整cds。genbank：jx684071.1
-星状病毒mlb1hk05，完整基因组。ncbi参考序列：nc_014320.1
-星状病毒野猪/wbastv-1/2011/hun，完整基因组。ncbi参考序列：nc_016896.1
-人类星状病毒bf34，完整基因组。ncbi参考序列：nc_024472.1
-星状病毒株mlb1hu/ita/2007/pr326/mlb1rna-依赖的rna聚合酶(orf1b)基因，部分cds；以及衣壳蛋白(orf2)基因，完整cds。genbank：kf417713.1
-人星状病毒5株hu/budapest/hun5186/2012/hun非结构蛋白(orf1a)和非结构蛋白(orf1b)基因，部分cds；以及衣壳蛋白(orf2)基因，完整cds。genbank：kf157967.1。
-人星状病毒1分离上海株衣壳蛋白(orf2)基因，完整cds。genbank：fj792842.1
-用于衣壳蛋白的人星状病毒8型orf2基因。genbank：z66541.1
·流感病毒猪ha、na和m1蛋白，例如，其序列由如下序列指示或者能够衍生自如下序列：
-seqidno.:30
-甲型流感病毒(a/duck/chiba/25-51-14/2013(h7n1))血凝素ha基因，完整cds。genbank：ab813060.1
-合成的构造体血凝素(ha)mrna，完整cds。genbank：dq868374.1
-甲型流感病毒(a/swine/shandong/2/03(h5n1))血凝素(ha)基因，完整cds。genbank：ay646424.1
-编码甲型流感病毒ha的cdna。genbank：e01133.1
-甲型流感病毒(a/swine/korea/s452/2004(h9n2))血凝素(ha)基因，完整cds。genbank：ay790307.1
-甲型流感病毒(a/thailand/2(sp-33)/2004(h5n1))神经氨酸酶(na)基因，完整cds。genbank：ay555152.3
-甲型流感病毒(a/swine/binhdoung/02_16/2010(h1n2))神经氨酸酶na基因，完整cds。genbank：ab628082.1
-甲型流感病毒(a/chicken/jalgaon/8824/2006(h5n1))神经氨酸酶(na)基因，完整cds。genbank：dq887063.1
-甲型流感病毒sc35mm2和m1基因，完整cds。genbank：dq266100.1
-流感病毒型/leningrad/134/47/57(h2n2)m1和m2rna，完整cds。genbank：m81582.1
-甲型流感病毒sc35mm2和m1基因，完整cds。genbank：dq266100.1
-甲型流感病毒(a/tochigi/2/2010(h1n1))m2、基质蛋白2的m1基因,基质蛋白1，完整cds。genbank：ab704481.1
·乙型肝炎核心和表面抗原，例如，其序列由如下序列指示或者能够衍生自如下序列：
-乙型肝炎株hbv248前核心蛋白与核心蛋白基因，完整cds。genbank：kp857118.1
-乙型肝炎株hbv401前核心蛋白与核心蛋白基因，完整cds。genbank：kp857113.1
-乙型肝炎株hbv403前核心蛋白与核心蛋白基因，完整cds。genbank：kp857068.1
-用于乙型肝炎表面抗原的乙型肝炎病毒s基因，部分cds，分离株：b0503327(ptk)。genbank：ab466596.1
优选地，重组蛋白不是由蛹内源性产生的蛋白。例如，重组蛋白不是由蛹例如刻克罗普斯蚕蛾种的蛹内源性产生的蛋白。例如，重组蛋白不是天蚕素a或抗菌肽。
本发明的蛹可为无丝的蛹，或可在蚕茧中。如果蛹不是无丝的蛹，本领域技术人员知道去除茧丝的方法。例如，可将茧丝溶解，优选地用盐溶液，优选地次氯酸盐hclo)，优选地次氯酸钠(naclo)(在本说明书中还称“溶解溶液”)。如图3所示，可通过特别设计的装置自动地进行该步骤。
本发明的蛹用于表达重组蛋白的用途
将本发明的蛹以其任何变异体，可用于重组蛋白的表达。因此，本发明提供了用于重组蛋白(优选地在本说明书上文详述的重组蛋白)的表达的蛹的用途。
本发明的用于生产重组蛋白的方法
本发明还提供了用于生产重组蛋白(其已经在上文被描述，优选地不是由蛹内源性产生蛋白)的方法。例如，根据本发明的用于提供至少一种重组蛋白的方法包括如下步骤，或，二者择一地，由如下步骤组成：
(a)提供蛹；
(b)用来源于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(acmnpv)的重组杆状病毒接种步骤(a)的蛹；
(c)将步骤(b)的接种蛹孵育足以使至少一种重组蛋白表达的一段时间；
(d)获取包含至少一种重组杆状蛋白的蛹；
(e)任选地，收获至少一种重组蛋白；以及
(f)任选地，纯化至少一种重组蛋白。
上述方法的步骤(a)的蛹可优选地为根据本发明的蛹，如上所详细描述的。步骤(a)的蛹优选地属于鳞翅目。优选地，蛹属于鳞翅目，优选地属于粉纹夜蛾(trichoplusia)属、尺蠖(rachiplusia)属、夜蛾(spodoptera)属、实夜蛾(heliothis)属、烟草天蛾(manduca)属、棉铃虫(helicoverpa)属、黑色女巫蛾(ascalapha)属或眉纹天蚕蛾(samia)属，优选地属于粉纹夜蛾(trichoplusia)属、尺蠖(rachiplusia)属、夜蛾(spodoptera)属、实夜蛾(heliothis)属或棉铃虫(helicoverpa)属，更优选地属于粉纹夜蛾(trichoplusiani)种、尺蠖(rachiplusianu)种、草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)种、烟芽夜蛾(heliothisvirescens)种、棉铃虫(helicoverpaarmigera)种、谷实夜蛾(helicoverpazea)种、烟草天蛾(manducasexta)种、黑色女巫蛾(ascalaphaodorata)种或眉纹天蚕蛾(samiacynthia)种)，甚至更优选地属于粉纹夜蛾(trichoplusiani)种。如上已经描述的，蛹可包含允许重组蛋白表达的核酸序列。如上已经描述的，蛹可包含允许在杆状病毒感染期间获得高于内源水平的用作转录调节因子的表达高于内源水平的蛋白ie-1、ie-0和/或其片段的核酸序列(见上文，“本发明的蛹”)。
上述步骤(a)的蛹可演化自卵。例如，上述步骤a)的蛹可用15-18天从卵演化成蛹，例如，在特别设计的一次性或重复使用的饲养舱中。步骤a)的蛹还可以以蛹的形式提供。
如果上述步骤a)的蛹在茧中，本发明的用于生产重组蛋白的方法可进一步包括从蛹去除茧丝的步骤。例如，可将茧丝溶解，优选地用优选地包含次氯酸(hclo)，优选地次氯酸钠(naclo)的盐溶液，例如以0.1％到5％w/v，如0.1％、0.2％、0.5％、1％、3％或5％w/v的浓度。例如，可用浓度0.1％到5％w/v的次氯酸钠溶液浸泡或喷洒蛹。茧丝的溶解可花费几秒钟到几分钟。当蛹在茧中时，从步骤(a)的蛹中去除茧丝优选地以半自动的或自动的形式(自动化丝去除)执行。在这方面，一些种如克罗普斯蚕蛾或家蚕的茧是厚茧的事实相对于其他属或种(如粉纹夜蛾属，特别是粉纹夜蛾种)是缺点。粉纹夜蛾属，特别是粉纹夜蛾种的蛹具有在丝中低密度的茧，并且能够容易地被溶解。这代表一个优点，因为整个过程能够以自动化的或半自动花的形式执行，增加效率并降低整体成本。
茧可以在半自动机器中去除，该机器可以包括具有应用于茧的溶解溶液的容器，优选地具有加压空气湍流，以减少溶解蚕茧所需的时间。然后可在洗涤容器中洗涤无丝蛹以去除痕量的洗涤溶液，并且然后用空气干燥。
因此，无丝蛹是优选的，其后，步骤(b)更容易执行。因此，具有十分致密的蛹是更不优选的。例如，家蚕的蛹具有十分致密、厚并紧凑的蛹，如上所述，其通过盐溶液溶解几分钟不能够容易地去除它。刻克罗普斯蚕蛾的蛹也是如此。应该手动地去除家蚕和/或刻克罗普斯蚕蛾的蛹的茧。
相反，其他种，如粉纹夜蛾的蛹包含在丝中更不致密的茧，并且能够如上所述容易地溶解。因此，这些蛹对生产本发明的重组蛋白的方法是优选的，因为它们的茧能够通过自动的或半自动的程序去除，帮助放大以获得准备用重组杆状病毒注射的蛹(步骤(b))。
在去除茧丝后，优选地用水洗涤蛹，以便去除痕量的盐溶液(例如，次氯酸钠)。随后在执行步骤(b)之前可将无丝蛹干燥并且在低温(例如，4℃)存储。例如，在执行步骤(b)之前无丝蛹可在低温(例如，4℃)下储存达1月。
因此，本发明还提供了用于生产无丝蛹(优选地属于鳞翅目，优选地属于本发明的蛹)的方法，包括如下步骤：
(a)提供包含于蚕茧中的蛹(优选地如上所述的本发明的蛹)；
(b)如前所详细描述的，用盐溶液，优选地次氯酸的盐溶液，优选地次氯酸钠，处理处理包含于蚕茧中的蛹；以及
(c)获取无丝(以及，优选地，基本上消毒的)蛹。
因此，本发明还提供了基本无丝(也就是，没有茧)的本发明的蛹。在一个优选的实施方式中，本发明的基本无丝的蛹不属于家蚕种。在一个优选的实施方式中，本发明的基本无丝的蛹不属于刻克罗普斯蚕蛾种。在一个优选的实施方式中，本发明的基本无丝的蛹属于粉纹夜蛾(trichoplusia)属、尺蠖(rachiplusia)属、夜蛾(spodoptera)属、实夜蛾(heliothis)属、烟草天蛾(manduca)属、棉铃虫(helicoverpa)属、黑色女巫蛾(ascalapha)属或眉纹天蚕蛾(samia)属，优选地属于粉纹夜蛾(trichoplusia)属、尺蠖(rachiplusia)属、夜蛾(spodoptera)属、实夜蛾(heliothis)属或棉铃虫(helicoverpa)属。在一个优选的实施方式中，本发明的基本无丝的蛹属于粉纹夜蛾(trichoplusiani)种、尺蠖(rachiplusianu)种、草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)种、烟芽夜蛾(heliothisvirescens)种、棉铃虫(helicoverpaarmigera)种、谷实夜蛾(helicoverpazea)种、烟草天蛾(manducasexta)种、黑色女巫蛾(ascalaphaodorata)种或眉纹天蚕蛾(samiacynthia)种)，优选地属于纹夜蛾(trichoplusiani)种。
本发明方法的步骤(b)涉及用来源于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(acmnpv)的重组杆状病毒接种步骤(a)的蛹。在上文详细地描述了可包含在本发明的蛹中的重组杆状病毒，在图4b中也示出了示范的图解。因此，优选地，在步骤(b)中，用重组杆状病毒接种本发明的蛹，以便提供如上所述的根据本发明的包含重组杆状病毒的蛹。公开为wo2012/168492的专利申请公开了可在本发明的用于生产重组蛋白的方法的步骤(b)中根据本发明可接种到蛹中的重组杆状病毒。重组杆状病毒包含编码重组蛋白，优选地重组蛋白(表达盒)选自在本说明书中如上定义的组的核酸序列。
无丝蛹是优选的，由于用重组杆状病毒接种更容易，并且能够自动的或半自动的执行，促进该方法的放大和再现性。
根据步骤(b)的重组杆状病毒的接种可通过本领域技术人员知道的技术执行。如本文中所定义的，“接种”指将物质引入体内，在这种情况下，将重组杆状病毒引入蛹中。接种还可被称为“注射”。由于幼虫用杆状病毒接种，在本说明书中该过程还可被称为“用杆状病毒感染幼虫”。
较优地，通过将特定量的包含至少一种杆状病毒的溶液注射蛹来执行接种。优选地使用穿过蛹并且向蛹的体内分配特定量的包含杆状病毒的溶液的针执行注射。该步骤还可自动进行；蛹可以放置在例如小窝的矩阵或阵列，并且接种装置或机械手(如下描述的)可自动地向蛹的内部分配杆状病毒。例如，蛹可以放置在小窝的矩阵(或阵列)，矩阵包括中间具有孔的顶部，使得接种装置或机械手(包括针，例如，在机械臂上)自动地将针定位到小窝上，并且针通过顶部的孔进入蛹。针穿透蛹的身体，例如，约1-5毫米，优选地约3mm(这可以自动进行)并且向蛹内部分配包括杆状病毒的溶液。装置或机械手可包含能够将精确量的杆状病毒(例如，约0.5-10μl优选地约5μl量的包括杆状病毒的溶液)分配到蛹中的精密泵。机械手可包含包含一只或更多只能够将杆状病毒注射入蛹中精确的位置的针的手臂。一旦执行了这个，机械手离开小窝，并且，由于蛹放置的矩阵的顶部，蛹容易留在矩阵小窝上，并且当机械臂把针从蛹中移走时，蛹不离开小窝，由于矩阵顶部的孔小于蛹，以便只有针能够通过它，因此针从蛹中移走并从小窝矩阵中移走，留下蛹。通过这种优选的处理，接种过程是自动的、快速的、有效的和高度重复的(每只蛹以相同的步骤接收相同量的包含杆状病毒的溶液)。机械手可具有若干只接种针(也就是说，针能够在精确的位置向蛹中接种或注射杆状病毒)，其可为可移动的，并且以每小时约3.000至约10.000只蛹的速度将杆状病毒接种入蛹中。
例如，将多于约50噬菌斑形成单位(pfu)量的杆状病毒接种入每只蛹。例如，将约50、约100、约500、约1,000、约5,000、约10,000、约15,000、约0,000、约25,000、约30,000、约40,000、约50,000、约60,000、约75,000或更多pfu(甚至约1,000,000)接种入每只蛹。例如，如前已经提及的，杆状病毒包含在溶液中，因此将一定量的包含杆状病毒的溶液注射入蛹中。例如，溶液可为包含杆状病毒的细胞培养基。例如，溶液可为包含杆状病毒的缓冲溶液，如pbs1xph7.4，1mmpmsf(蛋白酶抑制剂)和5mmdtt的包含杆状病毒的溶液。例如，蛹可以接种约0.5-10μl量的包含杆状病毒的溶液，如约0,5μl，如约1-10μl，如约1μl、约2μl、约3μl、约5μl、约7μl或约10μl)的接种蛹。例如，每只蛹接收0.5-10μl包含50至1,000,000pfu的溶液。
由于接种的自动化，机械手可每小时接种约3,000只蛹或更多，如每小时约3.000至约10.000只蛹。机械手适合于将液体输送到以矩阵或阵列形式提供的蛹中。
本发明的方法的步骤(c)包括将步骤(b)的接种蛹孵育足以使至少一种重组蛋白表达的一段时间；该孵育步骤可以优选地执行至少约72h，如约72h、约96h、约100h、约125h、约150h、约168h或更长(接种后)的一段时间。优选地，接种时间是接种后约96-168h或接种后约72-168h。该孵育步骤可以优选地在约22-28℃的温度下执行，优选地在无需任何光或湿度控制的孵化器中。接种的蛹(优选地放置在矩阵的小窝中)可在上述时间段留在矩阵的小窝上(孵育)。在另一个实施方式中，将蛹从矩阵移走并且在放置在其他任何地方以进行孵育时间，例如，袋子或允许蒸腾的任何容器(孵育应当优选在有气体交换的容器中执行，而不是在完全封闭的容器)。
以先前实验为基础，技术人员能根据待表达的蛋白为每只蛹和每种重组蛋白计算需要的孵育时间和孵育条件。
本发明方法的步骤(d)包括获取包含至少一种在孵育步骤(c)期间表达的重组蛋白的蛹。包含至少一种重组蛋白的蛹可从矩阵/阵列(或孵育地方)收集。含有至少一种重组蛋白的蛹可被储存(冷冻或冻干)用于后续处理。例如，包含至少一种重组蛋白的蛹可包装入包装中(优选地在真空下)。包含蛹的包装可被储存、转运和/或进一步处理。
本发明还提供了包含本发明蛹的包装，其中，优选地，蛹包含至少一种重组蛋白。优选地，蛹在真空下包装，以及本发明的包装因此包含例如，冷冻或冻干的真空蛹，以避免氧化。这允许更容易的操作和更长的储存期。
根据上述方法的步骤(d)获得的蛹还可冷冻并储存用于进一步处理。例如，蛹可在收集他们后立即在约-20℃，或约-80℃下冷冻，直到它们被进一步处理。例如，包含至少一种重组蛋白的蛹可在约-20℃至-70℃的温度下冷冻，直到重组蛋白被提取。包含重组蛋白的蛹可冷冻储存长时间段，例如，多于1年。
(可选地)本发明方法的步骤(e)优选地包含收获至少一种重组蛋白。技术人员知道用于收获包含在从步骤(d)获取的蛹的至少一种重组蛋白的方法和步骤。当然，这些方法和/或方案可取决于已经表达的重组蛋白的性质。
例如，蛋白可通过均质蛹提取(例如，在匀浆器机器或匀浆器混合器中，例如在搅拌匀浆器或转子-定子匀浆器中，至少数秒钟/分钟)，优选地在中性ph缓冲液的存在下，该缓冲液优选地包含抗氧化剂(还原剂)、蛋白酶抑制剂和合适的去垢剂。例如，缓冲液包含约1-25mm还原剂和约0.01％-2％(体积/体积))去垢剂产品。优选地，缓冲液进一步包含蛋白酶抑制剂的混合物。
在均质化之后，可对提取物进行超声和/或离心(例如，15,000-20,000g)以去除昆虫碎片，并过滤。
例如，纯化手段(用于收获包含在蛹中的至少一种重组蛋白的方法和步骤)包括物理地破坏蛹、离心、切向流过滤步骤、超声处理、层析法和/或消毒过滤。
在一个优选的实施方式中，匀浆的粘度可通过其与硅藻土(diatomaceousearth)(即，硅藻土(celite))孵育(过滤)而降低。可包括蛋白沉淀步骤。
根据重组蛋白的性质，可使用本领域技术人员能够选择的过滤器，通过切向流过滤使提取物澄清。缓冲液可通过透析过程(即，在同一切向过滤装置中)改变。
(可选地)本发明方法的步骤(f)优选地包括纯化至少一种重组蛋白。技术人员知道蛋白纯化技术。例如，可通过层析纯化、过滤或超速离心实现纯化。
因此可获得纯化的重组蛋白。在图17中示出了该方法的一种实施方式的模式。
通过本发明的方法获得的重组蛋白具有高纯度，并且可用于疫苗、诊断、化妆品或治疗中。
用于生产本发明的重组杆状病毒的方法
本发明进一步提供了用于生产重组杆状病毒的方法，包括如下步骤：
(a)提供蛹；
(b)用适合于生产来源于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(acmnpv)的重组杆状病毒的杆粒载体转染步骤(a)的蛹；
(c)将步骤(b)的接种蛹孵育足以使至少一种重组蛋白表达的一段时间；
(d)获取包括重组杆状病毒的蛹；
(e)任选地，收获重组杆状病毒；以及
(f)任选地，纯化重组杆状病毒。
优选地，在步骤(a)中提供的蛹是如上所定义的无丝蛹。蛹优选地属于粉纹夜蛾(trichoplusia)属、尺蠖(rachiplusia)属、夜蛾(spodoptera)属、实夜蛾(heliothis)属、烟草天蛾(manduca)属、棉铃虫(helicoverpa)属、黑色女巫蛾(ascalapha)属或眉纹天蚕蛾(samia)属，优选地属于粉纹夜蛾(trichoplusia)属、尺蠖(rachiplusia)属、夜蛾(spodoptera)属、实夜蛾(heliothis)属或棉铃虫(helicoverpa)属，更优选地属于粉纹夜蛾(trichoplusiani)种、尺蠖(rachiplusianu)种、草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)种、烟芽夜蛾(heliothisvirescens)种、棉铃虫(helicoverpaarmigera)种、谷实夜蛾(helicoverpazea)种、烟草天蛾(manducasexta)种、黑色女巫蛾(ascalaphaodorata)种或眉纹天蚕蛾(samiacynthia)种)，甚至更优选地属于粉纹夜蛾(trichoplusiani)种。
在步骤(b)中，用适合于生产来源于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(acmnpv)的重组杆状病毒的杆粒载体转染步骤(a)的蛹。
该步骤(b)还可称作“接种步骤”，因为它能够以与如上所述的用于生产重组蛋白的方法的步骤(b)相似的方法执行(但不是接种杆状病毒，而是接种杆粒载体)，也就是以自动的或半自动的方式，使用本发明的装置(也在下面描述)。如上所述，装置可依靠用针的注射将特定量的包含用于向蛹接种的转移载体和/或杆粒的溶液接种入蛹(其优选地将蛹放置于基质的小窝中，包括带孔的抽头(tap))。
杆粒载体可通过本领域技术人员知道的程序(生成，例如，依次产生克隆载体、供体载体、转移载体，以及最终，杆粒载体。例如在公布为wo2014/086981的专利申请中描述了杆粒载体的生成。
在优选的实施方式中，该转移载体和/或杆粒包含，或二者选一地，由允许在杆状病毒感染期间获得高于内源水平的用作转录调节因子的表达高于内源水平的蛋白ie-1、ie-0和/或其片段的核酸序列以及可操作地连接于适合于驱动重组蛋白的表达的任何启动子的重组同源区(hr)组成。上文以描述了这些核酸序列。例如，允许蛋白ie-1、ie-0和/或其片段表达的核酸序列选自包含如下的组：：
(a)包含在seqidno:1-5中任一条所示的核酸序列的核酸；
(b)具有与seqidno:1-5中任一条所示的核酸序列至少70％，优选地至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％以及最优选地至少95％序列一致性并且编码能够用作在重组杆状病毒中的转录调节因子的蛋白的核酸序列；
(c)编码包含在seqidno:6-9中任一条所示的氨基酸序列的氨基酸的核酸序列；以及
(d)编码具有与seqidno:6-9中任一条所示的氨基酸序列至少70％，优选地至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％以及最优选地少95％序列相似性并且能够用作在重组杆状病毒中的转录调节因子的氨基酸序列的核酸序列。
另外，驱动所述重组蛋白的表达的启动子优选地选自由如下核酸组成的组：
(a)包含在seqidno:10-14中任一条所示的，优选地在seqidno:11-13中任一条所示的核酸序列的核酸；以及
(b)能够用作重组杆状病毒中的启动子且具有与seqidno:10-14中任一条所示的，优选地与seqidno:11-13中任一条所示的核酸序列，至少70％，优选地至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％以及最优选地至少95％序列一致性的核酸序列。
重组同源区(hr)优选地是由seqidno:21(hr1)所示的序列。包括重组启动子、编码转录调节因子的序列与增强子区域的组合的核酸序列优选地选自由seqidno:15-20组成的组。。
优选地，向蛹接种的载体是杆粒。
步骤(c)指将步骤(b)的接种蛹孵育足以使至少一种重组蛋白表达的一段时间。例如，取决于病毒剂量和温度，用于粉纹夜蛾蛹的该时间段可为从约72h到约7天。技术人员能够计算足以产生重组蛋白的时间段。
然后，获得包含重组杆状病毒的蛹(步骤(d))。包含重组杆状病毒的蛹可以被储存用于进一步处理。例如，它们可被真空包装以降低氧化过程并促进它们的操作并增加安全储存时间。例如，包含重组杆状病毒的蛹在进一步处理它们之前可被冷冻(例如，在-20℃至-80℃)。例如，包含重组杆状病毒的蛹在进一步处理它们之前可被冻干。
任选地，可收获和纯化重组杆状病毒(步骤(e)和(f))。
本发明的装置
本发明还涉及包括精密泵、移动器械臂和适合于将液体(优选地包含杆状病毒或杆粒载体的溶液)注射入蛹(优选地本发明的蛹，其优选地是无丝蛹以及其优选地属于鳞翅目，优选地属于粉纹夜蛾(trichoplusia)属、尺蠖(rachiplusia)属、夜蛾(spodoptera)属、实夜蛾(heliothis)属、烟草天蛾(manduca)属、棉铃虫(helicoverpa)属、黑色女巫蛾(ascalapha)属或眉纹天蚕蛾(samia)属，更优选地属于粉纹夜蛾(trichoplusiani)种、尺蠖(rachiplusianu)种、草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)种、烟芽夜蛾(heliothisvirescens)种、棉铃虫(helicoverpaarmigera)种、谷实夜蛾(helicoverpazea)种、烟草天蛾(manducasexta)种、黑色女巫蛾(ascalaphaodorata)种或眉纹天蚕蛾(samiacynthia)种)的(可移动的)针的装置(在本发明还称作机械手)。
如上所详细描述的，可优选地以矩阵(或阵列)提供所述蛹，也就是蛹放置在矩阵的小窝中，以便装置能够容易地以自动的方式定位蛹。优选地，矩阵包括抽头，具有比蛹更小的孔(也就是蛹不能穿过孔)。
装置可进一步包括用于界定针的位置(和/或机械臂的位置)和/或用于计算从针尖(末端)到蛹的距离和/或针刺入蛹的距离和/或接种入蛹的液体(优选地包含杆状病毒或杆粒载体的溶液)的体积的计算机程序。此外，本发明的装置可进一步包括用于计算接种时间和/或不同的接种蛹的时间的计算机程序。装置可进一步包括用于界定针的位置的摄像机。
在一个优选的实施方式中，通过本发明的装置注射的液体包含重组杆状病毒。在另一个实施方式中，通过本发明的装置注射的液体包含适合于生产来源于acmnpv的重组杆状病毒的杆粒载体，如在本说明书中上文所描述。
本发明的装置适合于执行用于生产本发明的重组蛋白的方法的步骤(b)以及用于提供本发明的重组杆状病毒的方法的步骤(b)。
例如，本发明的装置适合于将从约0,5至约10,0μl，如约0,5μl，如约1-10μl，如约1μl、约2μl、约3μl、约5μl、约7μl或约10μl范围量的液体注射(接种)入蛹。
例如，包含在本发明的装置中的针能够穿透蛹约1至约4,5mm(优选地约3mm)的距离。
例如，本发明的装置包含几个可移动的接种针，并且能够以每小时约3,000至10,000只蛹的速度接种液体(优选地包括杆状病毒或杆粒载体的溶液)。
例如，通过本发明的装置接种的液体包含杆状病毒，优选地以从50到106pfus/剂量的量注射入每只蛹。例如，本发明的装置将多于约50，或多于约100、或多于约500噬菌斑形成单位(pfus)的量的杆状病毒注射(接种)到每只蛹。例如，约50、约100、约300、约500、约1,000、约5,000、约10,000、约15,000、约20,000、约25,000、约30,000、约40,000、约50,000、约100,000、约500,000或更多pfu接种入每只蛹，如约1,000,000pfu，。
本发明的装置优选地包括高精密泵，其能够使装置以高精度向蛹中接种期待量的液体(优选地包含杆状病毒或杆粒载体的溶液)。
本发明的装置适合于向配置为矩阵或阵列的蛹中递送液体。
优选地，本发明的装置进一步包括用于计算接种时间和/或接种蛹的时间的计算机程序，其应当是足够的时间以将包含杆状病毒的液体分配到每只蛹中。
优选地，本发明的装置还包括用于界定针的位置的摄像机。
本发明进一步提供了用于丝移除的装置(丝移除装置)。在图3中示出了本发明的丝移除装置一个实施例的示意图(从粉纹夜蛾茧上丝移除的半自动装置)。
本发明的丝移除装置(还称作“丝移除机器”)包括至少一个容纳丝溶解溶液容器，如上文所解释的。例如，容器包括次氯酸。第一容器还可优选地含有通过含有茧的饲养舱投射液体的系统(它有助于更有效地溶解围绕蛹的丝)。优选地用压缩空气将溶解溶液施加到茧上，以降低溶解丝茧所需要的时间。优选地，本发明的丝移除装置进一步包括第二容器，其为洗涤容器并且包括和/或分配适合于从蛹中移除痕量的丝以及丝溶解溶液的溶液，例如水。溶液(优选地水)优选地喷洒到蝶蛹(蛹)上。优选地，在该容器的顶部是分配空气以干燥蛹的系统。因此，在洗涤蛹后，它们优选地用空气干燥。在过程的结束时，蛹没有丝且准备被感染或储存(冷藏)直到使用。
序列的概要
实施例
实施例1.粉纹夜蛾的生产
昆虫幼虫饲养在含有数百只幼虫的可重复使用的或一次性的饲养舱中，使得从卵15-18天演变到蛹(图1)。然后，用浓度0.1％至5％w/v的次氯酸钠溶液浸泡或喷洒整个饲养舱或收集的蛹以溶解茧的丝纤维。几分钟后蚕丝溶解，然后用水洗涤蛹以除去痕量的次氯酸盐。随后将蛹干燥并在4℃储存直到杆状病毒接种。如在图2中能够见到的，由于粉纹夜蛾鳞翅目低密度的丝，该过程相对于对家蚕茧的相同的处理更简单。家蚕茧需要人工干预以释放蛹，由于粉纹夜蛾丝容易溶解以及通过自动的或半自动的步骤去除，促进扩大获取准备注射通过为了重组蛋白生产的重组杆状病毒的蛹。
实施例2.包含可操作地连接于嵌合启动子(p6.9和p10)de增强子序列(hr1)并且过表达ie-1和ie-0反式激活因子的双重组杆状病毒在昆虫蛹中生产重组蛋白中是高效的
在昆虫蛹(粉纹夜蛾)中在由杆状病毒同源重复序列hr1增强并由过表达的ie-1和ie-0反式激活因子的嵌合启动子的控制下的重组蛋白表达与通过使用常规杆状病毒获得的重组蛋白表达相比较。通过常规手段将重组绿色荧光蛋白(gfp)的编码基因克隆到在多角体蛋白启动子的控制下的常规acmnpv杆状病毒中(图4a)。还产生了通过含有上述的调控元件的表达盒(tb表达盒)修饰的另一种acmnpv杆状病毒，其含有gfp编码基因(图4b)。通过包括能够分配微升量的病毒接种物的精密泵以及能够在精确的位置注射病毒的机械臂的接种机械手用每杆状病毒50,000pfu感染蛹(图5a)。以小窝的矩阵配置蛹，每个小窝的顶部中心带有孔(图5b)。接种针(可以动地)通过孔接近蛹并且穿透蛹几微米以注射杆状病毒(图5c)。将包含0.5至10微升(μl)的重组蛋白分配入蛹，并且在在撤回针期间，蛹由于顶部保留在小窝中。该接种机械手显示每小时至少3,000只蛹的接种速度，比技术人员手工接种速度至少快6倍。
在接种96-168h后的孵育期间后，收集蛹并且在含有抗氧化剂、蛋白酶抑制剂和非离子去垢剂的中性ph缓冲液(例如，pbs1xph7.4+5mm二硫苏糖醇(dtt)+1mm苯基甲基磺酰氟(pmsf)+0,1％brij35+0,5％肌氨酰)的存在下在匀浆机中提取蛋白。提取物在15,000-20,000g下离心并且过滤。通过sds-page电泳分析提取物并且用考马斯蓝染色凝胶(图6a)。使用牛血清白蛋白(bsa)曲线通过密度测定法计算在感染蛹中每杆状病毒产生的gfp蛋白的产品收率(表达为微克每生物质单位)。该分析显示了与用常规的杆状病毒(也就是包含例如表达盒中没有任何其他调节元件的多角体蛋白启动子的杆状病毒)获得的生产率相比用tb盒遗传修改的杆状病毒获得的蛹中gfp生产率增加约5.6倍(图6b)。
实施例3.用粉纹夜蛾蛹中tb-修饰的杆状病毒表达不同的蛋白
为了分析使用tb(topbac)表达盒(seqidno.:17)表达进一步的蛋白的益处，将两种基因克隆入tb盒并且获得了相应的重组杆状病毒，以及表达常规杆状病毒在多角体蛋白启动子(polh)控制下的基因(图7)。用于获得重组杆状病毒的两种基因是编码来源于cv2ager3株的来自猪圆环病毒2型的蛋白cap(seqidno:25和27)以及来源于病毒株a/pr/8/34的来自流感病毒(h1)的血球凝集素(seqidno:30和31)的基因。使用与在实施例2中使用和描述的相同的感染和蛋白提纯方案，比较产生的tb(-)(也就是包括多角体蛋白启动子以在表达盒中表达蛋白但是没有被topbac(tb)表达盒所修饰的常规杆状病毒)和tb(+)杆状病毒在粉纹夜蛾蛹中它们的生产率。
由常规的(tb(-))或tb-修饰的(tb(+))杆状病毒介导的感染蛹中产量(表达为毫克每生物质单位)的比较显示了表达盒tb增加了两种蛋白表达的产量。在猪圆环病毒cap蛋白的情况下，与用常规的杆状病毒感染的蛹相比较，当蛹感染用tb-修饰的杆状病毒时蛋白产量提高了2.79倍(图8)。对于来自流感病毒的ha蛋白，这种增加是2.04倍(图9)。这些结果证实了tb盒显著地增加了在粉纹夜蛾蛹中重组蛋白的产量。
实施例4.在杆状病毒感染的粉纹夜蛾蛹中重组蛋白的生产比在幼虫中更高效
在tb(+)杆状病毒中进行了五种重组蛋白在粉纹夜蛾蛹以及幼虫中的比较表达。所表达的蛋白如下：gfp(seqidno.:23)、cap(seqidno.:25)、ha(seqidno.:30)和来自两种兔出血症病毒株(rhdv基因组1和rhdvb；seqidno:32和33)的vp60(衣壳蛋白)(图10)。用50,000pfu相应的tb(+)杆状病毒感染蛹和幼虫。在感染96h后收集感染的昆虫(幼虫和蛹)。通过用考马斯蓝染色的sds-page电泳分析可溶蛋白提取物(图11a、12a、13a和14a)。使用bsa曲线通过光密度法定量重组蛋白以及产品收率用毫克每生物质单位表示(图11b、12b、13b和14b)。在所有情况下，蛹比幼虫表达了更高量的重组蛋白，增长率从1.06至3.64。
实施例5.在粉纹夜蛾蛹中重组类病毒颗粒(vlps)的生产
为了说明在感染蛹中vlps的生产，用实施例4中分析的表达来自两个兔出血症病毒株的vp60蛋白的tb(+)杆状病毒感染的蛹的蛋白提取物进行vlps纯化。在去垢剂(2％肌氨酰(sigma)和在pbs(0.2m磷酸钠，0.1mnacl，ph6.0)中的5mmedta(sigma)和蛋白酶抑制剂(
通过常规手段执行使用透射电子显微镜分析沉淀。简单地说，将纯化的vlps(大约5μl)应用到辉光放电的碳涂层格栅2min。样本用2％(w/v)水性醋酸铀负染色。用em2000ex显微镜(jeol，日本)记录显微照片。如在图14中所示的，观察到对应于rhdv的预期大小和形状的vlps，表明在杆状病毒感染的蛹组织中实现了校正的折叠和自组装(图15)。
实施例6.在感染的粉纹夜蛾蛹中病毒接种物生产
在含有10％热灭活的胎牛血清(panbiotechgmbh)和庆大霉素(50μg/ml)(panbiotechgmbh)的tnmfh培养基(panbiotechgmbh，德国)中于27℃下培养草地贪夜蛾(sf21和sf9)细胞系。用台盼蓝染色评价细胞密度和活力。基于在感染后不同的时间活细胞相对于细胞的总数的百分比计算细胞活力。
在旋转瓶(80ml培养基)中以2×106细胞/ml的细胞密度感染在悬浮液中培养的sf9细胞。在感染时细胞活力在悬液中>99％。以0.01至0.1的感染复数(moi)用重组杆状病毒体外感染sf9细胞。感染72-96h后，离心后从上清液回收病毒接种物。通过噬菌斑形成单位(pfu)分析计算病毒滴度，获得每ml107至108病毒的病毒滴度。
以5x102至104pfu范围的剂量使用病毒感染粉纹夜蛾蛹。3-7天后，均质化蛹以在细胞培养基中或含有ddt和蛋白酶抑制剂pmsf的特定pbs缓冲液中收集感染性的病毒。30min内，在5,000xg下离心匀质蛹以清除蛹碎片。然后，通过0.45和0.22微米的过滤器相继地过滤含有病毒的上清液，并且通过与混合甘油储藏产生的病毒制剂，以及然后冷冻或冻干它。用寇氏法(karbermethod)具体地，lid50(幼虫感染剂量50)在粉纹夜蛾五龄幼虫种滴定病毒原液。用该方法计算的一个感染剂量的统计学意义在于，用id50感染的幼虫的群体将显示50％的个体感染。观察幼虫至少96h以便检测临床症状并追踪它们向蛹的演化。典型的病毒滴度为106至108pfu/ml之间的病毒制剂。此外，杆状病毒接种物能够在细胞培养物中没有先前的杆状病毒载体产生下获得。蛹可以通过转座程序用细菌中获得的杆粒转染。图16示出了通过无细胞系统在蛹中获得病毒原液的一般程序。
实施例7.细胞培养和病毒
27℃下，在含有10％热灭活的胎牛血清(panbiotechtm，德国)的tnm-fh昆虫培养基(panbiotechtm，德国)中，在6-孔组织培养板中培养草地贪夜蛾sf21或sf9细胞系(1x106细胞/孔)。acmnpv重组杆状病毒通过
实施例8.克隆载体的生成
克隆载体是含有通过用创建相同的凸出端的限制性内切酶处理载体与外源dna，然后将片段连接在一起，能够将外源dna片段插入的tb(+)杆状病毒表达盒的小段dna。克隆载体的本质特征是它必须包含合成的多克隆位点(mcs)以促进插入以选择的方向定向的外源基因、选择标记如抗生物抗性以允许阳性转化的细胞的选择以及用于在细菌中的增殖的功能性复制起点(ori)。
实施例9.含有本发明的杆状病毒表达盒的供体载体的生成
供体载体由含有使用合适的限制性内切酶将外源基因克隆入的杆状病毒表达盒的克隆载体，例如，puc57质粒，组成。通过连接如下dna序列合成了使用的tb(+)杆状病毒表达盒：(i)在启动子序列下游的杆状病毒转录调节因子编码序列ac-ie-01(例如，seqidno:1-5)，如polh启动子(例如，seqidno.:10)，以及hsvtk多聚腺苷酸化信号的上游以及(ii)在另一位点增强子序列，例如，同源区hr1，(iii)启动子序列的上游，例如，p6.9p10(例如，seqidno.:13)，接着是用于克隆目的基因的多克隆位点(mcs)以及mcs下游的p10多聚腺苷酸化信号(图4、7和10)。杆状病毒表达盒侧翼为特定的限制位点(例如，在5′末端bglii和bstz17l以及在3′末端bglii和sgfi)以促进将商用杆状病毒系统(基于转座，例如
使用ncoi和spei限制位点将编码外源基因克隆入克隆载体的mcs，生成供体质粒载体。
实施例10.含有本发明的杆状病毒表达盒的转移载体的生成
通过用5′侧翼位点的bstz17l与xbai消化供体载体并将其克隆入用相同的酶消化的转移载体pfastbactm1中生成转移载体。在该情况下，作为亚克隆的结果，用来自转移载体的p10多聚腺苷酸化信号更换杆状病毒表达盒的sv40多聚腺苷酸信号。除此之外，表达盒的所有元件包含在pfastbac转移载体中，取代原始商用转移载体的polh启动子和mcs。
实施例11.使用
通过使用
实施例12.昆虫蛹的感染
在所有实验使用1至5日龄的粉纹夜蛾(trichoplusiani(cabbagelooper))蛹。每只蛹的标准重量约为200-300mg，以及蛹被手工或通过特别设计的机械手注射1至10μl在细胞培养基或pbs1x中稀释的重组杆状病毒以达到选择的噬菌斑形成单位(pfu)每剂量。在感染后72-168h收集蛹。收集的蛹立即冷冻以在-20℃或-80℃储存，直到它们被处理用于重组蛋白定量。来自冷冻的通过杆状病毒感染的粉纹夜蛾蛹的全可溶的、非变性蛋白(tsndps)通过在提取缓冲液存在下，使用搅拌器或匀浆器混合器均质化数分钟获得。
实施例13.昆虫蛹的下游处理
通过匀浆机破坏冷冻的蛹，以获得包括浓度1-25mm的还原剂，浓度为0,01％-2％的去垢剂以及蛋白酶抑制剂混合物的粗提取物。粗提取物的粘度通过它与硅藻土温育特定时间段降低，然后离心以去除昆虫碎片以及过滤以清除硅藻土。然后，取决于重组蛋白性质，使用合适的过滤器通过切向流过滤使提取物澄清。最后，在相同的切向过滤装置中执行透析过滤过程以在进一步层析纯化之前改变缓冲液。图17示出了获得从杆状病毒感染的蛹中提取的可溶性重组蛋白的总体步骤。
本发明的条款(i)：
1.一种包含来源于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(acmnpv)的重组杆状病毒和/或杆粒的蛹。
2.根据条款1所述的蛹，其特征在于，所述蛹属于鳞翅目。
3.根据条款1所述的蛹，其特征在于，所述蛹属于粉纹夜蛾属、尺蠖属、夜蛾属、实夜蛾属、烟草天蛾属、棉铃虫属、黑色女巫蛾属或眉纹天蚕蛾属，优选地属于粉纹夜蛾种、烟草天蛾种、草地贪夜蛾种、斜纹夜蛾种、黑色女巫蛾种、烟芽夜蛾种、尺蠖种或眉纹天蚕蛾种，或容易被来源于acmnpv的重组杆状病毒和/或杆粒感染的任何其他蛹。
4.根据条款1-3中任一项所述的蛹，其特征在于，所述杆状病毒包含允许在杆状病毒感染期间获得高于内源水平的用作转录调节因子的表达高于内源水平的蛋白ie-1、ie-0和/或其片段的核酸序列以及可操作地连接于适合于驱动重组蛋白的表达的任何启动子的重组同源区(hr)。
5.一种包含允许在杆状病毒感染期间获得高于内源水平的用作转录调节因子的表达高于内源水平的蛋白ie-1、ie-0和/或其片段的核酸序列以及可操作地连接于适合于驱动重组蛋白的表达的任何启动子的重组同源区(hr)的蛹。
6.根据条款5所述的蛹，其特征在于，所述蛹属于鳞翅目。
7.根据条款6所述的蛹，其特征在于，所述蛹属于粉纹夜蛾属、尺蠖属、夜蛾属、实夜蛾属、烟草天蛾属、棉铃虫属、黑色女巫蛾属或眉纹天蚕蛾属，优选地属于粉纹夜蛾种、烟草天蛾种、草地贪夜蛾种、斜纹夜蛾种、黑色女巫蛾种、烟芽夜蛾种、尺蠖种或眉纹天蚕蛾种，或容易被来源于acmnpv的重组杆状病毒和/或杆粒感染的任何其他蛹。
8.根据条款1-7中任一项所述的蛹，其特征在于，所述蛹属于鳞翅目。
9.根据条款4-8中任一项所述的蛹，其特征在于，允许蛋白ie-1、ie-0和/或其片段表达的核酸序列选自包含如下的组：
(a)包含在seqidno:1-5中任一条所示的核酸序列的核酸；
(b)具有与seqidno:1-5中任一条所示的核酸序列至少70％，优选地至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％以及最优选地至少95％序列一致性并且编码能够用作在重组杆状病毒中的转录调节因子的蛋白的核酸序列；
(c)编码包含在seqidno:6-9中任一条所示的氨基酸序列的氨基酸的核酸序列；以及
(d)编码具有与seqidno:6-9中任一条所示的氨基酸序列至少70％，优选地至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％以及最优选地少95％序列相似性并且能够用作在重组杆状病毒中的转录调节因子的氨基酸序列的核酸序列。
10.根据条款4-9中任一项所述的蛹，其特征在于，驱动所述重组蛋白的表达的启动子为选自由如下核酸组成的组：
(a)包含在seqidno:10-14中任一条所示的，优选地在seqidno:11-13中任一条所示的核酸序列的核酸；以及
(b)能够用作重组杆状病毒中的启动子且具有与seqidno:10-14中任一条所示的，优选地与seqidno:11-13中任一条所示的核酸序列，至少70％，优选地至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％以及最优选地至少95％序列一致性的核酸序列。
11.根据条款4-10中任一项所述的蛹，其特征在于，重组同源区(hr)是由seqidno:21(hr1)所示的序列。
12.根据条款4-11中任一项所述的蛹，其特征在于，包括重组启动子、编码转录调节因子的序列与增强子区域的结合的核酸序列选自由seqidno:15-20组成的组。
13.根据条款4-12中任一项所述的蛹，其特征在于，所述蛹进一步包含编码重组蛋白的核酸序列。
14.根据条款13所述的蛹，其特征在于，所述重组蛋白选自包含亚单位单体疫苗、亚单位多聚体疫苗、类病毒颗粒、治疗性蛋白、抗体、酶、细胞因子、凝血因子、抗凝血剂、受体、激素、诊断蛋白试剂以及绿色荧光蛋白(gfp)的组。
15.根据条款14所述的蛹，其特征在于，所述重组蛋白是选自包含如下的组的类病毒颗粒：
(a)猪圆环病毒衣壳蛋白，优选地来自2型猪圆环病毒(例如，seqidno.:26)，
(b)口蹄疫病毒vp1、vp3或vp0蛋白，
(c)犬细小病毒vp1和vp2蛋白，
(d)猪细小病毒vp1和vp2蛋白，
(e)人诺瓦克病毒(基因组i或ii)衣壳蛋白，
(f)杯状病毒衣壳蛋白，
(g)人乳头瘤病毒l1蛋白，优选地来自人乳头瘤病毒16，
(h)戊型肝炎蛋白e2，
(i)传染性法氏囊病病毒vp1、vp2和vp3蛋白，
(j)星状病毒orf2编码的蛋白，
(k)流感病毒ha(例如，seqidno.:30)、na和m1蛋白，
(l)乙型肝炎核心和表面抗原，
(m)人细小病毒vp1和vp2蛋白，以及
(n)兔杯状病毒vp60蛋白，优选地来自兔出血症病毒rhdvb和rhdvg1(例如，seqidno.:32和33)。
16.如条款1-15中任一项中所定义的蛹用于表达重组蛋白的用途
17.根据条款16所述的用途，其特征在于，所述重组蛋白选自包含亚单位单体疫苗、亚单位多聚体疫苗、类病毒颗粒、治疗性蛋白、抗体、酶、细胞因子、凝血因子、抗凝血剂、受体、激素、诊断蛋白试剂以及绿色荧光蛋白(gfp)的组。
18.根据条款17所述的用途，其特征在于，所述重组蛋白是选自包含如下的组的类病毒颗粒：
(a)猪圆环病毒衣壳蛋白，优选地来自2型猪圆环病毒(例如，seqidno.:26)，
(b)口蹄疫病毒vp1、vp3或vp0蛋白，
(c)犬细小病毒vp1和vp2蛋白，
(d)猪细小病毒vp1和vp2蛋白，
(e)人诺瓦克病毒(基因组i或ii)衣壳蛋白，
(f)杯状病毒衣壳蛋白，
(g)人乳头瘤病毒l1蛋白，优选地来自人乳头瘤病毒16，
(h)戊型肝炎蛋白e2，
(i)传染性法氏囊病病毒vp1、vp2和vp3蛋白，
(j)星状病毒orf2编码的蛋白，
(k)流感病毒ha(例如，seqidno.:30)、na和m1蛋白，
(l)乙型肝炎核心和表面抗原，
(m)人细小病毒vp1和vp2蛋白，以及
(n)兔杯状病毒vp60蛋白，优选地来自兔出血症病毒rhdvb和rhdvg1(例如，seqidnos.:32和33)。
19.一种用于生产至少一种重组蛋白的方法，包括如下步骤：
(a)提供蛹；
(b)用来源于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(acmnpv)的重组杆状病毒接种步骤(a)的蛹；
(c)将步骤(b)的接种蛹孵育足以使至少一种重组蛋白表达的一段时间；
(d)获取包含至少一种重组杆状蛋白的蛹；
(e)任选地，收获至少一种重组蛋白；以及
(f)任选地，纯化至少一种重组蛋白。
20.根据条款19所述的方法，其特征在于，所述蛹属于鳞翅目。
21.根据条款20所述的方法，其特征在于，所述蛹属于粉纹夜蛾属、尺蠖属、夜蛾属、实夜蛾属、烟草天蛾属、棉铃虫属、黑色女巫蛾属或眉纹天蚕蛾属，优选地属于粉纹夜蛾种、烟草天蛾种、草地贪夜蛾种、斜纹夜蛾种、黑色女巫蛾种、烟芽夜蛾种、尺蠖种或眉纹天蚕蛾种，或容易被来源于acmnpv的重组杆状病毒和/或杆粒感染的任何其他蛹。
22.根据条款21所述的方法，其特征在于，所述蛹属于鳞翅目。
23.根据条款19-22中任一项所述的方法，其特征在于，所述重组杆状病毒包含允许在杆状病毒感染期间获得高于内源水平的用作转录调节因子的表达高于内源水平的蛋白ie-1、ie-0和/或其片段的核酸序列以及可操作地连接于适合于驱动重组蛋白的表达的任何启动子的重组同源区(hr)。
24.根据条款23所述的方法，其特征在于，允许蛋白ie-1、ie-0和/或其片段表达的核酸序列选自包含如下组成的组：：
(a)包含在seqidno:1-5中任一条所示的核酸序列的核酸；以及
(b)具有与seqidno:1-5中任一条所示的核酸序列至少70％，优选地至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％以及最优选地至少95％序列一致性并且编码用作在重组杆状病毒中的转录调节因子的蛋白的核酸序列；
(c)编码包含在seqidno:6-9中任一条所示的氨基酸序列的氨基酸的核酸序列；以及
(d)编码具有与seqidno:6-9中任一条所示的氨基酸序列至少70％，优选地至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％以及最优选地至少95％序列相似性性并且能够用作在重组杆状病毒中的转录调节因子的氨基酸序列的核酸序列。
25.根据条款23-24中任一项所述的方法，其特征在于，驱动所述重组蛋白的表达的启动子为选自由如下核酸组成的组：
(a)包含在seqidno:10-14中任一条所示的，优选地在seqidno:11-13中任一条所示的核酸序列的核酸；以及
(b)能够用作重组杆状病毒中的启动子且具有与seqidno:10-14中任一条所示的，优选地与seqidno:11-13中任一条所示的核酸序列，至少70％，优选地至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％以及最优选地至少95％序列一致性的核酸序列。
26.根据条款23-25中任一项所述的方法，其特征在于，重组同源区(hr)是由seqidno:21(hr1)所示的序列。
27.根据条款23-26中任一项所述的方法，其特征在于，包括重组启动子、编码转录调节因子的序列与增强子区域的结合的核酸序列选自由seqidno:15-20组成的组。
28.根据条款19-27中任一项所述的方法，其特征在于，所述蛹进一步包括编码重组蛋白的核酸序列。
29.根据条款28所述的方法，其特征在于，所述重组蛋白选自包含亚单位单体疫苗、亚单位多聚体疫苗、病毒样颗粒、治疗性蛋白、抗体、酶、细胞因子、凝血因子、抗凝血剂、受体、激素、诊断蛋白试剂以及绿色荧光蛋白(gfp)的组。
30.根据条款29所述的方法，其特征在于，所述重组蛋白是选自包含如下的组的类病毒颗粒：：
(a)猪圆环病毒衣壳蛋白，优选地来自2型猪圆环病毒(即，seqidno.:26)，
(b)口蹄疫病毒vp1、vp3或vp0蛋白，
(c)犬细小病毒vp1和vp2蛋白，
(d)猪细小病毒vp1和vp2蛋白，
(e)人诺瓦克病毒(基因组i或ii)衣壳蛋白，
(f)杯状病毒衣壳蛋白，
(g)人乳头瘤病毒l1蛋白，优选地来自人乳头瘤病毒16，
(h)戊型肝炎蛋白e2，
(i)传染性法氏囊病病毒vp1、vp2和vp3蛋白，
(j)星状病毒orf2编码的蛋白，
(k)流感病毒ha(例如，seqidno.:30)、na和m1蛋白，
(l)乙型肝炎核心和表面抗原，
(n)人细小病毒vp1和vp2蛋白，以及
(n)兔杯状病毒vp60蛋白，优选地来自兔出血症病毒rhdvb和rhdvg1(例如，seqidno.:32和33)。
31.根据条款19-30中任一项所述的方法，其特征在于，所述蛹为无丝蛹。
32.根据条款31所述的方法，其特征在于，所述无丝蛹通过使用次氯酸盐溶液，优选地次氯酸钠溶解包含粉纹夜蛾蛹的蚕茧丝获得。
33.根据条款19-32中任一项所述的方法，其特征在于，用重组杆状病毒接种蛹通过将杆状病毒注射到蛹中来执行。
34.根据条款19-33中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(b)的接种的蛹是条款1-15中任一项所定义的蛹。
35.根据条款19-34中任一项所述的方法，其特征在于，所述蛹接种杆状病毒的量为50-106pfus/蛹。
36.一种用于生产属于鳞翅目的无丝蛹的方法，包括如下步骤：
(a)提供包含于茧中的蛹；
(b)用次氯酸盐溶液，优选地，次氯酸钠处理包含于茧中的蛹；以及
(c)获取无丝且消毒的蛹。
37.根据条款36所述的方法，其特征在于，所述蛹不属于家蚕种。
38.根据条款36-37中任一项所述的方法，其特征在于，所述蛹属于粉纹夜蛾种。
39.根据条款36-38中任一项所述的方法，其特征在于，所述蛹以矩阵(阵列)提供。
40.一种用于生产重组杆状病毒的方法，包括以下步骤：
(a)提供蛹；
(b)用适合于生产来源于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(acmnpv)的重组杆状病毒的杆粒转染步骤(a)的蛹；
(c)将步骤(b)的接种蛹孵育足以使至少一种重组蛋白表达的一段时间；
(d)获取包括重组杆状病毒的蛹；
(e)任选地，收获重组杆状病毒；以及
(f)任选地，纯化重组杆状病毒。
41.根据条款39所述的方法，其特征在于，所述蛹是条款36-39中任一项所定义的蛹。
42.根据条款40-41中任一项所述的方法，其特征在于，所述蛹属于粉纹夜蛾种。
43.根据条款42所述的方法，其特征在于，所述蛹属于粉纹夜蛾属、尺蠖属、夜蛾属、实夜蛾属、烟草天蛾属、棉铃虫属、黑色女巫蛾属或眉纹天蚕蛾属，优选地属于粉纹夜蛾种、烟草天蛾种、草地贪夜蛾种、斜纹夜蛾种、黑色女巫蛾种、烟芽夜蛾种、尺蠖种或眉纹天蚕蛾种，或容易被来源于acmnpv的重组杆状病毒和/或杆粒感染的任何其他蛹。
44.根据条款43所述的方法，其特征在于，所述蛹属于粉纹夜蛾种。
45.根据条款40-44中任一项所述的方法，其特征在于，适合于生产来源于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(acmnpv)的重组杆状病毒的杆粒包含，或二者择一地，由允许在杆状病毒感染期间获得高于内源水平的用作转录调节因子的表达高于内源水平的蛋白ie-1、ie-0和/或其片段的核酸序列以及可操作地连接于适合于驱动重组蛋白的表达的任何启动子的重组同源区(hr)组成。
46.根据条款45所述的方法，其特征在于，允许蛋白ie-1、ie-0和/或其片段表达的核酸序列优选地选自包含如下的组：
(a)包含在seqidno:1-5中任一条所示的核酸序列的核酸；
(b)具有与seqidno:1-5中任一条所示的核酸序列至少70％，优选地至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％以及最优选地至少95％序列一致性并且编码能够用作在重组杆状病毒中的转录调节因子的蛋白的核酸序列；
(c)编码包含在seqidno:6-9中任一条所示的氨基酸序列的氨基酸的核酸序列；以及
(d)编码具有与seqidno:6-9中任一条所示的氨基酸序列至少70％，优选地至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％以及最优选地少95％序列相似性并且能够用作在重组杆状病毒中的转录调节因子的氨基酸序列的核酸序列。
47.根据条款45-46中任一项所述的方法，其特征在于，驱动所述重组蛋白的表达的启动子选自包含如下核酸组成的组：
(a)含有在seqidno:10-14中任一条所示的，优选地在seqidno:11-13中任一条所示的核酸序列的核酸；以及
(b)能够用作重组杆状病毒中的启动子且具有与seqidno:10-14中任一条所示的，优选地与seqidno:11-13中任一条所示的核酸序列，至少70％，优选地至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％以及最优选地至少95％序列一致性的核酸序列。
48.根据条款45-47中任一项所述的方法，其特征在于，重组同源区(hr)是由seqidno:21(hr1)所示的序列。
49.根据条款45-48中任一项所述的方法，其特征在于，包括重组启动子、编码转录调节因子的序列与增强子区域的结合的核酸序列选自由seqidno:15-20组成的组。
50.根据条款40-49中任一项所述的方法，其特征在于，所述蛹为无丝蛹。
51.根据条款50所述的方法，其特征在于，所述无丝蛹通过使用次氯酸盐溶液，优选地次氯酸钠溶解包含粉纹夜蛾蛹的蚕茧丝获得。
52.根据条款40-51中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(b)的转染的蛹是条款5-15中任一项所定义的蛹。
53.根据条款40至52中任一项所述的方法，其特征在于，所述蛹以矩阵提供。
54.一种装置，所述装置包括精密泵、移动机械臂和适合于将液体注射入属于鳞翅目，优选地属于粉纹夜蛾属、尺蠖属、夜蛾属、实夜蛾属、烟草天蛾属、棉铃虫属、黑色女巫蛾属或眉纹天蚕蛾属，更优选地属于粉纹夜蛾种、烟草天蛾种、草地贪夜蛾种、斜纹夜蛾种、黑色女巫蛾种、烟芽夜蛾种、尺蠖种或眉纹天蚕蛾种，或容易被来源于acmnpv的重组杆状病毒和/或杆粒感染的任何其他蛹的蛹中的(可移动的)针。
55.根据条款54所述的装置，其特征在于，所述蛹以矩阵或阵列提供。
56.根据条款54-55中任一项所述的装置，其特征在于，所述装置进一步包含用于界定针的位置和/或用于计算从针到蛹的距离和/或针刺入蛹的距离和/或接种到蛹中的液体的体积和/或确定接种针的坐标和/或计算接种体积和/或时间和/或在蛹接种之间的时间的计算机程序。
57.根据条款56所述的装置，其特征在于，还包括用于计算接种时间和/或接种蛹的时间的计算机程序。
58.根据条款54-57中任一项所述的装置，其特征在于，所述装置进一步包含用于界定针的位置的摄像机。
59.根据条款54所述的装置，其特征在于，所述蛹是条款1-15中任一项所定义的蛹。
60.根据条款54-59中任一项所述的装置，其特征在于，所述注射液体包含重组杆状病毒或杆粒。
61.根据条款54-60中任一项所述的装置，其特征在于，所述装置适合于执行条款19和/或40中任一项所定义的步骤(b)。
62.根据条款54-61中任一项所述的装置，其特征在于，所述注射入蛹的液体范围从约0.5至约10.0μl，优选地约为5μl。
63.根据条款54-62中任一项所述的装置，其特征在于，所述针穿入蛹约1至约5mm，优选地约为3mm。
64.根据条款54-63中任一项所述的装置，其特征在于，所述注射入蛹的液体包括杆状病毒，优选地注射入每只蛹的量为50-106pfus/剂量。
本发明的条款(ii)：
1.一种包括来源于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(acmnpv)的重组杆状病毒和/或杆粒的蛹，其中优选地所述蛹属于鳞翅目，优选地属于粉纹夜蛾属、尺蠖属、夜蛾属、实夜蛾属、烟草天蛾属、棉铃虫属、黑色女巫蛾属或眉纹天蚕蛾属，更优选地属于粉纹夜蛾种、烟草天蛾种、草地贪夜蛾种、斜纹夜蛾种、黑色女巫蛾种、烟芽夜蛾种、尺蠖种或眉纹天蚕蛾种，或容易被来源于acmnpv的重组杆状病毒和/或杆粒感染的任何其他蛹。
2.根据条款1所述的蛹，其特征在于，所述杆状病毒包含允许在杆状病毒感染期间获得高于内源水平的用作转录调节因子的表达高于内源水平的蛋白ie-1、ie-0和/或其片段的核酸序列以及可操作地连接于适合于驱动重组蛋白的表达的任何启动子的重组同源区(hr)。
3.一种包含允许在杆状病毒感染期间获得高于内源水平的用作转录调节因子的表达高于内源水平的蛋白ie-1、ie-0和/或其片段的核酸序列以及可操作地连接于适合于驱动重组蛋白的表达的任何启动子的重组同源区(hr)的蛹，其中优选地所述蛹属于鳞翅目，优选地属于粉纹夜蛾属、尺蠖属、夜蛾属、实夜蛾属、烟草天蛾属、棉铃虫属、黑色女巫蛾属或眉纹天蚕蛾属，甚至更优选地属于粉纹夜蛾种、烟草天蛾种、草地贪夜蛾种、斜纹夜蛾种、黑色女巫蛾种、烟芽夜蛾种、尺蠖种或眉纹天蚕蛾种，或容易被来源于acmnpv的重组杆状病毒和/或杆粒感染的任何其他蛹。
4.根据条款2-3中任一项所述的蛹，其中允许蛋白ie-1、ie-0和/或其片段表达的核酸序列选自包含如下的组：
(a)包含在seqidno:1-5中任一条所示的核酸序列的核酸；
(b)具有与seqidno:1-5中任一条所示的核酸序列至少70％，优选地至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％以及最优选地至少95％序列一致性并且编码能够用作在重组杆状病毒中的转录调节因子的蛋白的核酸序列；
(c)编码包含在seqidno:6-9中任一条所示的氨基酸序列的氨基酸的核酸序列；以及
(d)编码具有与seqidno:6-9中任一条所示的氨基酸序列至少70％，优选地至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％以及最优选地少95％序列相似性并且能够用作在重组杆状病毒中的转录调节因子的氨基酸序列的核酸序列；
其中驱动所述重组蛋白的表达的启动子为优选自有如下核酸的组成组：
(a)包含在seqidno:10-14中任一条所示的，优选地在seqidno:11-13中任一条所示的核酸序列的核酸；以及
(b)能够用作重组杆状病毒中的启动子且具有与seqidno:10-14中任一条所示的，优选地与seqidno:11-13中任一条所示的核酸序列，至少70％，优选地至少75％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％以及最优选地至少95％序列一致性的核酸序列；以及
其中重组同源区(hr)是由seqidno:21(hr1)所示的序列。
5.根据条款2-4中任一项所述的蛹，其特征在于，包括重组启动子、编码转录调节因子的序列与增强子区域的结合的核酸序列选自由seqidno:15-20组成的组。
6.根据条款2-5中任一项所述的蛹，其特征在于，所述蛹进一步包含编码重组蛋白的核酸序列，所述重组蛋白优选地选自包含亚单位单体疫苗、亚单位多聚体疫苗、类病毒颗粒、治疗性蛋白、抗体、酶、细胞因子、凝血因子、抗凝血剂、受体、激素、诊断蛋白试剂以及绿色荧光蛋白(gfp)的组。
7.如条款1-6中任一项所定义的蛹用于表达重组蛋白的用途，所述重组蛋白选自包含亚单位单体疫苗、亚单位多聚体疫苗、类病毒颗粒、治疗性蛋白、抗体、酶、细胞因子、凝血因子、抗凝血剂、受体、激素、诊断蛋白试剂以及绿色荧光蛋白(gfp)的组。
8.一种用于生产至少一种重组蛋白的方法，包括如下步骤：
(a)提供蛹，优选地无丝蛹；
(b)用来源于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(acmnpv)的重组杆状病毒接种步骤(a)的蛹；
(c)将步骤(b)的接种蛹孵育足以使至少一种重组蛋白表达的一段时间；
(d)获取包含至少一种重组杆状蛋白的蛹；
(e)任选地，收获至少一种重组蛋白；以及
(f)任选地，纯化至少一种重组蛋白。
其中优选地所述蛹属于鳞翅目，优选地属于粉纹夜蛾属、尺蠖属、夜蛾属、实夜蛾属、烟草天蛾属、棉铃虫属、黑色女巫蛾属或眉纹天蚕蛾属，甚至优选地属于粉纹夜蛾种、烟草天蛾种、草地贪夜蛾种、斜纹夜蛾种、黑色女巫蛾种、烟芽夜蛾种、尺蠖种或眉纹天蚕蛾种，或容易被来源于acmnpv的重组杆状病毒和/或杆粒感染的任何其他蛹。
9.根据条款8所述的方法，其特征在于，所述重组杆状病毒包含允许在杆状病毒感染期间获得高于内源水平的用作转录调节因子的表达高于内源水平的蛋白ie-1、ie-0和/或其片段的核酸序列以及可操作地连接于适合于驱动重组蛋白的表达的任何启动子的重组同源区(hr)，其中优选地允许在杆状病毒感染期间获得高于内源水平的用作转录调节因子的表达高于内源水平的蛋白ie-1、ie-0和/或其片段的核酸序列以及可操作地连接于适合于驱动重组蛋白的表达的任何启动子的重组同源区(hr)如权利要求4中所定义。
10.根据条款11所述的方法，其特征在于，包括重组启动子、编码转录调节因子的序列与增强子区域的结合的核酸序列选自由seqidno:15-20组成的组。
11.根据条款8-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述蛹进一步包含编码重组蛋白的核酸序列，所述重组蛋白优选地选自包含亚单位单体疫苗、亚单位多聚体疫苗、类病毒颗粒、治疗性蛋白、抗体、酶、细胞因子、凝血因子、抗凝血剂、受体、激素、诊断蛋白试剂和绿色荧光蛋白(gfp)的组。
12.一种用于生产属于鳞翅目优选地粉纹夜蛾属的无丝蛹的方法，包括如下步骤：
(a)提供包含于蚕茧中的蛹；
(b)用次氯酸盐溶液，优选地，次氯酸钠处理包含于蚕茧中的蛹；以及
(c)获取无丝且消毒的蛹。
13.一种用于生产重组杆状病毒的方法，包括如下步骤：
(a)提供蛹，优选地无丝蛹，优选地属于鳞翅目，优选地属于粉纹夜蛾属、尺蠖属、夜蛾属、实夜蛾属、烟草天蛾属、棉铃虫属、黑色女巫蛾属或眉纹天蚕蛾属，甚至更优选地属于粉纹夜蛾种、烟草天蛾种、草地贪夜蛾种、斜纹夜蛾种、黑色女巫蛾种、烟芽夜蛾种、尺蠖种或眉纹天蚕蛾种，或容易被来源于acmnpv的重组杆状病毒和/或杆粒感染的任何其他蛹。
(b)用适合于生产来源于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(acmnpv)的重组杆状病毒的杆粒转染步骤(a)的蛹；
(c)将步骤(b)的接种蛹孵育足以使至少一种重组蛋白表达的一段时间；
(d)获取包括重组杆状病毒的蛹；
(e)任选地，收获重组杆状病毒；以及
(f)任选地，纯化重组杆状病毒。
14.根据条款13的方法，其特征在于，所述适合于生产来源于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(acmnpv)的重组杆状病毒的杆粒，包含，或二者择一地，由允许在杆状病毒感染期间获得高于内源水平的用作转录调节因子的表达高于内源水平的蛋白ie-1、ie-0和/或其片段的核酸序列以及可操作地连接于适合于驱动重组蛋白的表达的任何启动子的重组同源区(hr)组成，其中优选地允许在杆状病毒感染期间获得高于内源水平的用作转录调节因子的表达高于内源水平的蛋白ie-1、ie-0和/或其片段的核酸序列以及可操作地连接于适合于驱动重组蛋白的表达的任何启动子的重组同源区(hr)如权利要求4中所定义。
15.根据条款14所述的方法，其特征在于，包括重组启动子、编码转录调节因子的序列与增强子区域的结合的核酸序列选自由seqidno:15-20组成的组。
16.一种装置，所述装置包括精密泵、移动机械臂和适合于将液体注射入属于鳞翅目，优选地属于粉纹夜蛾属、尺蠖属、夜蛾属、实夜蛾属、烟草天蛾属、棉铃虫属、黑色女巫蛾属或眉纹天蚕蛾属，甚至更优选地属于粉纹夜蛾种、烟草天蛾种、草地贪夜蛾种、斜纹夜蛾种、黑色女巫蛾种、烟芽夜蛾种、尺蠖种、或眉纹天蚕蛾种，或容易被来源于acmnpv的重组杆状病毒和/或杆粒感染的任何其他蛹的蛹中的(可移动的)针，其中优选地所述蛹以矩阵或阵列提供。
17.根据条款16所述的装置，其特征在于，所述装置进一步包含用于界定针的位置和/或用于计算从针到蛹的距离和/或针刺入蛹的距离和/或接种到蛹的液体的体积和/或确定接种针的坐标和/或计算接种体积和/或时间和/或接种蛹的时间的计算机程序。