根据35u.s.c.§119(e)，本专利申请要求于2015年12月17日提交的美国临时专利申请no.62/269,031的权益。前述专利申请的全部内容以引用方式并入本文。
本发明涉及可用于培养细胞及其他此类应用的粒状干细胞培养基、补料、补充剂、浓缩物或培养基缓冲液。本发明涉及用于制备此类粒状组合物的工艺以及将颗粒调整至所需粒径的方法。本发明还涉及使用此类颗粒制剂生产蛋白质和多肽并且由此加快细胞生长和增加蛋白滴度。
技术实现要素：
本发明的第一方面涉及制备粒状细胞培养基的方法，该方法包括：a)使第一干粉悬浮在流化床设备中向上运动的气柱中，并且在圆盘转子中旋转；b)将溶剂和/或第二干粉引入步骤(a)的流化床设备中，使得形成颗粒；以及c)使颗粒干燥，其中第一干粉、第二干粉或溶剂包含粘结剂、赋形剂或两者。
在另一方面，步骤(a)的第一干粉可经过预润湿，并且任选地，在步骤(b)中不引入溶剂。
在一些方面，第一干粉和第二干粉可相同，并且在其它方面，第一干粉和第二干粉可不同。
在一个特定方面，第一干粉可选自由以下项组成的组：基础培养基粉末、完全培养基粉末、补料、补充剂、培养基或补料浓缩物和氨基酸混合物，其能够支持培养细胞的培养。在另一方面，第二干粉可选自由以下项组成的组：基础培养基粉末、完全培养基粉末、补料、补充剂、培养基或补料浓缩物和氨基酸混合物，其能够支持培养细胞的培养。
本发明的第二方面提供了粘结剂或赋形剂或两者，这些粘结剂或赋形剂或两者存在于第一粉末、第二粉末中、存在于溶剂中或任一项中并且用于本文所述的方法中。在另一方面，粘结剂或赋形剂可选自由以下项组成的组：糖、天然物质、合成物质和半合成物质。在一个特定方面，天然物质可为例如微晶纤维素。
在一个特定方面，本发明提供了糖，这些糖存在于第一粉末、第二粉末中、存在于溶剂中或任一项中并且用于本文所述的方法中；并且这些糖可选自由以下项组成的组：葡萄糖、蔗糖、海藻糖、单糖、二糖和低聚糖。在另一方面，糖可为葡萄糖，并且颗粒中葡萄糖的浓度可为颗粒组合物的0.1％至100％。在一个具体实施方案中，糖包括d-葡萄糖。
在一个实施方案中，本发明提供了维生素，这些维生素存在于第一粉末、第二粉末中、存在于溶剂中或任一项中并且用于本文所述的方法中。在一个具体实施方案中，维生素选自维生素b12、生物素、胆碱、叶酸、烟酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺素、抗坏血酸、对氨基苯甲酸(paba)等中的一者或多者。
在另一个实施方案中，本发明提供了盐，这些盐可存在于第一粉末、第二粉末中或存在于溶剂中并且用于本文所述的方法中。在一个实施方案中，盐选自缓冲盐、铁盐、锌盐、钙盐、铜盐、镁盐、锰盐、铵盐、钒盐等中的一者或多者。
在另一个实施方案中，本发明提供了氨基酸，这些氨基酸存在于第一粉末、第二粉末中、存在于溶剂中或任一项中并且用于本文所述的方法中。在一个实施方案中，氨基酸选自熟知的二十种氨基酸、它们的盐或其衍生物中的一者或多者。在另一个实施方案中，氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、酪氨酸、半胱氨酸和赖氨酸中的一者或多者。
在另一方面，本发明提供了粘结剂，这些粘结剂存在于第一粉末、第二粉末中、存在于溶剂中或任一项中并且用于本文所述的方法中。在一些实施方案中，在整个说明书中，粘结剂或赋形剂可互换使用或一起使用。在一个实施方案中，粘结剂或赋形剂选自由以下项组成的组：糖、天然物质、合成物质和半合成物质、微晶纤维素、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、单糖、二糖和低聚糖、赋形剂和/或崩解剂。在一个具体实施方案中，粘结剂为微晶纤维素和葡萄糖。在另一个实施方案中，颗粒中的一种或多种粘结剂的组成百分比可为约0.1％至约100％。在一个具体实施方案中，颗粒中的一种或多种粘结剂的组成百分比可为约30％至约60％。
本发明的第三方面提供了制备具有各种尺寸的颗粒的方法；在一些情况下，颗粒具有约0.05mm至7mm的尺寸。在一个特定方面，本发明提供的颗粒所具有的尺寸为约0.05mm至约0.5mm，或约0.05mm至约1mm，或约0.05mm至约2mm，或约0.05mm至约3mm，或约0.05mm至约4mm，或约0.05mm至约5mm，或约0.05mm至约6mm，或约0.05mm至约0.1mm，或约0.05mm至约0.2mm，或约0.05mm至约0.3mm，或约0.05mm至约0.4mm，或约0.1mm至约1mm，或约0.1mm至约2mm，或约0.1mm至约3mm，或约0.1mm至约4mm，或约0.1mm至约5mm，或约0.1mm至约6mm，或约0.5mm至约1mm，或约0.5mm至约2mm，或约0.5mm至约3mm，或约0.5mm至约4mm，或约0.5mm至约5mm，或约0.5mm至约6mm，或约0.5mm至约7mm，或约1mm至约2mm，或约1mm至约3mm，或约1mm至约4mm，或约1mm至约5mm，或约1mm至约6mm，或约1mm至约7mm。在一个具体实施方案中，本发明提供了颗粒制剂，其中大部分颗粒制剂具有的颗粒大小可大于约0.1mm，或大于约0.2mm，或大于约0.3mm，或大于约0.4mm，或大于约0.5mm，或大于约0.6mm，或大于约0.7mm，或大于约0.8mm，或大于约0.9mm，或大于约1mm，或大于约2mm。
在本发明的制备颗粒的其他方面，方法可涉及使用在处理室中以可变的速度旋转的圆盘转子。
在其它方面，当第一干粉悬浮在流化床设备中向上运动的气柱中并且在圆盘转子中旋转时，将溶剂引入步骤(a)中，并且通过切向喷雾、顶部喷雾或底部喷雾引入溶剂。在另一方面，溶剂引入步骤(a)的速率可介于约1gm/min至最高约30gm/min之间。在一个特定方面，溶剂引入步骤(a)的速率可为约5gm/min。
本发明的第五方面提供了制备颗粒的方法，其中入口气体的温度可为约20℃至30℃。在一个特定方面，入口气体的温度可为约25℃。在另一方面，颗粒温度可保持为约20℃至30℃。在另一方面，用于干燥颗粒的温度可为约50℃至60℃。并且在一个方面，颗粒可被干燥至含水量为约0.5％至3％。
本发明的第六方面提供了制备粒状基粉模块的方法，该方法包括：a)使第一干粉悬浮在流化床设备中向上运动的气柱中，并且在圆盘转子中旋转；b)将溶剂和任选的第二干粉引入步骤(a)的流化床设备中，使得可形成基粉模块的颗粒；以及c)使颗粒干燥，其中第一干粉、第二干粉或溶剂包含粘结剂、赋形剂或两者。
本发明的另一方面提供了制备粒状基粉模块的方法，其中模块可选自由以下项组成的组：一种或多种水溶性维生素、一种或多种酸溶性维生素、一种或多种中性可溶性维生素、一种或多种酸溶性氨基酸、一种或多种碱溶性氨基酸、一种或多种中性水溶性氨基酸、一种或多种水溶性无机盐、一种或多种无机酸溶性盐、一种或多种糖、一种或多种酸溶性痕量元素、一种或多种醇溶性多胺、一种或多种醇溶性脂类和一种或多种缓冲盐。在本发明的一个方面，水溶性或酸溶性或碱溶性或中性可溶性维生素模块、水溶性或酸溶性或碱溶性或中性可溶性氨基酸模块，或水溶性或酸溶性或碱溶性或中性可溶性盐模块包含至少一种水不溶性赋形剂或水不溶性粘结剂或两者。
在另一方面，粒状基粉模块可选自由以下项组成的组：一个或多个水溶性组、一个或多个碱溶性组、一个或多个酸溶性组、一个或多个酸溶性反应性组、一个或多个醇溶性组、一个或多个醇溶性反应性组和一个或多个ph改性剂组。在一个特定方面，水溶性组可选自由以下项组成的组：维生素、本体无机盐和糖。
本发明的第七方面提供了通过上述方法中的任一者获得或可获得的颗粒。
在第八方面，本发明可涉及粒状细胞培养基、补料、补充剂或添加剂，其包含一种或多种氨基酸、一种或多种粘结剂或赋形剂和一种或多种痕量组分。
在一个实施方案中，粒状细胞培养基、补料、补充剂或添加剂还包含维生素。在一个具体实施方案中，维生素选自维生素b12、生物素、胆碱、叶酸、烟酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺素、抗坏血酸、对氨基苯甲酸(paba)等中的一者或多者。
在另一方面，粒状细胞培养基、补料、补充剂或添加剂还包含盐。在一个实施方案中，盐选自缓冲盐、铁盐、锌盐、钙盐、铜盐、镁盐、锰盐、铵盐、钒盐等中的一者或多者。
在另一方面，粒状细胞培养基、补料、补充剂或添加剂包含氨基酸，这些氨基酸选自熟知的二十种氨基酸、它们的盐或其衍生物中的一者或多者。在一个实施方案中，氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、酪氨酸、半胱氨酸和赖氨酸中的一者或多者。
在第九方面，本发明可涉及权利要求的粒状细胞培养基、补料、补充剂或添加剂，其包含粘结剂或赋形剂，它们在整个说明书中可互换使用或一起使用。在一个实施方案中，粘结剂或赋形剂选自由以下项组成的组：糖、天然物质、合成物质和半合成物质、微晶纤维素、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、单糖、二糖和低聚糖、赋形剂和/或崩解剂。在一个具体实施方案中，粘结剂为微晶纤维素和葡萄糖。在另一个实施方案中，颗粒中的一种或多种粘结剂的组成百分比可为约0.1％至约100％。在一个具体实施方案中，颗粒中的一种或多种粘结剂的组成百分比可为约30％至约60％。
在第十方面，整个本发明所述的组合物可涉及权利要求的粒状细胞培养基、补料、补充剂或添加剂，其包含25-40％氨基酸、20-65％粘结剂、1-5％维生素、2-10％盐、0.01-0.05％痕量组分中的一者或多者。在一个具体实施方案中，颗粒组合物包含31-32％氨基酸、59-60％粘结剂、25％维生素、6-7％盐、0.01-0.05％痕量组分中的一者或多者。在一种优选组合物中，粘结剂为d-葡萄糖。
在第十一方面，本发明提供了生产营养培养基颗粒、营养培养基补充剂颗粒、营养培养基子组颗粒或缓冲颗粒的方法，该方法包括：使干粉培养基、补充剂、培养基子组或培养基缓冲液与溶剂团聚，并且使用流化床中的旋转盘形成颗粒，其中颗粒包含粘结剂或赋形剂。
本发明的另一方面提供了生产营养培养基颗粒、营养培养基补充剂颗粒、营养培养基子组颗粒或缓冲颗粒的方法，其中粘结剂或赋形剂可在制粒之前通过溶剂喷入或混入干粉中。在一个具体实施方案中，粘结剂可为糖，并且在一个优选实施方案中，糖包括d-葡萄糖。可改变粘结剂例如葡萄糖的百分比以实现差异化的颗粒大小，或可变的体密度，或可变的休止角或干燥度。例如，在一些实施方案中，量可在0-60％，或10-16％，或20-60％、优选地30-40％、40-50％、30-35％、30-45％、40-50％、40-55％等之间变化，以实现期望的特性。
在另一方面，在上述所有变型形式中，本发明可涉及通过上述方法中的任一者获得或可获得的颗粒。
在第十二方面，本发明提供了制备用于培养细胞的颗粒的方法，这些方法包括：制备干粉培养基或模块的微悬浮液；通过挤出装置挤出微悬浮液以形成液滴；使液滴干燥成颗粒。一个方面可涉及由此获得的颗粒。
第十三方面可涉及通过上述权利要求中任一项所获得的颗粒用于培养细胞的用途。在一个实施方案中，细胞可选自由以下项组成的组：真核生物、原核生物、动物、植物、真菌、藻类、昆虫、酵母，或者其中细胞可用于培养病毒或病毒颗粒。在一个具体实施方案中，细胞可为动物细胞。在另一个实施方案中，细胞可为哺乳动物细胞。在一个具体实施方案中，哺乳动物细胞可选自由以下项组成的组：cho、bhk、hek、293、vero等。
在第十四方面，本发明提供了在由上述方法获得或可获得的任何颗粒复溶的液体中培养细胞的方法，该方法包括：i)将颗粒复溶于合适的液体或缓冲液中；其中所述颗粒为细胞培养基、补料、补充剂或浓缩物；ii)在有利于细胞的生长的条件下，在复溶的液体中培养细胞。在一个实施方案中，细胞可选自由以下项组成的组：真核生物、原核生物、动物、植物、真菌、藻类、昆虫、酵母，或者其中细胞可用于培养病毒或病毒颗粒。在另一个实施方案中，可进行培养以生产增加的量的多肽。在另一个实施方案中，多肽可为重组多肽。在另一个实施方案中，该培养相比于利用并非由颗粒制成的液体培养基进行培养，增加了产物生产并且加快了细胞生长。
在第十四方面，本发明提供了试剂盒，这些试剂盒包括：i)第一容器，该第一容器包含通过上述方法获得或可获得的颗粒，其中所述颗粒可为细胞培养基、补料、补充剂或浓缩物；ii)使用颗粒的说明。在其它方面，试剂盒还可包含附加的容器，这些容器中的每个可包含用于培养的细胞、缓冲液以及包括其他组分，这些组分包括其他培养基(液体或干粉，agt形式)、添加剂、补料、抗生素等。
在第十五方面，本发明提供了体系，这些体系包含由上述颗粒复溶的液体培养基/补料/补充剂/添加剂，该液体培养基/补料/补充剂/添加剂可通过上述方法中的任一者获得，并且这些体系包含细胞。在一个实施方案中，细胞可选自由以下项组成的组：真核生物、原核生物、动物、植物、真菌、藻类、昆虫、酵母，或者其中细胞可用于培养病毒或病毒颗粒。在另一个实施方案中，由颗粒复溶的液体培养基/补料/补充剂/添加剂可用于培养产生重组多肽、病毒、分泌蛋白的细胞或处于悬浮液中的细胞或贴壁细胞。
以引用的方式并入
本说明书中提及的所有公开案、专利和专利申请以引用方式并入本文，就像每个单独的公开案、专利或专利申请被具体和单独地指明以引用方式并入本文中一样。如发生矛盾，以本说明书及其所包括的定义为准。本专利申请中的任何参考文献的引用或标识不应被解释为对此参考文献作为本发明的现有技术的认可。
附图简略说明
本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。参考以下具体实施方式，将更好地理解本发明的特征和优点，具体实施方式列出了采用本发明原理的例示性实施方案。本领域的技术人员将理解，这里描述的附图仅用于说明性目的，并不旨在以任何方式限制本教导内容的范围。
图1a：手工制备的颗粒或珠粒，此处示出颗粒补料1。详细制备方法在实施例1中有所描述。1b：颗粒补料1的目视大小估计。1c：颗粒或珠粒补料1的目视大小比较。
图2a：手工颗粒补料1补充剂与液体补充剂的细胞活性测定结果比较。手工制备的颗粒补料1(试样)的活性如曲线珠粒1、2、3所示；液体(阳性对照品)的活性如液体1、2、3所示；无补充剂样品(阴性对照品)的活性如阴性对照1、2、3所示。补充以颗粒补料1的细胞培养基(重复三次：1、2、3)相比于补充以液体的细胞培养基(重复三次：1、2、3)表现出更出色的存活率％，尤其是在第8天至第16天。
图2b：手工颗粒补料1补充剂与液体补充剂的细胞生长测定结果比较。补充以颗粒补料1的细胞培养基(重复三次：1、2、3)相比于补充以液体的细胞培养基(重复三次：1、2、3)在15天的培养期内表现出相当的细胞生长结果。
图2c：比较手工制备的颗粒补料1补充剂与液体补充剂用于抗体生产的细胞性能或蛋白滴度测定。手工颗粒的蛋白滴度(细胞性能)如曲线珠粒1、2、3所示；液体(阳性对照品)的蛋白滴度如液体(重复三次：1、2、3)所示；无补充剂样品(阴性对照品)的蛋白滴度如阴性对照(重复三次：1、2、3)所示。在15天的培养期内，补充以珠粒/颗粒1、2、3的细胞培养基表现出的igg产量为约325μg/ml(产量)，略低于阳性液体对照品efb(重复三次：1、2、3)的产量(约425μg/ml)。无补充剂阴性对照品相比于补充以补料1珠粒(试样)表现出远低的igg产量(约100μg/ml)。
图3a：使用转盘技术由碎粉(原料)和颗粒补料2(在附图/专利申请中有时也称为补料2)制得的自动化颗粒制剂物或珠粒的显微镜放大图片。详细制备方法在实施例中有所描述。
图3b：由转盘技术制得的颗粒补料2的粒度估计。
图3c：自动化颗粒补料2与液体补充剂的细胞生长测定结果比较。补充以珠粒/颗粒的细胞培养基相比于补充以液体的细胞培养基在15天的培养期内表现出相当的细胞生长结果。颗粒补料2表现出可变的细胞计数为约10x10e6细胞/毫升(生长)，略高于补充以阳性对照补料的细胞培养基(约8x10e6)。
图4a：使用转盘技术由碎粉(原料)和颗粒补料3(在附图/专利申请中有时称为补料3)制得的自动化颗粒制剂物或珠粒的显微镜放大图片。详细制备方法在实施例中有所描述。
图4b：由转盘技术制得的颗粒补料3的粒度估计。
图4c：自动化颗粒补料3与液体补充剂的细胞生长测定结果比较。在14天的培养期内，补充以颗粒补料3的细胞培养基与阳性对照品表现出相当的细胞生长结果，尤其是与阳性对照品相比(7天之后)。颗粒补料3表现出可变的细胞计数为约9x10e6细胞/毫升(生长)，略高于补充以阳性对照补料的细胞培养基(约8x10e6)。
图5a：使用转盘技术由碎粉(原料)和颗粒补料4制得的自动化颗粒制剂物或珠粒的显微镜放大图片，并且其中起始干基粉末包含纤维素粘结剂。它在附图/专利申请中有时称为补料4。详细制备方法在实施例中有所描述。
图5b：由转盘技术制得的颗粒补料4的粒度估计，其中起始干基粉末包含纤维素粘结剂。颗粒补料4的图显示了在起始组合物经过纤维素化学改性(以降低水溶性)时的结果。颗粒粒径相比于补料2和3较小。
图5c：自动化颗粒补料4与液体补充剂的细胞生长测定结果比较。在14天的培养期内，补充以颗粒补料4的细胞培养基与阳性对照品表现出相当的细胞生长结果，尤其是与阳性对照品相比(7天之后)。
图6a：使用转盘技术由碎粉(原料)和颗粒补料5制得的自动化颗粒制剂物或珠粒的显微镜放大图片，并且其中起始干基粉末在用于制粒过程之前首先微粉化为更小的粒度。它在附图/专利申请中有时称为补料5。详细制备方法在实施例中有所描述。
图6b：由转盘技术制得的颗粒补料5的粒度估计，其中起始干基粉末首先微粉化为更小的粒度。图中显示了在起始组合物经过物理改性(减小粒度)时的结果。粒度更均一。
图7a：颗粒补料的生物学评估。对颗粒补料2、3和4进行活性测定，并且与阳性对照品(包含液体补料补充剂)或阴性对照品(不含液体或颗粒补充剂)进行比较。如图中所示，补料2、3和4非常类似于阳性对照品并且优于阴性对照品，尤其是在第6天之后。颗粒补料5的细胞活性测定与补料2、3和4(未示出数据)产生了类似的结果。
图7b：颗粒补料的生物学评估。对颗粒补料2、3和4进行细胞性能(抗体产量)测定，并且与阳性对照品(包含液体补料补充剂)或阴性对照品(不含液体或颗粒补充剂)进行比较。如图中所示，补料2、3和4非常类似于阳性对照品并且优于阴性对照品，尤其是在第4天之后。补充以颗粒补料2的细胞培养基(约229μg/ml)表现出的igg产量与通过阳性对照补料产生的igg产量(约228μg/ml，第14天)相当；补充以颗粒补料3的细胞培养基(约243μg/ml)表现出的igg产量略高于阳性对照补料；并且补充以颗粒补料4的细胞培养基(约200μg/ml)表现出的igg产量略低于阳性对照补料。无补充剂的细胞培养基测定(阴性对照品)相比于补充以任何颗粒补料2、3或4的细胞培养基表现出远低的igg(约100μg/ml)。颗粒补料5的细胞性能(抗体产量)测定与补料2、3和4(未示出数据)产生了类似的结果。
图8：颗粒制备过程：通过在流化转子中润湿干粉发生制粒。在示例性制粒过程中，对培养基组分称重，分为单独的组，以便限制预处理相互作用。将用于干粉的组与那些组分隔离，它们将喷入流化粉末中。干粉或喷雾溶液或两者将包含粘结剂。配制喷雾溶液，研磨干粉组分并且将其混合均匀。此处，由粉末直接制粒的过程采用转子技术。
图9a和图9b：用于制备模块化培养基、补料或补充剂颗粒的示例性组分或组合。根据它们的性质如溶解性或其与其它组分反应的趋势进行分类。一般来讲，不良反应物保持分离直到最终阶段，当它们混合在一起时，小心操作以防止沉淀，或者当颗粒最终复溶于液体中时形成加合物(这将导致产物无用)。示例性类别为中性可溶性组分、碱溶性组分、酸溶性组分。
图10：一种用于制备模块化培养基的示例性方法，其中首先加入酸溶性(本体)物料，然后加入基础中性物料，最终加入痕量金属物料。在一个实施方案中，每种物料(酸溶性、碱溶性或中性可溶性)可单独制粒。在另一个实施方案中，物料作为粉末依次加入，然后一起制粒以形成复合颗粒。在另一个实施方案中，单个酸溶性物料或酸溶性物料的组合如特定的酸溶性氨基酸或氨基酸的组合，或者单个碱溶性物料或碱溶性物料的组合，或者单个中性可溶性物料或中性可溶性物料的组合，可形成颗粒。请注意，本文所述的添加顺序(首先加入酸溶性物料，然后加入碱溶性物料，最后加入中性可溶性物料)仅为示例性的。添加或混合顺序可根据需要改变，并且可取决于制剂或产生不利反应的组分的存在。
具体实施方式
本发明涉及生产干粉培养基的方法。本公开中提及的干粉培养基可以指干粉培养基(基础培养基或完全培养基)、干燥的浓缩细胞培养基、干粉补料或补充剂、干粉浓缩补料或补充剂、干燥缓冲粉末，其在培养细胞时可组合使用或部分使用或单独使用(当它是完整培养基时)。一般来讲，培养是指体外培养细胞。根据本发明所述的粒状培养基或补料制备方法如下文所述。
细胞培养基生物治疗生产的典型工作流程需要露天分配、干粉培养基的复溶、附加的配制步骤，然后进行ph/渗透压调节，过滤并转移至生物反应器。这种多步方法可能通过错误配制或通过不需要的外源因子(例如，细菌、病毒、支原体等)的污染而引入风险。
针对上述问题的一种可取的解决方案是以干燥形式提供完全细胞培养基或补料作为补充剂，使得培养基或补料在加入生物反应器之前可在“封闭系统”中发生水合。本发明涉及流化床制粒基础培养基或完全细胞培养基粉末、补料粉末、补充剂粉末、缓冲粉末、维生素粉末、添加剂粉末等，用于制备颗粒或微粒形式，其能够容易地用于此类“封闭系统”。将粉末化细胞培养基粉末用作具有紧凑大小的“微粒”，其具有良好的流动性，相比于具有四处飞扬的细粉颗粒而导致材料损失的干粉，更容易复溶于用于生物药物生产的液体中。
流化床制粒方法可能改造自制药行业；药物组合物在组合物中包含两种至多种成分。例如，药物组合物可能包含一种至最多十种组分。另一方面，用于培养细胞、具体地用于培养动物细胞、更具体地用于培养哺乳动物细胞、更具体地用于生产重组蛋白和疫苗的重组细胞的细胞培养基粉末、补料粉末、补充剂粉末非常复杂，因为它们通常包含80至100种单独的组分，每种组分都需要精确的量。培养基组分中的一部分如盐或金属离子在制造过程中可具有反应性，并且可在所得的组合物中形成用于细胞培养基的加合物或其它不期望的物质。因此，对于任何制造过程之后得到的培养基，可严格评估其物理、化学和生物特性(细胞培养基生长力和性能)。因此，将来自制药行业的任何制粒方法应用于细胞培养基组合物并不简单。由于与方法相关联的此类复杂性，尚未实现通过手工或自动化工艺制造细胞培养基颗粒或微粒。事实上，即使在最初尝试培养基制粒过程中，也得到了不期望的发粘的类似于太妃糖的物质或者具有较差流动性的过湿的培养基材料。精确使用药物制粒方法(其设计用于较少的化学品、药物)可导致所得的培养基或补料无用，虽然可能获得良好的微粒/颗粒，但是如果颗粒无法保持细胞活性和生长力，或者无法维持/改善细胞性能，则无法实现最终目的。因此，在本发明之前，仍然需要颗粒培养基组合物和用于制备粒状细胞培养基组合物(培养基、补料、补充剂、添加剂等)。
本文所述的粒状培养基可通过在可旋转的处理室中将包含氨基酸、糖、维生素、痕量金属盐、缓冲剂的混合粉末化media组分制粒而获得，其中可在温和的温度下逐渐引入附加的粉状培养基组分和/或溶剂。引入制粒混合粉状培养基组分中的溶剂可呈温和的薄雾、蒸汽、露水、喷雾、细液滴的形式或作为液-气界面。
在一个实施方案中，培养基/补料颗粒可通过手工方法制成。一种示例性手工方法在实施例1和实施例2中有所描述，其可以仅仅是本教导内容的示例，并且不应该被解释为限制手工制备培养基/补料颗粒方法的范围。
在另一个实施方案中，培养基/补料颗粒可通过自动化方法制成。在自动化方法中，可在流化床设备中使用转子技术，该流化床设备在本文中也称为处理室。对本领域的技术人员来说显而易见的是，在流化处理室中可使用任何转子/旋转装置。使用的术语“转盘”或“转子技术”或“原子化器转子”不应被解释为用于限制目的。许多等效的技术可实现类似的结果：例如，也可应用“转盘”、“转盘过滤”、“快速旋转制粒圆盘”等，并且本领域的技术人员将相应地应用这些原理。用于旋转的“转子”的构造不应该被解释为限制性的；辊可通过任何方式安装在流化床设备中以实现类似的结果。
不受理论限制，流化系统能够在流化室(或处理室)中形成蓬松的培养基/补料粒子。不必由培养基种子粒子开始形成颗粒，但是如有必要可使用种子粒子。室中颗粒的附加旋转步骤引起颗粒与容器壁和/或容器挡板接触，并且使粉末积聚在蓬松的粒子上以形成颗粒。这类似于堆积的雪球滚下山坡，在雪崩中积累更多的粉末和雪，其尺寸随着越来越多的堆积而增加。随着干粉粒子的旋转，在合适的条件下，形成良好尺寸的颗粒。在一个示例性实施方案中，利用购自美国新泽西州格拉特技术公司(glatttechnologies,nj)的流化转子室来制备培养基/补料颗粒。使用转子/流化床室的制粒技术是制药行业中所熟知的。然而，如前文所述，药物组合物在组合物中包含两种至多种成分。例如，药物组合物可能包含一种至最多十种组分。另一方面，用于培养细胞、具体地用于培养动物细胞、更具体地用于培养哺乳动物细胞、更具体地用于生产重组蛋白和疫苗的重组细胞的细胞培养基粉末、补料粉末、补充剂粉末非常复杂，因为它们通常包含80至100种单独的组分，其中每种组分都需要精确的量。培养基组分中的一部分如盐或金属离子在制造过程中可具有反应性，形成加合物或其它不期望的物质。因此，将来自制药行业的任何制粒方法应用于细胞培养基组合物并不简单。由于与方法相关联的此类复杂性，尚未实现通过手工或自动化工艺制造细胞培养基颗粒或微粒。事实上，即使在最初尝试培养基制粒过程中，也得到了不期望的发粘的类似于太妃糖的物质或者具有较差流动性的过湿的培养基材料。此外，药物制粒方法(其设计用于较少的化学品、药物)可导致所得的培养基或补料无用，虽然可获得良好的微粒/颗粒，但是如果颗粒无法保持细胞活性和生长，或者无法维持/改善细胞性能，则无法实现最终目的。因此，在本发明之前，仍然需要颗粒培养基组合物和用于制备粒状细胞培养基组合物。
本文所述的粒状培养基/补料不同于上文所述及其它地方所提及的公开(并且通过引用并入本文)所述的团聚培养基，因为它们由旋转室中的转子技术(旋转，粒度积聚)而制粒，该旋转室中包含或不含挡板和其它装置来增强粒度积聚的过程。
用于本文所述的颗粒组合物的粘结剂可发粘并且使颗粒具有粘结特性。粘结剂可为糖、任何天然粘结剂或者合成或半合成聚合物。糖可以干燥形式或液体形式使用，还包括但不限于葡萄糖(任何d型或l型)、蔗糖(任何d型或l型)、任何单糖、二糖、低聚糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖或任何芳香糖。天然粘结剂能够以干燥形式、湿形式或糊剂形式使用，并且包括但不限于纤维素、淀粉、预糊化淀粉、非糖如阿拉伯胶、明胶、海藻酸、黄蓍胶及本领域中已知的其它粘结剂。合成或半合成聚合物包括但不限于甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷、聚乙二醇及本领域中已知的聚合物(粘结剂如http://www.pharmainfo.net/binders所述，其可以互换使用，据此以引用方式并入本文)。在某些情况下，“赋形剂”可在制备颗粒之前添加到基粉中。赋形剂为非活性物质(即，它们不影响细胞生长或培养)，可用作媒介以向细胞提供培养基中其它可用的物质。赋形剂还可用作溶解度调节剂、用作崩解剂、用作涂覆培养基颗粒的障碍物(例如，膜涂层、惰性物质等)。赋形剂的示例包括但不限于聚合物或微晶纤维素、结晶盐、糖、缓冲液等。一些物质可被视为粘结剂或赋形剂，因此术语“粘结剂”和“赋形剂”可在本公开中互换使用，但是本领域的技术人员应当理解。在某些实施方案中，崩解剂可通过干粉或溶剂引入颗粒中；并且可形成颗粒粒子的1-10％；崩解剂可包括但不限于交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素等。
在一些实施方案中，喷雾速率可为由干粉培养基或补料形成颗粒的因素。细胞培养基补料，尤其是培养基，具有多种成分(最多100种组分)。这些成分中的一部分为高度水溶性的，而其它成分水溶性较差，并且其它成分为发粘的或具有粘性的。这种化学性质的组合对补料或培养基形成颗粒提出了挑战(与药物组合较少相反)。例如，对于某些制剂，将过多的水喷到干培养基/补料粉末上或其它制剂中时，如果喷雾速率太快，则其中的高水溶性化合物可能开始溶解，从而可能阻止颗粒的形成。虽然最佳的初始溶解水平对于颗粒形成可能是必要的，但是润湿混合物最初可能导致粉末变粘。同样，如果处于最佳状态，则粘性可导致良好的颗粒。然而，在某些情况下，观察到粘性过高(仅适用于某些制剂，由于溶剂过量或喷雾速率快等)可能导致具有类似于太妃糖的稠度的干细胞培养基组分，而不是形成颗粒。例如，在一个失败的实施方案中，包含微晶纤维素(40％)的基粉使用40gm/min的喷雾速率并且导致具有类似于太妃糖的稠度的干细胞培养基组分，而不是形成颗粒。基于本文所述的教导内容，本领域的技术人员应当理解约束条件并且能够使用详细描述和示出的教导内容获得粒状形式的培养基/补料。
粘结剂和/或赋形剂可混入基础碎粉中，和/或可与粉末喷入处理室中。在本文所述的实施例中，这些实施例不可被视为限制性的，可采用各种条件获得颗粒：例如，按照下文所详述的方法获得颗粒补料2、颗粒补料3、颗粒补料4和颗粒补料5。在下列测定中对由此获得的颗粒进行评估：1)物理特性(见显微镜照片和粒度分布：例如，见图3a和图3b、图4a和图4b、图5a和图5b以及图6a和图6b)；2)以及制粒前后的分析含量。该测定通过hplc分析完成；即，在制粒前后分析培养基组分如氨基酸含量、水溶性维生素含量、疏水性氨基酸含量等(未示出数据)。补料2、3、4和5中的每一者的分析数据是相当的，使得制粒前后的分析数据未表现出显著变化；以及3)其生物学活性，细胞培养基中的性能(见图3至图7；对于每种补料颗粒，适用c小节)。
培养基或补料颗粒在细胞培养基中可具有各种应用。例如，在一些实施例中，范围从约0至500微米的颗粒大小可以用于制备用于细胞培养的水基培养基/补料悬浮液。在其它实施方案中，粒度在约800微米至约500微米范围内的颗粒可用于制备在细胞培养基中使用的微粒培养基/补料片剂。在另一个实施方案中，粒度在约500微米至约2000微米范围内的颗粒可用于制备在细胞培养基中使用的培养基/补料胶囊。
应用范围：本发明的颗粒/微粒在各种真核和微生物细胞培养基中具有潜在用途。本发明的颗粒/微粒提供了几种新颖的递送选择，诸如：能够提供用于分批补料系统的单一单位剂量形式；能够用于灌注系统的营养物计量投加；能够生产由多组粒状营养物组成的模块化试剂盒的能力(例如，维生素颗粒、氨基酸颗粒等)；或者能够对颗粒组合物进行表面涂布(用聚合物膜)以用于控释应用。在一些实施方案中，可针对各种应用控制颗粒粒度：例如，粒度0至小于约500微米的颗粒可用于制备在细胞培养基中使用的水基培养基/补料；在其它实施方案中，粒度在约800微米至约500微米范围内的颗粒可用于制备在细胞培养基中使用的微粒培养基/补料片剂；在另一个实施方案中，粒度在约500微米至约2000微米范围内的颗粒可用于制备在细胞培养基中使用的培养基/补料胶囊。
本发明的一个方面提供了经历制粒的干粉制剂。本发明的另一方面提供了细胞培养基制剂，其中包含促进细胞的体外培养的所有必需的营养因子。本发明的一些实施方案提供了用于生产这些粒状培养基制剂的方法和装置。本发明的一些实施方案提供了用于补充这些及其它培养基制剂的方法的和装置。
根据本发明所述的细胞培养基可为维持和/或支持细胞体外生长的任何组分的混合物。细胞培养基可包含维持和/或支持细胞体外生长所必需的一些组分、部分组分或全部组分。当细胞培养基仅包含一些组分时，需要单独添加另外的组分。根据本发明所述的细胞培养基的示例为完全培养基、培养基补充剂或补料，其中完全培养基包含维持和/或支持细胞的体外生长所必需的所有组分。在一个优选的实施方案中，细胞培养基可为完全培养基。需要新的干粉培养基形式。
本发明的细胞培养基可维持和/或支持细胞在培养皿、烧瓶、生物反应器或任何细胞培养基系统或容器诸如一次性袋中的生长。在一个优选的实施方案中，细胞培养基可为化学限定细胞培养基。化学限定细胞培养基为不含任何化学上不确定的物质的细胞培养基。这意味着用于生产培养基的每种化学品的化学组成和结构可在数量和特性上是已知的。化学限定培养基不包含植物、动物、酵母、真菌来源的提取物或水解产物；或者其不包含血清、血清组分、条件培养基、消化物、细胞提取物、补料器细胞或可能导致培养基中任何组分具有较差化学特性的组分。有时，化学限定培养基可定义为包含已知量的可追溯来源的确定的肽或确定的蛋白质。
定义
如本文所用的术语“颗粒”或“微粒”是指“细胞培养基组合物”，其通过任何制粒过程被压实以改善外观、混合特性、增加粒度、避免浑浊、制备更致密的材料、减少培养基组分的分离并且一般地改善细培养基粉末的理化特性。干颗粒还可提高粉末的流动性，并且消除任何培养基容器入口和出口的堵塞等不可取的特性，其中培养基容器例如生物反应器、培养基袋、培养基仓或培养基混合器设备等。
如本文所用的术语“粉末”或“干粉”是指用于细胞培养基的培养基粉末或粉状培养基组合物，其以干颗粒形式存在，其肉眼外观可自由流动。术语“粉末”包括团聚粉末。如本文所用的术语“基粉”或“干燥基粉”一般是指在其可制粒之前的起始干粉组合物。如本文所用的术语“基粉”或“干燥基粉”或“干粉”可互换使用，并且根据上下文，可指在其可制粒之前的起始干粉，或者仅仅是本文所用的“干粉”是指这些。除非另有说明，否则这可能并不意味着该材料可能完全不含络合的或团聚的溶剂。
术语“细胞培养基组合物”或“粉状培养基组合物”或“培养基粉末”或“干粉制剂”或“培养基制剂”可互换使用，并且在广义上包括例如培养基、培养基补充剂、培养基子组或本发明的缓冲液，并且可不限于基础培养基、完全培养基、培养基补料、培养基补充剂、培养基添加剂、浓缩培养基、浓缩补充剂和补料、氨基酸或氨基酸组、短肽、维生素、缓冲液、盐、痕量组分等。这些术语一般指在细胞培养期间添加的组分，并且熟练的技术人员将清楚地理解何时或如何使用这些术语。
术语“成分”是指可用于细胞培养基以维持或促进细胞增殖生长的任何化学或生物来源的化合物。术语“组分”、“营养物质”和“成分”可互换使用，并且都是指此类化合物。在细胞培养基中使用的典型成分包括氨基酸、盐、金属、糖类、碳水化合物、脂类、核酸、激素、维生素、脂肪酸、蛋白质等。根据特定的需要，本领域的技术人员可选择促进或维持细胞离体培养的其它成分。
短语“细胞培养基”、“培养基”和“培养基制剂”是指支持细胞培养和/或生长的营养液；这些短语可互换使用。细胞培养基可能为基础培养基(需要附加成分来支持细胞生长的一般培养基)，或是具有支持细胞生长的全部或几乎全部成分的完全培养基。细胞培养基可能无血清、无蛋白(一者或两者)，可需要或不需要附加组分，如生长因子、添加剂、补料、补充剂，以获得高效稳定的细胞性能。
术语“结合”是指成分在细胞培养基制剂中的混合或掺和。可以以液体或粉末形式或与一种或多种粉末和一种或多种液体发生结合。在另一个实施例中，两种或多种粉状组分可混合，然后团聚以产生复杂的混合物，诸如培养基、培养基补充剂、培养基子组或缓冲液。
术语“接触”是指将待培养的细胞放入具有在其中培养细胞的培养基的培养容器中。术语“接触”特别涵盖使细胞与培养基混合、用培养基灌注细胞、将培养基移液到培养容器中的细胞上以及将细胞浸没在培养基中。“分批补料”定义了一种将本发明的组合物提供给细胞的方法，该方法使得试剂的浓度为单独添加试剂的添加剂。
当补料或补充剂加入标准培养容器中的细胞时，可能有利于细胞的维持，或扩增，或生长，或活性，或影响其细胞性能，或延长培养寿命或使细胞维持在伪静止期，其中产物表达继续，或导致最终产物效价显著增加。“补料”或“补充剂”可在本公开中互换使用，并且是指包含重新平衡或补充或调节细胞在培养基或细胞培养基体系中的生长或性能所需的一种或多种氨基酸、糖、维生素、缓冲液、有时包括肽、水解产物、馏分、生长因子、激素等的粉末和液体形式(包括团聚形式)的培养基组分。补料或补充剂可与细胞培养基区分开，因为它加入可培养细胞的细胞培养基中。本领域的技术人员应当理解，有时补料/补充剂可主要包括重新平衡或补充或调节细胞在培养基或细胞培养基体系中的生长或性能所需的那些氨基酸、糖、维生素、缓冲液等。补料或补充剂可经过或不经浓缩，并且可以仅针对某些组分经过部分浓缩。术语“补料”或“补充剂”是指加入标准细胞培养基中时增强细胞生长、培养基寿命和产物表达的物质。提供的实施例表明，补充剂在抗体生产中可能特别有效。另选地，补料或补充剂可用于杂交瘤细胞系，培养用于疫苗生产的病毒的细胞系等。
术语“细胞性能”意指体外培养细胞并且通过本领域的技术人员已知的任何标准参数进行评估，其中包括但不限于以下一项或多项：细胞活性、细胞计数/数目、蛋白质表达、dna估计、蛋白滴度测量、重组多肽或蛋白质生产、多肽或蛋白质生产分泌、病毒或病毒颗粒生产、分泌蛋白质、细胞是否产生/分泌目标蛋白质、细胞标记物的检测、细胞处于悬浮液液中还是为贴壁细胞等。一般来讲，当细胞性能的评价是当最终产物由于形式的添加或改变(例如，对于超过控制(液体)形式的颗粒；包含补料或不含补料的培养基等)时，对细胞性能进行评估。
所谓“溶剂”是指水(蒸馏水和/或去离子水，用于细胞培养基的
颗粒的粒度可通过激光散射法或通过在相对筛孔尺寸校准的筛网上的机械分离进行定量分析。一般来讲，根据美国标准化测量方法，粒度可以用微米、毫米或目尺寸来表示，下面提供了比较换算表。利用本公开所述的方法获得的颗粒可具有各种尺寸；在一些情况下，颗粒具有约0.05mm至7mm的尺寸。在一个特定方面，本发明提供的颗粒所具有的尺寸为约0.05mm至约0.5mm，或约0.05mm至约1mm，或约0.05mm至约2mm，或约0.05mm至约3mm，或约0.05mm至约4mm，或约0.05mm至约5mm，或约0.05mm至约6mm，或约0.05mm至约0.1mm，或约0.05mm至约0.2mm，或约0.05mm至约0.3mm，或约0.05mm至约0.4mm，或约0.1mm至约1mm，或约0.1mm至约2mm，或约0.1mm至约3mm，或约0.1mm至约4mm，或约0.1mm至约5mm，或约0.1mm至约6mm，或约0.5mm至约1mm，或约0.5mm至约2mm，或约0.5mm至约3mm，或约0.5mm至约4mm，或约0.5mm至约5mm，或约0.5mm至约6mm，或约0.5mm至约7mm，或约1mm至约2mm，或约1mm至约3mm，或约1mm至约4mm，或约1mm至约5mm，或约1mm至约6mm，或约1mm至约7mm。在一个具体实施方案中，本发明提供了颗粒制剂，其中大部分颗粒制剂具有的颗粒大小可大于约0.1mm，或大于约0.2mm，或大于约0.3mm，或大于约0.4mm，或大于约0.5mm，或大于约0.6mm，或大于约0.7mm，或大于约0.8mm，或大于约0.9mm，或大于约1mm，或大于约2mm。
待制粒的培养基制剂、培养基补料/补充剂和培养基亚组以及许多其它常用的动物细胞培养基是本领域中熟知的，并且可见于例如《gibco/brl目录和参考指南》(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(invitrogencorporation,carlsbad,california))和《西格玛动物细胞目录》(美国密苏里州圣路易斯的西格玛公司(sigma；st.louis,missouri))中。
已详细描述了团聚的培养基及其制剂，特别是在细胞培养基中使用的那些。流化床技术由原料产生具有改变的特性(特别是例如溶解度)的团聚粉末。在该技术的一般应用中，将粉末悬浮在向上运动的空气柱中，同时可将受控的确定量的液体注入粉末流中以产生润湿状态的粉末；然后可使用微热干燥材料，产生团聚的粉末。现有专利申请/专利中已经详细描述了团聚培养基/补料、营养粉、补充剂等的制备、它们的特性、配制团聚培养基/补料、营养粉、补充剂等的自动ph值和自动渗透压的方法：例如，美国专利申请nos.09/023,790；11/669,827；13/984,263；pct/us2012/024194；ep专利申请10175914.0；ep公开2778221，并且它们的公开内容全文以引用方式并入本文。用于分析体密度、休止角、团聚培养基的粒度的方法在例如美国专利申请no.11/669,827中有充分描述，该专利申请全文以引用方式并入本文。
待制粒的培养基/补料可具有最适合细胞培养或生长的ph，而无需调节液体培养基的ph。因此，本文定义为“自动调节ph的培养基”的此类培养基避免了在复溶后向培养基中"添加缓冲液并且在溶解缓冲液之后调节培养基的ph值的耗时且容易出错的步骤，并且在美国专利申请no.11/669,827中有充分描述，该专利申请全文以引用方式并入本文。例如，根据这些方法制得的哺乳动物细胞培养基在复溶时可具有约7.1至约7.5、更优选地约7.1至约7.4、并且最优选地约7.2至约7.4或约7.2至约7.3的ph。可通过调节培养基自身存在的缓冲系统来提供自动ph培养基，例如，相对形式的共轭酸-碱氨基酸。通过调节培养基中此类缓冲液的ph相对形式，本发明提供了自动ph培养基的制备方法，避免了在培养基复溶之前或之时和使用之前添加附加的缓冲液或ph调节剂以达到适当的ph水平的要求。例如，hepes钠盐(ph升高)和hepes-hcl(降低ph)是ph相对组分的示例。一元、二元和/或三元缓冲盐是ph相对组分的其它示例。通常使用一元、二元和三元磷酸盐，但是也可以适当的比例使用其它盐。
“微悬浮液”：在用于制粒之前(见实施例1)，可将一种或多种细胞培养基组分或基粉以期望的浓度溶解、悬浮、胶体化或以其它方式引入溶剂中。
采用本文所述的培养基补充剂生长细胞的方法使得它们能够在培养开始时包括在培养基中，或者可通过分批补料或以连续方式添加。所得的培养基可用于各种培养方法，包括但不限于批量、分批补料、恒化器和灌注，以及各种细胞培养基硬件，包括但不限于静止烧瓶、搅动烧瓶、旋转烧瓶、搅拌式发酵罐、气升式发酵罐、膜反应器(包括中空纤维、平膜板、外部回路灌流)，具有保持在固体支持物上或固定/包埋在微孔珠粒中的细胞的反应器，以及适用于期望的细胞系的生长或维持的任何其它构造。
可在由颗粒制得的复溶液体培养基中生长的细胞系可为真核生物、原核生物、动物、植物、真菌、藻类、昆虫或酵母细胞或用于培养病毒或病毒颗粒的细胞。示例性细胞包括但不限于角质形成细胞、内皮细胞、肝细胞、黑素细胞、cho细胞、bhk细胞、vero、293细胞、perc6、杂交瘤细胞、造血细胞、胚胎细胞、神经细胞等。
以低含量加入本发明的培养基中的附加组分可根据需要包括或可以不包括例如血清或血清组分、生长因子(例如，egf、afgf、bfgf、kgf、hgf、igf-1、igf-2、ngf、胰岛素等)、白细胞介素、集落刺激因子、干扰素、附着因子、细胞外基质组分(例如，胶原蛋白、层粘连蛋白、蛋白多糖、葡萄糖胺聚糖、纤连蛋白、玻连蛋白等)、脂类(诸如磷脂、胆固醇、牛胆固醇浓缩物、脂肪酸、鞘脂等)、肽(例如：二肽、三肽、四肽)、纯化或重组表达的蛋白质(例如：重组白蛋白、重组胰岛素)、水解产物(例如，植物如稻米、酵母、玉米、马铃薯)等。
实例
本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下利用本发明原理的实例可以更好地理解本发明的特征和优点。本领域技术人员将理解，这里描述的实例仅仅是本教导的方面，并且不应被解释为以任何方式限制本教导的范围。
细胞培养基、补料、补充剂或缓冲液的颗粒制造
本文描述了用于由细胞培养基、补料、缓冲液或补充剂的干粉制备颗粒的示例性方案。本领域技术人员可以广泛应用在这些程序和本文提到的设备中使用的原理以获得任何颗粒组合物。
实例1：由微悬浮液制造颗粒的手工方法
本文介绍了一种使用挤出工艺对补料进行制粒的手工方法。
1)在本例中，目录产品高效补料bagt(图1和图2中也称为补料1)[thermofisher目录号，团聚，#a2530]是起始基础研磨粉末。称取30g高效补料bagt(此处不使用磷酸钠)放入研钵中。磷酸盐可以含于配方中。
2)加入12.5mlwfi(水)。
3)使用绿色塑料柔软的刮刀，混合直到粉末被弄湿并开始“吸收”水并形成糊状物。彻底快速混合浆料以达到均匀。
4)如果需要制作具有粘性但可流动的混合物，将wfi加入微量混悬液并充分混合。如果需要，用研钵和研杵湿磨。湿磨使微量混悬液更均匀，并减少剧烈混合引起的气泡。
5)收集入容器内；使用刮刀将最后的微悬浮液“刮”到容器中(体积将为约29-30ml)。
6)用0.5ml注射器准备eppendorfrepeater-plus，用剪刀剪下末端约1/64”，同时确保切口距离活塞末端完全压下时的位置不要太远。
7)使用eppendorfrepeater-plus和定位于0.5(5μl)的0.5ml注射器，将微悬浮液缓慢拉入注射器。确保未有空气吸入注射器，因为空气存留于粘性微悬浮液中，并改变呈送体积。
8)多次按压eppendorf推杆以灌注注射器。微悬浮液流出注射器末端后，擦拭注射器末端。然后将注射器末端垂直靠近固体疏水表面(例如石蜡膜或蜡纸)，压下推杆并轻轻将液滴放在表面上。快速抬起，再次压下推杆，重复数次。重复操作可以快速进行。
9)置于通风橱18至24小时。参见图1a、1b、1c和图例。
10)收集颗粒，放入称量盘中，并置于caso4铺底的真空干燥室中。
11)让颗粒干燥48至72小时。由此获得的颗粒被称为粒料1或补料1或补料1颗粒，有时可互换使用。由3.0ml高效补料b补充物制备0.156g珠粒。参见图1a、1b和1c颗粒图片。珠子尺寸表形均匀并且量度在毫米范围。如实施例4中所述，使用所述珠粒进行活力、生长力和性能(蛋白滴度)测定。
实例2：手工制备的补料1颗粒的生物学评估
制备补料1珠粒(参见实施例1)并用于细胞活力、生长力和性能(蛋白质滴度)测定。补料1颗粒/珠粒结果与液体补充物(阳性对照；即#a2530在液体中复溶并在使用前无菌过滤)进行比较。对于测定，使dg44-igg细胞系在cd-opticho培养基(thermofisher目录#12681)中生长。用高效补料b(efb)(thermofisher目录#a2530)或补料1以颗粒形式(有时称为珠粒)或作为液体(阳性对照)补充培养物(如所指示的)。将细胞亚传代3次，持续3天，并且对于每个亚传代细胞，将细胞分成3×10e5个活细胞/ml。在第4次传代中，每日细胞计数被采用。每个条件一式三份(即曲线1、2、3)对于每种类型的补充物均重复三次。在图2a中，手工制备的颗粒(测试样品)的活力以曲线bead1,2,3(珠粒1、2、3)示出；液体活力(阳性对照)显示为liq1,2,3(液体1、2、3)；未补充(阴性对照)的活力显示于neg.cont.1,2,3(阴性对照1、2、3)。与efb液体形式相比，efb珠粒/颗粒浓度为等摩尔的。如图2a所示，与补充液体efb(1、2、3)的细胞培养相比，补充珠粒/颗粒efb(1、2、3)的细胞培养显示出更佳的存活力，尤其是从第8天至第16天。
将补料1颗粒/珠粒与细胞生长测定中的液体补充物(阳性对照)进行比较-图2b。这里也使用cd-opticho培养基(thermofisher目录#12681)中的dg44-igg细胞系。如上所述将细胞亚传代并分裂为2a。在第4次传代中，每日细胞计数被采用。每个条件一式三份(即曲线1、2、3)对于每种条件均重复三次。在图2b中，手工丸粒(测试样品)的生长显示在曲线珠粒1、2、3中；液体(阳性对照)的生长曲线显示在液体1、2、3；未补充(阴性对照)的生长曲线显示在neg.cont.1,2,3(阴性对照1,2,3)。与efb液体形式相比，efb珠粒/颗粒浓度为等摩尔的。如图2b所示，与补充液体的细胞培养(1、2、3)相比，补充有珠/沉淀物(1、2、3)的细胞培养在培养15天期间显示可比较的细胞生长。
将补料1颗粒/珠粒与细胞性能或蛋白滴度测定(测量抗体生产)中的液体补充物(阳性对照)进行比较-图2c。这里也使用cd-opticho培养基(thermofisher目录#12681)中的dg44-igg细胞系。如上所述将细胞亚传代并分裂为2a。在第4次传代中，每日细胞计数并监测igg产量。每个条件一式三份(即曲线1、2、3)对于每种条件均重复三次。如图2c所示，手工药丸的蛋白滴度(细胞性能)显示在曲线珠粒1、2、3；液体蛋白滴度(阳性对照)显示在液体1、2、3；未补充(阴性对照)的蛋白滴度显示在neg.cont.1,2,3(阴性对照1,2,3)。如图2c所示，培养15天，补充珠粒/颗粒1、2、3的细胞培养显示igg产量约325μg/ml(产量)略低于补充阳性液体对照efb(1、2、3)的约425μg/ml产生的igg。与补充efb珠粒的细胞培养(测试)相比，未补充的阴性对照显示出低得多的约100μg/ml的igg。
实例3：示例性的自动流化床制粒过程
本文呈现了用于制造颗粒的示例性自动化工艺。在本发明中，转子技术用于流化床装置/处理室(例如，新泽西州的格拉特技术公司(glatttechnologies,nj))。任何具有流化床附件的旋转处理室都可以适用于制造细胞培养基颗粒。将起始干粉(细胞培养基、补料等)装入通过旋转移动并流入流化床设备的流化床设备的转子盘上。在这种情况下，在控制的温度下，以受控的速率，有时间歇地，小心地引入液体(例如细喷雾、雾、蒸汽、水珠、凝液或微小液滴)，使得生成干粉的颗粒。通常，也可以使用其他自动设备来制造颗粒；这些包括但不限于：研磨设备、微粉化器、流化床处理器、旋转盘式叶轮、用于溶剂的喷雾器等。参见图8以了解用于培养基的制粒的示例性工作流程。在一个具体的实施方案中，颗粒如下形成：
a.从磨碎的干基粉末开始(不是粒状的)。任选地，基础粉末可能用合适的溶剂预润湿。干粉可以含有或不含粘结剂和/或赋形剂。另外，进行喷雾的溶剂可以含有或不含有粘结剂和/或赋形剂。
b.如果在干基粉末中不存在粘结剂和/或赋形剂，或者如果形成颗粒需要更多的粘结剂和/或赋形剂(比基粉中存在的粘结剂和/或赋形剂更多)，则进行喷雾的溶剂溶液将包含适量的和/或赋形剂。
c.本文描述了用于获得细胞培养补料颗粒的示例性工艺参数。这些参数被选用于测试的制剂。
i.喷雾速率：最优选5gm/min(喷雾速率范围：约1gm/min至约30gm/min，取决于制剂)
ii.进口温度–25℃(20-25℃)
iii.产品温度-(20-30℃)(因为培养基/补料含有温度敏感组分)
iv.风量(30-40m3/hr)
v.雾化气压-2bar
vi.流化床处理器中颗粒(50-60℃)的干燥温度(因为培养基含有温度敏感组分)。
实例4：用于自动化制粒过程的示例性培养基制备。
以下培养基组合物用于在自动化系统中制备颗粒。这些组合物仅用作例子，不应被解释为限制。
thermofisher目录产品pl002616p1是用于制备颗粒补料2、颗粒补料3、颗粒补料4和颗粒补料5的起始干基粉末。测试如下所述的示例性补料的制粒：
颗粒可以包含或可以不包含粘结剂和/或赋形剂，其可以掺入基础研磨的粉末中和/或可以与粉末一起喷射到处理室中。采用各种条件来获得颗粒：颗粒补料2、颗粒补料3、颗粒补料4和颗粒补料5如下有详细介绍。在三种类型的测定中评价由此获得的颗粒：1)物理特性(参见显微镜图片和粒径分布：图3a和3b，4a和4b，5a和5b以及6a和6b)；2)；它们的分析内容在制粒前后进行。通过hplc测试补料颗粒的化学组成并与磨碎的粉末起始材料进行比较。培养基成分的hplc分析，如氨基酸含量，水溶性维生素含量，疏水氨基酸含量等(数据未显示)，表明在制粒过程中进行加工和干燥步骤后，补料培养基中的多种成分保持在可接受的范围内。补料2、3、4和5中的每一个的制粒前后分析数据都是可比较的；以及3)它们在细胞培养中的生物学活性、性能(参见图3-7；对于每个补料颗粒，适用c小节)。
培养基或补料颗粒在细胞培养基中可具有各种应用。例如，在一些实施例中，范围从约0至500微米的颗粒大小可以用于制备用于细胞培养的水基培养基/补料悬浮液。在其它实施方案中，粒度在约800微米至约500微米范围内的颗粒可用于制备在细胞培养基中使用的微粒培养基/补料片剂。在另一个实施方案中，粒度在约500微米至约2000微米范围内的颗粒可用于制备在细胞培养基中使用的培养基/补料胶囊。下面提出了用于制备这种粒状补料的示例性制剂：
实例5：测量粉末物理特性的示例性方法
流量分析程序的示例性方法
此程序可用于流量分析和可测定的测量，包括fri(流量指数)；fdi(补料密度指数)；bdi(bin密度指数)；和spi(弹性密度指数)。
1.通过将合适的筛网夹在样品杯底部的支撑插件上，组装指示器(例如来自johansoninnovations，inc，sanluisobispo，ca的任何流速指示器系统)样品容器。
2.在适当的天平上去皮指示剂样品容器。
3.将约100克样品放入合适的容器中并利用汤匙或搅拌器将样品混合以充入空气。
4.用刮刀取出一部分样品，轻轻将样品放入组装的指示剂样品容器中，避免压缩样品。
5.重复添加样品直到颗粒样品溢出/填至指示剂样品容器上方。
6.将轻轻地刮平指示剂样品容器的顶部的颗粒样品，其方法是刮掉顶面多余样品。
7.用已经去除皮重的天平称量并记录指示剂样品容器中的颗粒样品的样品重量。
8.将样品容器放在指示器上并将空气管线连接到样品容器。
9.在指示器上设置“角度”、“出口直径”和“容器直径”的处理参数。测试完成后，记录指示剂输出。
测量休止角度的示例性程序
1.将约50克样品放入合适的容器中并利用汤匙或搅拌器将样品混合以充入空气。
2.将矩形粉末床箱放置在支撑平台上。
3.确保支撑平台设置为0(零)度角，在平台底部读数。
4.将材料通过漏斗倒入长方形粉末床箱中，直到材料开始接触箱子至少一个侧壁并形成圆锥体。
5.使用支撑螺丝缓慢并不断升高样品床箱和平台，尽可能确保平稳过渡。
6.一旦材料峰值变动，停止旋转支撑螺钉，并使用设备的量角器测量休止角度，读取支撑平台底部的量角器角度。
实例6：使用转子技术的流化床自动制粒-生产颗粒补料2
补料2颗粒/珠粒如下所述在自动化过程中制备：
1.开始使用粉碎的干基粉末(非粒状)thermofisher产品目录号pl002616p1-950.0g(净重)。任选地，在某些实施方案中可以预先润湿基础粉末；此处不进行此步骤。
2.将粉末装入配备有转子盘的流化床处理器中。
3.打开流化床处理器以预设条件(在开发运行过程中确定)开始直接从粉末中制粒。控制参数(例如，风量、雾化气力、流量、入口温度、出口温度、产品温度、溶剂喷雾速率、转盘速度、盘间隙、盘体积等)
4.通过进行过程中的样品测量(例如，显微镜图3a；其他物理性质＝表2；粒径图3b和下面的表3)来监测颗粒的形成，以确定过程何时完成。
5.从流化床处理器中排出湿颗粒(总重量805.0g)。
6.干燥湿颗粒进行物理性质分析(表2)。
7.抽除大约50.0g颗粒用于粒径测量(表3)。
自动方法颗粒补料的物理特性评估2
休止角低于50°(34.7)表示颗粒补料2具有良好的流动性。如果需要，堆积密度表明颗粒可以被压实。
补料2的粒度分析表明约95％的颗粒大于60目，而约87.8％的颗粒大于40目或约87.8％>0.4mm。
然后评估补料2的活性、生长力和性能(蛋白滴度)测定。补料2颗粒/珠粒结果与液体补充物(阳性对照；即thermofisher目录#pl002616p1在液体中复溶并在使用前无菌过滤)进行比较。对于测定，使dg44-igg细胞系在cd-cho培养基(thermofisher目录#12490)中生长。用thermofisher目录#pl002616p1以颗粒形式(有时称为珠粒)或作为液体(阳性对照)补充培养物(如所指示的)。将细胞亚传代3次，持续3天，并且对于每个亚传代细胞，将细胞分成3×10e5个活细胞/ml。在第4次传代中，每日细胞计数被采用。
将自动补料2颗粒/珠粒与细胞生长测定中的液体补充物(阳性对照)进行比较-图3c。补充以珠粒/颗粒的细胞培养基相比于补充以液体的细胞培养基在15天的培养期内表现出相当的细胞生长结果。颗粒补料2表现出可变的细胞计数为约10x10e6细胞/毫升(生长)，略高于补充以阳性对照补料的细胞培养基(约8x10e6)。
对颗粒补料2进行活力测定，并与阳性(含液体补料补充)或阴性对照(不含液体或颗粒补充物)进行比较-图7a。从7a图可以看出，补料2、3、4更好，如阳性对照一样好，并且更好于阴性对照，尤其是在第6天后。
对颗粒补料2进行细胞性能(抗体生产)测定，并与阳性(含液体补料补充)或阴性对照(不含液体或小丸补充物)进行比较-图7b。从7b图可以看出，补料2更好，如阳性对照一样好，并且更好于阴性对照，尤其是在第4天后。补充颗粒补料2(约229μg/ml)的细胞培养显示igg产量与用阳性对照补料产生的约228μg/ml(在第14天)相当；与补充颗粒补料2的细胞培养相比，未补充的细胞培养测定(阴性对照)显示低得多的igg(约100μg/ml)。
实例7：使用转子技术的流化床自动制粒-生产颗粒补料3
补料3颗粒/珠粒如下所述在自动化过程中制备：
1.开始使用粉碎的干基粉末(非粒状)thermofisher产品目录号pl002616p1-950.0g(净重)。任选地，在某些实施方案中可以预先润湿基础粉末；此处不进行此步骤。
2.将粉末装入配备有转子盘的流化床处理器中。
3.打开流化床处理器以预设条件(在开发运行过程中确定)开始直接从粉末中制粒。(例如，空气量、雾化气压流量、入口温度、出口温度、产品温度、溶剂喷雾速率、转盘速度、盘间隙、盘形状等)
4.通过进行过程中的样品测量(例如，显微镜图4a；其他物理性质＝表4；粒径图4b和下面的表5)来监测颗粒的形成，以确定过程何时完成。从流化床处理器中排出湿颗粒(总重量770.0g)。
5.干燥湿颗粒进行物理性质分析(表4)。
6.抽除大约50.0g颗粒用于粒径测量(表5)。
休止角低于50°(34.9)表示颗粒补料3具有良好的流动性。如果需要，堆积密度表明颗粒可以被压实。
补料3的粒度分析表明约88.7％的颗粒大于60目，而约69.9％的颗粒大于40目或约69.9％>0.4mm。
然后同补料2一样对补料3珠粒在细胞活力、生长力和性能(蛋白滴度)测定评估。补料3颗粒/珠粒结果与液体补充物(阳性对照；即thermofisher目录#pl002616p1在液体中复溶并在使用前无菌过滤)进行比较。对于测定，与补料2(补料2颗粒＝球化试验1；补料3粒料＝球化试验2)一样，dg44-igg细胞系在cd-cho培养基(thermofisher目录#12490)中生长。将细胞亚传代3次，持续3天，并且对于每个亚传代细胞，将细胞分成3×10e5个活细胞/ml。在第4次传代中，每日细胞计数被采用。
将自动补料3颗粒/珠粒与细胞生长测定中的液体补充物(阳性对照)进行比较-图4c。在14天的培养期内，补充以颗粒补料3的细胞培养基与阳性对照品表现出相当的细胞生长结果，尤其是与阳性对照品相比(7天之后)。颗粒补料3表现出可变的细胞计数为约9x10e6细胞/毫升(生长)，略高于补充以阳性对照补料的细胞培养基(约8x10e6)。
对颗粒补料3进行活力测定，并与阳性(含液体补料补充)或阴性对照(不含液体或颗粒补充物)进行比较-图7a。从7a图可以看出，补料2、3更好，如阳性对照一样好，并且更好于阴性对照，尤其是在第6天后。
对颗粒补料2、3和4进行细胞性能(抗体生产)测定，并与阳性(含液体补料补充)或阴性对照(不含液体或小丸补充物)进行比较-图7b。从图中可以看出，补料3更好，如阳性对照一样好，并且更好于阴性对照，尤其是在第4天后。补充颗粒补料3(约243μg/ml)的细胞培养显示igg产量略高于阳性对照补料；与补充任何颗粒补料3的细胞培养相比，未补充的细胞培养测定(阴性对照)显示低得多的igg(约100μg/ml)。
实例8：使用转子技术的流化床自动制粒-生产颗粒补料4
补料4颗粒/珠粒如下所述在自动化过程中制备：
1.开始使用混合有粘结剂的粉碎的干基粉末(非粒状)thermofisher产品目录号pl002616p1-600.0g(净重)，例如：
2.将混合粉末装入配备有转子盘的流化床处理器中。
7.打开流化床处理器以预设条件(在开发运行过程中确定)开始直接从粉末中制粒。(例如，空气量、雾化气压流量、入口温度、出口温度、产品温度、溶剂喷雾速率、转盘速度、盘间隙、盘形状等)
3.通过进行过程中的样品测量(例如，显微镜图5a；其他物理性质＝表6；分析；粒径图5b和下面的表7)来监测颗粒的形成，以确定过程何时完成。
4.从流化床处理器中排出湿颗粒(总重量824.1g)。
5.干燥湿颗粒进行物理性质分析(表6)。
6.抽除大约50.0g颗粒用于粒径测量(表7)。
休止角低于50°(43)表示颗粒补料4具有良好的流动性。如果需要，堆积密度表明颗粒可以被压实。
补料4的粒度分析表明仅约38.5％的颗粒大于60目，而仅约15％的颗粒大于40目或仅约15％>0.4mm。粒径的分布变大并且更多粒子具有更小的粒径
然后同补料2和补料3一样对补料3珠粒在细胞活力、生长力和性能(蛋白滴度)测定评估。补料4颗粒/珠粒结果与液体补充物(阳性对照；即thermofisher目录#pl002616p1在液体中复溶并在使用前无菌过滤)进行比较。对于测定，使dg44-igg细胞系在cd-cho培养基(thermofisher目录#12490)中生长。将细胞亚传代3次，持续3天，并且对于每个亚传代细胞，将细胞分成3×10e5个活细胞/ml。在第4次传代中，每日细胞计数被采用。
将含有添加粘结剂(结晶纤维素)的补料4颗粒/珠粒与细胞生长测定中的液体补充物(阳性对照)进行比较-图5c。在14天的培养期内，补充以颗粒补料4的细胞培养基与阳性对照品表现出相当的细胞生长结果，尤其是与阳性对照品相比(7天之后)。
对颗粒补料4进行活力测定，并与阳性(含液体补料补充)或阴性对照(不含液体或颗粒补充物)进行比较-图7a。从7a图可以看出，补料2、3、4更好，如阳性对照一样好，并且更好于阴性对照，尤其是在第6天后。
对颗粒补料4(含有粘结剂纤维素)进行细胞性能(抗体生产)测定，并与阳性(含液体补料补充)或阴性对照(不含液体或小丸补充物)进行比较-图7b。从图中可以看出，补料4更好，就如阳性对照一样好，并且显著更好于阴性对照，尤其是在第4天后。补充颗粒补料4(约200μg/ml)的细胞培养显示igg产量略低，但与阳性对照补料相当；与未补充的细胞培养测定(阴性对照)相比，补充有任何颗粒补料4的细胞培养显示低得多的igg(约100μg/ml)。
实例9：使用转子技术的流化床自动制粒-生产颗粒补料5
补料5颗粒/珠粒如下所述在自动化过程中制备：
1.开始使用微粒化的干基粉末thermofisher产品目录号pl002616p1-950.0g(净重)。
2.将粉末装入配备有转子盘的流化床处理器中。
3.打开流化床处理器以预设条件(在开发运行过程中确定)开始直接从粉末中制粒。(例如，空气量、雾化气压流量、入口温度、出口温度、产品温度、溶剂喷雾速率、转盘速度、盘间隙、盘形状等)
4.通过进行过程中的样品测量(例如，显微镜图6a；其他物理性质＝表8；粒径图6b和下面的表9)来监测颗粒的形成，以确定过程何时完成。
5.从流化床处理器中排出湿颗粒(总重量824.1g)。
6.干燥湿颗粒进行物理性质分析(表8)。
7.抽除大约50.0g颗粒用于粒径测量(表9)。
休止角低于50°(34.9)表示颗粒补料5具有良好的流动性。如果需要，堆积密度表明颗粒可以被压实。
补料5的粒度分析表明约83.7％的颗粒大于60目，而约27.3％的颗粒大于40目或约27.3％>0.4mm。
然后同补料2，3，4(数据未显示)一样对补料5珠粒在细胞活力、生长力和性能(蛋白滴度)测定评估。对于测定，使dg44-igg细胞系在cd-cho培养基(thermofisher目录#12490)中生长。将细胞亚传代3次，持续3天，并且对于每个亚传代细胞，将细胞分成3×10e5个活细胞/ml。在第4次传代中，每日细胞计数被采用。补料5颗粒结果与液体补充物进行比较(阳性对照：thermofisher产品编号#pl002616p1在使用前在液体中重新配制并无菌过滤)。
补充颗粒补料5的细胞培养在培养14天期间生成类似的细胞生长力测定、细胞活力测定、细胞性能(抗体生产)测定(如阳性对照)，类似于如补料2、3和4的结果(数据未显示)。
虽然已经在此示出和描述本发明的优选实施例，但本领域的普通技术人员应清楚，此类实施例仅是作为实例而提供的。本领域的技术人员现在将在不脱离本发明的情况下意识到多种变型、变化和取代。应该理解的是，可以在实践本发明时采用在本文中所描述的本发明实施例的各种替代方案。意图在于仅由以下权利要求限定本发明的范围，并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。