本申请要求于2015年11月16日提交的美国申请no.62/255,823的优先权，其全部内容通过引用并入本公开。
在一些实施方案中，本公开涉及用于培养和表征难养植物微生物的方法、组合物和系统。
背景技术：
粮食和农业组织估计，到2050年全球粮食产量必须增加60％，以满足不断上升的世界人口的需求。除需求上升外，由植物病原体引起的年度农作物损失可能高达40％以上。对于几种粮食和经济作物单独的难养和专性植物病原体可能是破坏性的。例如，木质部限制的叶缘焦枯病菌(xylellafastidiosa)感染超过100种植物种类，包括葡萄树、柑橘、咖啡和杏仁(almonds)。类似地，韧皮部限制的韧皮部杆菌属(candidatusliberibacterspp.)是新兴的破坏性病原体，其引起多种植物家系的产量损失(例如严重损失)，植物家系包括茄科(马铃薯、番茄、辣椒和烟草)、伞形科(胡萝卜和芹菜)、蔷薇科(梨、苹果和黑刺李)和芸香科(柑橘属)。马铃薯中的斑马片病可能由茄属植物韧皮部杆菌属(candidatusliberibactersolanacearum(lso))引起，它也感染番茄、辣椒和烟草。lso通过昆虫载体(马铃薯木虱(bactericeracockerelli))传播。自2004年被指定为新兴疾病以来，美国、墨西哥、中美洲和新西兰的几个商品马铃薯种植区记录了斑马片病。仅在得克萨斯州，估计斑马片病影响了35％的种植马铃薯面积，每年造成的作物损失约为2500万美元。类似地，柑橘黄龙病菌亚洲种(candidatusliberibacterasiaticus)(las)引起的柑橘青果病(citrusgreening)或黄龙病(hlb)疾病可能是当今最具破坏性的柑橘疾病，并且威胁到全世界的柑橘生产。hlb通过昆虫载体(亚洲柑桔木虱(diaphorinacitri))传播。2006年至2011年，仅在佛罗里达州，hlb造成的损失高达45亿美元。由难养植物病原体引起的这些和其他疾病是美国和全球农业生产的主要威胁。为了克服即将发生的全球粮食安全挑战，减少这些农业损失势在必行。
概要
无法培养难养维管限制的微生物是涉及几种破坏性农业病原体(如lso和las)的研究的主要瓶颈。因此，需要难养维管-定殖的(vascular-colonizing)微生物的改进的(例如，简单，快速和/或可扩展(scalable))培养和功能表征。
在一些实施方案中，本公开涉及用于使用毛状根(例如，直接从感染的植物或植物组织诱导的发根根瘤菌介导的(r.rhizogenes-mediated)毛状根)培养和表征难养微生物的方法、组合物和系统。直接从感染的植物或植物组织诱导的发根根瘤菌介导的毛状根可以提供简单、快速和可扩展的平台，来培养和表征难养维管定殖的微生物。例如，lso和las可以在直接从lso-和las-感染的番茄、马铃薯和柑橘植物或植物组织诱导的毛状根中培养。因为毛状根是有组织的且稳定的组织，所以微生物定殖的毛状根组织可以克隆繁殖以用于许多应用(例如，难养微生物的表征)。
在一些实施方案中，本公开涉及用于培养难养植物微生物(例如难养植物病原体)的方法。例如，该方法可以包括在允许用难养植物微生物定殖的毛状根的诱导的条件下，使被难养植物微生物(例如，叶缘焦枯病菌、韧皮部杆菌属)定殖的植物(例如，番茄植物、马铃薯植物、柑橘植物)与发根根瘤菌的悬浮液接触。然后，可以通过繁殖定殖的微生物的毛状根来培养难养植物微生物。在一些实施方案中，培养的植物微生物可以是韧皮部杆菌属(例如，茄属植物韧皮部杆菌属(lso)和/或柑橘黄龙病菌亚洲种(las))。根据一些实施方案，发根根瘤菌可以包括ri-dna质粒和t-dna质粒二者，并且t-dna质粒可以编码第一外源转基因(例如，编码自体荧光蛋白的基因)。根据一些实施方案，植物可以包含第一外源转基因。
在一些实施方案中，使被难养微生物定殖的植物与发根根瘤菌的悬浮液接触可以包括损伤植物的一个或多个表面，形成伤口部位，并将伤口部位暴露于发根根瘤菌的悬浮液。在一些实施方案中，使被难养植物微生物定殖的植物与发根根瘤菌的悬浮液接触可以包括去除植物的光合部分以产生伤口部位。在一些实施方案中，该方法可以包括用岩棉基质覆盖伤口部位，并将岩棉基质暴露于发根根瘤菌的悬浮液。根据一些实施方案，方法可以包括将伤口部位浸没在发根根瘤菌的悬浮液中，将发根根瘤菌的悬浮液的至少一部分真空渗入伤口部位，并用蛭石基质覆盖伤口部位。在一些实施方案中，方法可以包括使用难养植物微生物定殖的植物的任何希望部分(包括例如，子叶、下胚轴、未成熟苗、未成熟根、成熟苗或成熟根)与发根根瘤菌接触。
根据一些实施方案，繁殖定殖的毛状根可以包括将附着的毛状根或收获的毛状根暴露于一个或多个选择性条件。在一些实施方案中，繁殖可以包括将附着的毛状根或收获的毛状根转移到蛭石基质、水培系统、体外系统和生物反应器系统中的至少一个。根据一些实施方案，该方法可以包括评估难养植物病原体在繁殖的微生物的毛状根中的存在。
在一些实施方案中，本公开涉及用于评估测试组合物对难养植物微生物的影响的方法。例如，该方法可以包括在允许被难养植物微生物定殖的毛状根的诱导的条件下，使感染难养植物微生物(例如，叶缘焦枯病菌、韧皮部杆菌属)的植物(例如，番茄植物、马铃薯植物、柑橘植物)与发根根瘤菌接触，繁殖定殖的微生物的毛状根，使繁殖的定殖的微生物的毛状根与测试组合物接触，和/或评估难养植物微生物的存在和/或活力的至少一个度量。在一些实施方案中，培养的植物微生物可以是韧皮部杆菌属(例如，茄属植物韧皮部杆菌属(lso)和/或柑橘黄龙病菌亚洲种(las))。
在一些实施方案中，该方法可以包括将发根根瘤菌与用难养植物微生物定殖的植物的任何期望部分(包括例如子叶、下胚轴、未成熟苗、未成熟根、成熟苗或成熟根)接触。在一些实施方案中，测试组合物可以施用于感染的微生物的毛状根和/或注射到感染的微生物的毛状根中。在一些实施方案中，测试组合物可以有条件地或结构性地存在于感染的植物(例如，繁殖的感染的毛状根)中。
根据一些实施方案，定殖的植物(例如，繁殖的定殖的毛状根)可以包含外源转基因(例如，npr1，gfp)，并且测试组合物可以是或可以包含转基因的基因产物。在一些实施方案中，定殖的植物(例如，繁殖的定殖的微生物的毛状根)可以包括外源转基因、crispr/cas、talen和rnai构建体中的至少一种，并且因此测试组合物可以是或可以包含转基因、crispr/cas、talen和rnai构建体的基因产物。在一些实施方案中，测试组合物可以包括npr1蛋白质。
在一些实施方案中，本公开涉及使用毛状根来培养难养植物微生物的方法。例如，该方法可以包括从植物的一个或多个部分选择组织作为外植体源；在包含发根根瘤菌(r.rhizogenes)的体外培养基中培养外植体源；将外植体源切成多个块；从外植体源的至少一些块诱导毛状根的生长经过一段时间；对发根根瘤菌根基因座b(rolb)和发根根瘤菌根基因座c(rolc)标记基因进行聚合酶链式反应(pcr)扩增以确认毛状根的诱导；和/或对16srdna标记基因进行pcr扩增以确定一种或多种难养微生物的存在。在一些实施方案中，感染的植物可以包括第一外源转基因和第二外源转基因。例如，第一外源转基因可编码自体荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白等)。根据一些实施方案，在包含发根根瘤菌的培养基中培养外植体源可以包括在不含抗生素(例如至少不含头孢噻肟(cefatoxime)、羧苄青霉素(carbencillin)和卡那霉素(kanamycin))的培养基中培养外植体源。
附图的简要说明
本公开的文件包含至少一个彩色的图。根据请求并支付必要的费用，专利和商标局将提供该专利的彩色附图(一个或多个)的副本。本公开的一些实施方案可通过部分地参考本公开和附图来理解，其中：
图1示出了根据本公开的示例实施方案，用于下游研究和应用的产生微生物的毛状根的工作流程；
图2a示出了根据本公开的实施方案，使用茄子作为宿主植物在所容纳的捕获器中繁殖的成年木虱；
图2b示出了根据本公开的实施方案，使用茄子作为宿主植物在所容纳的捕获器中繁殖的携带lso的成年木虱；
图2c示出了根据本公开的实施方案，在木虱暴露四周后的健康番茄叶；
图2d示出了根据本公开的实施方案，在木虱暴露四周后lso-感染的番茄叶；
图2e示出了根据本公开的实施方案，在木虱暴露四周后的健康马铃薯叶；
图2f示出了根据本公开的实施方案，在木虱暴露四周后lso-感染的番茄叶；
图2g示出了在感染的番茄和马铃薯叶中基于聚合酶链式反应(pcr)的lso的确认；
图3a-3e示出了根据本公开的特定示例实施方案的体外微生物的毛状根平台的示意图；
图3a示出了根据本公开的实施方案，将表面灭菌的植物组织切割成较小的块并且使用细镊子轻柔地损伤；
图3b示出了根据本公开的实施方案，将外植体浸入发根根瘤菌的悬浮液中；
图3c示出了根据本公开的实施方案，在营养培养基上的植物组织进行三天共培养之后的外植体；
图3d示出了根据本公开的示例实施方案，外植体的渗透压力处理；
图3e示出了根据本公开的实施方案，在图3d的处理之后，在营养选择培养基中的外植体的培育；
图4a示出了根据本公开的实施方案，在用发根根瘤菌(菌株atcc15834)转化的番茄外植体上的毛状根的体外诱导；
图4b示出了根据本公开的实施方案，在番茄外植体上的毛状根的pcr验证结果；
图5a示出了根据本公开的实施方案，在用发根根瘤菌转化的马铃薯外植体上的毛状根的体外诱导；
图5b示出了根据本公开的实施方案，在马铃薯外植体上毛状根的pcr验证结果；
图6a示出了根据本公开的实施方案，在用发根根瘤菌(菌株atcc15834)转化的柑橘(尤里卡柠檬)外植体上的毛状根的体外诱导；
图6b示出了根据本公开的实施方案，在用发根根瘤菌(菌株atcc15834)转化的柑橘(尤里卡柠檬)外植体上的毛状根的pcr验证结果；
图7a示出了根据本公开的实施方案，由发根根瘤菌在健康番茄上诱导的气生毛状根；
图7b示出了根据本公开的实施方案，由发根根瘤菌在lso-定殖的番茄上诱导的气生微生物的毛状根；
图7c示出了根据本公开的实施方案，番茄上的气生毛状根的pcr验证结果；
图8a示出了根据本公开的实施方案，由发根根瘤菌在lso-定殖的马铃薯上诱导的气生毛状根；
图8b示出了根据本公开的实施方案，马铃薯上的气生毛状根的pcr验证结果；
图8c示出了根据本公开的实施方案，马铃薯上的气生微生物的毛状根的pcr验证结果；
图9a示出了根据本公开的实施方案，使用岩棉法在lso-定殖的番茄上诱导的微生物的毛状根；
图9b示出了根据本公开的实施方案，使用岩棉法诱导的番茄上的微生物的毛状根的pcr验证结果；
图10a示出了根据本公开的实施方案，使用蛭石法在番茄植物上诱导的微生物的毛状根；
图10b示出了根据本公开的实施方案，使用蛭石法诱导的番茄上的微生物的毛状根的pcr验证结果；
图11示出了根据本公开的实施方案，使用蛭石法在las感染的柑橘(酸橙)上诱导的微生物的毛状根；
图12示出了根据本公开的实施方案，在蛭石基质中生长的繁殖的毛状根；
图13示出了根据本公开的实施方案，在水培中生长的繁殖的毛状根；
图14示出了根据本公开的实施方案，在体外培养中生长的繁殖的毛状根；
图15示出了根据本公开的实施方案，在生物反应器系统中生长的繁殖的毛状根；
图16a示出了根据本公开的实施方案，从体外或植物系统(plantasystem)收获的健康的和lso-定殖的毛状根；
图16b示出了根据本公开的实施方案，分布于多孔板中的健康的和lso-定殖的微生物的毛状根；
图16c示出了用青霉素处理毛状根2天后lso效价的定量实时pcr结果；和
图16d示出了用青霉素处理毛状根7天后lso效价的定量实时pcr结果。
详细说明
尽管难养微生物(例如植物病原体)具有巨大的经济意义，但对其生物学、遗传学和载体-病原体-植物相互作用的了解甚少。这些知识可以促进有效的病虫害管理策略的发展，以限制产量损失(例如，巨大的损失)。表征这些难养微生物的一个瓶颈(例如，主要瓶颈)是它们无法在自然宿主之外生长，因为它们是植物的专性寄生虫。据估计，>99％的来自任何环境的微生物在实验室中是不可培养的。已经进行了许多尝试来创造合适的人造生长培养基和用于培养难养微生物的培养条件；但是，迄今为止，这些方法只取得了有限的成功。
在被土壤细菌、发根根瘤菌(最近由发根土壤杆菌(agrobacteriumrhizogenes)修订而来)感染后，植物毛状根可以容易地从不同植物组织诱导。以与其相关表亲类似的方式，根癌土壤杆菌(a.tumefaciens)、发根根瘤菌将其根-诱导(ri)转移-dna(ri-dna质粒)(其编码根基因座(rol)基因(例如rolb、rolc))引入植物基因组。rol基因在植物中的表达过量产生植物激素、生长素并诱导毛状根的萌生和增殖。
毛状空气根在解剖学、形态学和代谢上与正常根相似。毛状根连接到植物组织，其由完整木质部和韧皮部维管系统产生，从而允许通过维管系统持续运输水、营养物、细胞信号传导——以及如本文所示的难养微生物。通常，毛状根的直径小于衍生其的植物组织(例如茎，根)，并且通常很多。大量的植物种类可以通过发根根瘤菌转化并产生毛状根，包括但不限于：柑橘属(例如柠檬)、茄科(例如马铃薯、番茄)、胡萝卜属(例如胡萝卜)、红豆杉属、金鸡纳属(cinchona)、石梓属、大豆属(例如大豆)、芸香科(例如印度枳树(baeltree))、紫茉莉科和蔷薇科(例如苹果)。
在一些实施方案中，本公开涉及培养难养微生物的方法(例如，在体外、在植物中(inplanta))。在一些实施方案中，本公开涉及可直接用于培养和表征难养微生物的毛状根系统。在一些实施方案中，本公开涉及可用于难养微生物-植物相互作用的高通量功能基因和基因组学研究的毛状根系统。在一些实施方案中，毛状根系统可以用于化学遗传筛选(例如，筛选抗生素、香精油、氧化脂类)以对抗破坏性植物病害。根据一些实施方案，毛状根系统可以包括遗传修饰的植物，并且可以有利于鉴定植物物种中对难养微生物有关易感性和/或抗性的基因。
根据一些实施方案，宿主植物(例如番茄、马铃薯、辣椒、柑橘)的发根根瘤菌介导的毛状根培养物可以用难养微生物(例如暂定种(candidatusspp.)、菌属(xylellaspp.)、棒形杆菌属(clavibacterspp.))感染。外植体源材料可以包括任何期望的植物器官或组织，包括例如子叶、下胚轴、未成熟和成熟的芽和根。通过测试多个感染的植物组织，可以为特定的一组条件识别最佳来源。根据一些实施方案，可以包括毛状根增殖技术(例如，用于可扩展性和/或多路复用的技术)用于高通量诊断和/或分子表征。在一些实施方案中，毛状根系统的功能表征可以包括候选植物和病原体编码的基因的遗传功能获得(例如过表达)和功能丧失(例如成簇的、规则间隔的、短回文结构重复相关的(crispr/cas)，转录激活剂样效应核酸酶(talen)和核糖核酸干扰(rnai)基因沉默)研究。基因构建体(例如，代表性的基因构建体)或基因文库可通过任何期望的方法(包括例如真空渗入和/或通过dna轰击)瞬时传递到建立的毛状根中。在一些实施方案中，可以在毛状根诱导之前将基因构建体插入发根根瘤菌t-dna中，从而以单一步骤完成该过程。
根据一些实施方案，毛状根系统可以用于任何期望的植物-微生物联合(例如除了维管-定殖的植物细菌以外)的增殖和功能研究，包括病毒(例如番茄斑萎病毒、黄瓜花叶病毒、花椰菜花叶病毒、芜菁黄花叶病毒)、类病毒(例如马铃薯纺锤块茎类病毒、番茄束顶矮化类病毒、柑桔裂皮类病毒)和内寄生的微生物(例如敏捷食酸菌、固氮弓菌属bh72(azoarcussp.bh72)、固氮螺菌属b510(azospirillumsp.b510)、镰刀菌属、炭疽菌属、弯孢属(curvulariaspp.)、球孢白僵菌、蜡蚧菌属(lecanicilliumspp)、寡雄腐霉菌(pythiumoligandrum))。
以前的研究没有报道毛状根在培养或研究难养植物微生物中的应用。因此，显示毛状根可以支持难养微生物生长的本公开可能对用于高通量应用的微生物的毛状根的大规模繁殖具有显著影响。所公开的毛状根系统解决了培养和繁殖难养植物病原体的显著瓶颈，并且可能导致难养植物病原体的许多生物学研究的开始。这些研究提供了植物病虫害管理以及一般农业方面新的变革性发展的希望。
在一些实施方案中，本公开可以帮助在任何合适的植物(例如马铃薯、番茄和柑橘)中建立和优化韧皮部杆菌属微生物的毛状根培养物，并且允许研究人员使用所公开的微生物的毛状根系统进行遗传和/或化学分析。
根据本文公开的一些实施方案，直接从感染的植物诱导的毛状根可以提供容易、快速和可扩展的平台，来培养和表征难养维管-定殖的植物病原体。例如，lso和las在得克萨斯州南部流行，并感染几种茄属的作物，包括马铃薯、番茄和柑橘属植物。因此，得克萨斯州南部感染las的柑橘树可被用于获得las感染的植物材料。可以从las感染的柑橘树收集植物组织，并通过16srdna的聚合酶链式反应(pcr)扩增(一种用于检测las的建立的dna标记)来测试las的存在。las阳性柑橘组织可以进一步被用作微生物的毛状根诱导的外植体源。
在一些实施方案中，本公开涉及用于难养维管-定殖的微生物(例如植物病原体)的快速培养、繁殖和功能研究的生物模拟毛状根平台。难养维管-定殖的植物病原体，比如暂定种(candidatusspp.)、菌属(xylellaspp.)、病毒、植原体和螺原体导致每年数十亿美元的作物损失。无法培养这些和其他维管限制的微生物(例如病原体)对试图研究这些生物体的研究人员提出了巨大的挑战。由发根根瘤菌诱导的植物毛状根是与根类似的在解剖学和代谢上有组织的、稳定的组织，并且它们具有完整的木质部和韧皮部维管系统。根据一些实施方案，从受感染植物直接诱导的含微生物的毛状根可以提供容易、快速和可扩展的平台来培养、繁殖和表征难养维管-限制的植物病原体(例如在实验室中)。
根据一些实施方案，植物(例如马铃薯，番茄，柑橘)中的韧皮部杆菌属微生物的毛状根培养物能够实现使用微生物的毛状根系统的遗传分析。除了缓解培养难养维管-限制的植物病原体的先前挑战之外，毛状根平台可容易地用于转化性高通量功能性研究，包括但不限于新型抗菌剂和杀菌剂的遗传和化学筛选。因为发根根瘤菌可以有效地诱导多种单子叶植物和双子叶植物中的毛状根，所以用于微生物培养的微生物的毛状根系统、方法和组合物可以应用于其他农作物和植物微生物联合，除维管-定殖的植物细菌(例如真菌、病毒、类病毒和内寄生的微生物等)外。
生成外植体和/或接种体源
昆虫载体可以在植物之间传播难养微生物。根据一些实施方案，通过允许或引入携带难养微生物的昆虫载体来饲喂植物并由此将难养微生物转移至植物组织，可以产生由难养微生物(例如外植体)定殖的植物材料。一旦转移到植物维管系统中，难养微生物就可以定殖和复制。
根据一些实施方案，可以从环境(例如，农田)收集携带难养微生物的昆虫载体，并测试以确定它们是否携带难养微生物(例如，16srdnapcr)。在一些实施方案中，昆虫载体(例如，携带难养微生物的昆虫载体，未携带的昆虫载体)可以被保持(例如在昆虫笼中)并且可以繁殖。在一些实施方案中，携带难养微生物的昆虫载体可以在实验室环境中产生，例如，通过允许未携带的昆虫载体饲喂被难养微生物感染的植物组织。已知许多方法用于将难养微生物传播到昆虫载体，以及，保持和繁殖昆虫载体群，所有这些方法都在本公开的范围内。
在一些实施方案中，可以测试昆虫载体群是否存在难养微生物的定殖。可以使用任何合适的技术(例如16srdnapcr)来测试昆虫载体是否存在被难养微生物定殖。
至少一种携带难养微生物的昆虫载体可以允许饲喂未感染的植物一段时间(例如七天)；从而将至少一种难养微生物转移至植物维管系统。在本公开的范围内，可以使用多种方法成功地将至少一种难养微生物转移至植物维管系统。这些方法可以至少根据以下改变：昆虫载体的种类和发育阶段、昆虫载体内的难养微生物的水平、昆虫载体内难养微生物复制的速率以及未感染的植物的种类和发育阶段。根据一些实施方案，在指定的饲喂期(例如七天)后，可以从植物中去除携带微生物的昆虫载体，并且可以监控植物的定殖和/或疾病发展。在一些实施方案中，疾病症状可以指示难养微生物的定殖。可以使用任何数量的标准实验室程序来鉴定在植物组织内是否存在难养微生物。根据一些实施方案，可以使用16srdnapcr来测试植物组织是否存在难养微生物群。根据一些实施方案，对于难养微生物的存在测试阳性(例如，pcr阳性)的植物或植物组织(例如子叶)可被用作微生物的毛状根诱导的外植体的来源。根据一些实施方案，用于培养难养植物微生物的方法可以包括用难养微生物定殖植物以产生外植体源。在一些实施方案中，用难养微生物定殖植物可以包括将植物的一个或多个表面暴露于至少一种携带难养微生物的昆虫载体(例如携带lso的木虱)。在一些实施方案中，外植体可以包括植物组织，例如子叶、下胚轴、未成熟苗、未成熟根、成熟苗、成熟根或其任何组合。
微生物的毛状根平台
图1示出了根据本公开的示例实施方案的微生物的毛状根平台工作流程100，其包括：在一个或多个植物组织中繁殖难养微生物102；从感染的植物组织诱导微生物的毛状根产生110；繁殖微生物的毛状根120，和将微生物的毛状根应用到下游研究和应用130。
如图1所示，根据一些实施方案，可以在一种或多种植物组织中繁殖难养微生物102。感染的植物的一种或多种植物组织可以被难养微生物定殖，包括子叶104、下胚轴106、叶108、未成熟苗、未成熟根、成熟苗、成熟根或其任何组合。根据一些实施方案，在一种或多种植物组织中繁殖难养微生物(例如，lso，las)可以包括将健康植物暴露于一种或多种被难养微生物定殖的且已知饲喂植物组织的载体物种(例如木虱)。根据一些实施方案，繁殖难养微生物可以包括无性植物繁殖的各种方法。根据一些实施方案，繁殖难养微生物可以包括从环境识别感染的植物并保持所识别的植物。
微生物的毛状根平台工作流程100可以包括从感染的植物或植物组织诱导微生物的毛状根产生110。根据一些实施方案，诱导微生物的毛状根产生可以包括培养发根根瘤菌。许多方法适用于培养发根根瘤菌，并且包含在本公开中。培养发根根瘤菌可以包括在任何适当的培养基(例如luria-bertani培养基(lb))中生长发根根瘤菌至任何合适的光密度(例如0.3)。在一些实施方案中，发根根瘤菌的培养物可以生长至约0.2，或约0.3，或约0.4，或约0.5，或约0.6的o.d.。根据一些实施方案，发根根瘤菌的培养物可以生长至o.d.在0.2与0.6之间，或在0.3与0.6之间，或在0.2与0.4之间。在达到选定的光密度后，可以从培养基中去除发根根瘤菌的培养物(例如通过离心)，并重悬浮于一定体积的植物培养基(例如1/2ms，1/2b5+3％蔗糖)或水(例如无菌水)中至所需浓度。在一些实施方案中，发根根瘤菌的培养物可以以约0.2、或约0.3、或约0.4、或约0.5、或约0.6的o.d.重悬浮。根据一些实施方案，发根根瘤菌的培养物可以以在0.2至0.6之间、或在0.3至0.6之间、或在0.2至0.4之间的o.d.重悬浮。
根据一些实施方案，可以基于特定特征来选择发根根瘤菌的菌株。例如，不同的发根根瘤菌菌株可以具有从植物诱导毛状根的不同潜力。在一些实施方案中，用于在植物或外植体(例如番茄，马铃薯，柑橘)中繁殖微生物的毛状根的合适菌株可以根据例如在选定的外植体组织类型和/或植物物种(例如番茄，马铃薯，柑橘)中的毛状根的诱导百分比经验地确定。在一些实施方案中，用于评估和/或使用的发根根瘤菌的合适菌株可以包括americantypecellculture(atcc)15834、atcc43056、atcc43057、atcc1333、k599或其任何组合。根据一些实施方案，对于外植体组织和发根根瘤菌菌株的每种组合，可以通过测量例如如下参数来确定诱导效率：(a)每个总的外植体的毛状根诱导百分比；(b)每个总的外植体的毛状根萌生天数；(c)每个单一外植体的毛状根诱导频率，以及(d)毛状根中的难养微生物(例如las和lso)群。根据一些实施方案，为了准确比较不同样品(例如，外植体组织类型、植物物种类型)中的微生物效价，可以使用定量pcr技术(例如，q-pcr、定量实时pcr)。可以使用统计分析，如方差分析(anova)和学生t-检验来确定不同样本中群体之间的显著差异。
如图1所示，在植物中110、112、114和体外116的方法均可用于直接从一种或多种感染的植物组织诱导微生物的毛状根产生。用于在植物中诱导微生物的毛状根产生的方法包括微生物的毛状根的气生诱导110、微生物的毛状根的岩棉诱导112和微生物的毛状根的蛭石诱导114。
在植物中诱导微生物的毛状根的方法
在一些实施方案中，诱导微生物的毛状根产生110可以包括选择感染的植物(例如lso)，并准备感染的植物的一个或多个表面(例如表面灭菌、损伤)。准备感染的植物可以包括感染的植物的一个或多个表面的表面灭菌。在一些实施方案中，可以使用任何适当的表面灭菌技术，包括将感染的植物的一个或多个表面暴露于含有醇(例如70％的乙醇)、naclo(漂白剂)(例如2％、10％)、非植物毒性抗真菌剂(例如两性霉素b)、抗菌剂(例如200mg/l头孢噻肟或100mg/l羧苄青霉素)化合物或其任何组合的溶液经过指定的一段时间(例如，1至10分钟)。
根据一些实施方案，准备感染的植物(例如，被lso或las定殖)可包括损伤感染的植物的一个或多个表面。可以使用任何合适的工具来损伤感染的植物的一个或多个表面，包括剪刀、手术刀、镊子(例如，细针距(finegauge))、注射器、针或其任何组合。在一些实施方案中，感染的植物的损伤和暴露的表面可以充当发根根瘤菌转化和毛状根诱导的活性位点。
在一些实施方案中，诱导微生物的毛状根产生110可包括使感染的植物或感染的植物的一部分与至少一种发根根瘤菌细胞接触(在植物中的方法)，如图1中112、114和116所示。根据一些实施方案，使感染的植物与至少一种发根根瘤菌细胞接触可以包括将感染的植物的一个或多个部分(例如伤口部位)直接暴露于发根根瘤菌悬浮液(例如o.d.0.3)(例如以产生气生毛状根)，或用发根根瘤菌悬浮液真空渗入感染的植物的一个或多个部分。
根据一些实施方案，感染的植物的一个或多个部分可以直接与含有至少一种发根根瘤菌细胞的悬浮液(例如o.d.0.3)接触。可以使用各种方法使感染的植物的一个或多个部分与含有至少一种发根根瘤菌细胞的悬浮液接触。根据一些实施方案，接触感染的植物的一个或多个部分可包括：将含有至少一种发根根瘤菌细胞的悬浮液施用至伤口部位(例如，使用滴管)，将细针浸入发根根瘤菌的悬浮液并使用细针损伤感染的植物上的一个或多个位置；使用注射器将发根根瘤菌的悬浮液注射到感染的植物中。如图1中112所示，在土壤水平以上的位置接触感染的植物可产生一个或多个气生微生物的毛状根。
根据一些实施方案，使感染的植物的一个或多个部分与至少一种发根根瘤菌细胞接触(例如暴露的伤口部位)可以包括包裹或覆盖(例如用铝箔)接触部位。在一些实施方案中，包裹或覆盖接触部位可以减少暴露于光和/或维持期望的湿度水平。
在一些实施方案中，使感染的植物的一个或多个部分与至少一种发根根瘤菌细胞接触可包括使用真空压力渗入感染的植物的一个或多个部分。如图1中116所示，诱导微生物的毛状根产生可以包括去除感染的植物的一部分(例如芽)以形成伤口部位，并使该伤口部位与含有至少一种发根根瘤菌细胞的溶液接触(例如，o.d.0.3)。在一些实施方案中，使感染的植物的一部分与含有至少一种发根根瘤菌细胞的溶液接触(例如o.d.0.3)可以包括将伤口部位浸没在溶液中，并且将感染的植物的一部分暴露于真空环境经过一段时间。可以使用允许用至少一种发根根瘤菌细胞渗入至少一种植物细胞的任何真空环境。在一些实施方案中，真空环境可以是约20inhg、或约25inhg、或约30inhg。根据一些实施方案，真空环境的一段时间可以是任何合适的时长，其允许用至少一种发根根瘤菌细胞渗入至少一种植物细胞。可以保持真空的时间段可以是任何时间长度。例如，在一些实施方案中，可将真空保持至少约30秒、或至少约1分钟、或至少约5分钟、或至少约10分钟、或至少约30分钟、或至少约60分钟、或至少约3小时、或至少约6小时、或至少约12小时。
根据一些实施方案，并且如图1的114所示，在真空渗入之后，可以从发根根瘤菌的溶液移除伤口部位，并且通过插入蛭石基质中将其覆盖(例如，完全覆盖、部分覆盖)。在一些实施方案中，诱导微生物的毛状根产生可包括去除感染的植物的一部分(例如芽)以形成伤口部位，使伤口部位与含有至少一种发根根瘤菌细胞的溶液接触(例如o.d.0.3)，从溶液移除伤口部位，并用蛭石基质覆盖伤口部位。在一些实施方案中，被蛭石基质覆盖的感染的植物的一部分可以保持在适合形成一个或多个微生物的毛状根的条件下。在一些实施方案中，可以周期性地改变蛭石基质。
如图1中的114所示，诱导微生物的毛状根产生可以包括去除感染的植物的一部分(例如芽)以形成伤口部位，在岩棉基质中覆盖伤口部位，并将岩棉基质暴露于含有至少一种发根根瘤菌细胞的溶液。将岩棉基质暴露于含有至少一种发根根瘤菌细胞的溶液(例如o.d.0.3)可以包括提供足够体积的溶液以使岩棉基质部分饱和或完全饱和。根据一些实施方案，被岩棉基质覆盖的感染的植物的一部分可以保持在适合共培养发根根瘤菌与一种或多种植物细胞的条件下经过共培养期。根据一些实施方案，共培养期可以是至少约12小时、或至少约24小时、或至少约48小时、或至少约72小时。在一些实施方案中，在共培养期之后，岩棉基质可以被干燥(例如风干、真空干燥)以形成干燥的岩棉基质。根据一些实施方案，干燥的岩棉基质可保留一些湿气。在一些实施方案中，与干燥前相同的岩棉基质相比，干岩棉基质可具有减少的发根根瘤菌群。根据一些实施方案，可以通过将岩棉基质暴露于一个或多个干燥条件(例如，温度、气流)经过至少6小时、或至少12小时、或至少24小时、或至少36小时、或至少48小时、或至少72小时的一段时间来进行干燥岩棉基质。在一些实施方案中，干燥的岩棉基质可以被再水化。
使感染的植物的一个或多个部分(例如112、114、116)与至少一种发根根瘤菌细胞接触可以包括将接触的植物保持在适合于形成微生物的毛状根的条件下(例如，培养箱、生长室、温室)直到至少一个毛状根产生。适合于产生一种或多种微生物的毛状根的条件可以根据以下因素而变化：感染的植物的种类、接触的感染的根部的一部分、接触感染的植物的方法、选择的发根根瘤的菌株、发根根瘤菌在接触溶液中的浓度或其任何组合。根据一些实施方案，感染的植物可以保持在约21℃与约25℃之间的温度。在一些实施方案中，根据一些实施方案，感染的植物可以保持在具有每24小时期间约8小时光照至约16小时光照的明/暗循环的条件下。在一些实施方案中，可以在使感染的植物与发根根瘤菌的悬浮液接触约10至21天后出现微生物的毛状根。
诱导微生物的毛状根的体外方法
如图1中118处所示，根据本公开的一些实施方案，诱导微生物的毛状根产生可以在体外进行。根据一些实施方案，体外诱导微生物的毛状根可以包括：准备发根根瘤菌的培养物、准备外植体、使外植体与包含至少一种发根根瘤菌细胞的溶液接触(例如，共培养)并将外植体暴露于一种或多种选择性条件。
根据一些实施方案，诱导微生物的毛状根产生110的体外方法118可包括从被难养微生物定殖的植物中选择一个或多个感染的组织(例如叶、子叶、下胚轴和/或根)以用作外植体。在一些实施方案中，诱导微生物的毛状根产生可以包括准备外植体(例如表面灭菌、损伤)。准备外植体可以包括外植体(例如子叶)的一个或多个表面的表面灭菌。在一些实施方案中，可以使用任何适当的表面灭菌技术，包括将感染的植物或外植体的一个或多个表面暴露于含有醇(例如70％乙醇)、naclo(漂白剂)(例如2.5％、10％溶液)、非植物毒性的抗真菌剂(例如两性霉素b)、抗菌剂(例如头孢噻肟或羧苄青霉素)化合物或其任何组合的溶液经过指定的一段时间(例如1至10分钟)。
在一些实施方案中，准备外植体(例如子叶)可包括将外植体切割成较小的块(例如，约2厘米(cm)长)、损伤外植体的至少一部分(例如使用镊子)或其任何组合。可以使用任何合适的工具来准备外植体，包括剪刀、手术刀、镊子(例如，细针距)、注射器、针或其任何组合。外植体(例如子叶)的损伤和暴露的表面可以用作发根根瘤菌转化和毛状根诱导的活性位点。
在一些实施方案中，诱导微生物的毛状根产生可以包括使外植体(例如，表面灭菌和损伤的子叶)与至少一种发根根瘤菌细胞接触(例如，共培养)(体外方法)116。在一些实施方案中，使外植体(例如，准备的外植体)与至少一种发根根瘤菌细胞接触可以包括将外植体或准备的外植体浸入含有至少一种发根根瘤菌细胞的悬浮液(例如od0.3)中经过一段时间(例如20分钟)。根据一些实施方案，可以将外植体浸入含有至少一种发根根瘤菌细胞的悬浮液中经过任何时间段，例如至少1分钟、或至少5分钟、或至少10分钟、或至少15分钟、或至少20分钟、或至少25分钟、或至少30分钟。在一些实施方案中，接触(例如)共培养外植体可包括将外植体(例如，准备的外植体)浸入含有至少一种发根根瘤菌细胞的悬浮液(例如o.d.0.3)中经过约1分钟至约30分钟、或约5分钟至约25分钟、或约10分钟至约25分钟、或约15分钟至约25分钟、或约15分钟至约20分钟的时间段。
在一些实施方案中，使外植体与至少一种发根根瘤菌细胞接触可以包括将外植体从含有至少一种发根根瘤菌细胞的悬浮液(例如o.d.0.3)转移到共培养培养基(例如，1/2ms、1/2b5+3％蔗糖)，并将外植体培育至少12小时、或至少24小时、或至少36小时、或至少48小时、或至少72小时的时间段。培育外植体或准备的外植体可以在用于外植体和发根根瘤菌二者的存活的任何合适的条件下进行。在一些实施方案中，培育外植体可以在约21℃、或约22℃、或约23℃、或约24℃、或约25℃的温度下进行。根据一些实施方案，可以在约21℃至约25℃的温度下进行培育外植体。共培养培养基可以包括允许发根根瘤菌生长的任何培养基，例如：1/2ms、1/2b5+3％蔗糖培养基。
根据一些实施方案，接触外植体可以包括将外植体浸入含有至少一种发根根瘤菌细胞的悬浮液中经过20分钟的时间段，将外植体转移到1/2ms、1/2b5+3％蔗糖的共培养培养基，并将外植体在21℃至25℃的温度下培育72小时的时间段。
在一些实施方案中，在接触和培育之后，外植体可以暴露于一种或多种选择性条件。根据一些实施方案，可将外植体或准备的外植体从共培养培养基转移至选择培养基。选择培养基可以是抑制(例如，减少其浓度或生长)发根根瘤菌、未转化的组织、未转化的根或其任何组合的任何培养基。根据一些实施方案，选择培养基可以抑制发根根瘤菌群，但不抑制难养微生物(例如lso)。根据一些实施方案，可以使用各种措施来避免使用常见抗生素(例如头孢噻肟、羧苄青霉素和卡那霉素)的潜在危险。例如，一些抗生素可能抑制难养微生物存在于外植体内。因此，在一些实施方案中，可以使用可选的抗生素，如链霉素(例如200mg/l浓度)、新霉素(例如100mg/l)、青霉素(例如100mg/l)和潮霉素(例如100mg/l)，其是韧皮部固定的和/或无植物毒性的。可以将外植体从共培养培养基(例如约1/2ms、1/2b5+3％蔗糖)转移至选择培养基(例如约1/2ms、1/2b5+3％蔗糖+200mg/l头孢噻肟或100mg/l羧苄青霉素)，其可以抑制(例如，减少其浓度或生长)发根根瘤菌。
根据一些实施方案，在接触和培育之后，外植体可以暴露于渗透压力。将外植体暴露于渗透压力可以有效地抑制发根根瘤菌(例如降低其浓度)。存在用于将外植体暴露于渗透压力的各种方法。例如，可以通过在无菌去离子水中反复冲洗外植体一段时间(例如约30分钟)而将外植体暴露于渗透压力。在一些实施方案中，用于使外植体暴露于渗透压力的去离子水可以包括抗生素化合物，例如200mg/l头孢噻肟或100mg/l羧苄青霉素。
在将外植体接触并暴露于一种或多种选择性条件后，可将外植体置于适当的生长环境(例如，培养箱、生长室、温室)中，直至至少一个毛状根产生。随后可以监测外植体的毛状根诱导。根据一些实施方案，取决于植物物种、外植体源和所用的发根根瘤菌菌株，毛状根可能在2至4周内出现。
微生物的毛状根诱导效率
在一些实施方案中，毛状根诱导效率可以基于各种因素而变化(例如，显著变化)，因素包括：植物品种、发根根瘤菌菌株和/或外植体源(例如子叶、下胚轴、未成熟苗、未成熟根、成熟苗和成熟根)。经验数据可用于优化毛状根诱导效率。根据一些实施方案，为了不同样品(例如，外植体组织类型、植物物种类型)中的微生物群的准确比较，可以使用定量pcr技术(例如，q-pcr、定量实时pcr)。可以使用统计分析，如方差分析(anova)和学生t-检验来确定不同样本中群体之间的显著差异。
根据一些实施方案，取决于所使用的植物品种、外植体组织和发根根瘤菌菌株，毛状根诱导效率可以在约10％至约90％的范围内。优选的外植体组织和发根根瘤菌菌株可以使各种植物(例如柑橘、番茄和马铃薯)中的微生物的毛状根诱导效率最大化。
毛状根的确定
如图1中的120所示，微生物的毛状根平台工作流程100可以包括确认微生物的毛状根(例如，在植物中或体外产生)通过发根根瘤菌的转化来诱导。可以使用各种分子方法来确认微生物的毛状根(例如，在植物中或体外产生)通过发根根瘤菌的转化来诱导。例如，根据一些实施方案，可以进行已知的根诱导的(ri)dna基因(例如rolb，rolc)的pcr扩增以确认微生物的毛状根(例如，在植物中或体外产生)通过发根根瘤菌的转化来诱导。
难养微生物对毛状根的定殖的确定
微生物的毛状根平台工作流程100可以包括确认从感染的植物产生的微生物的毛状根被难养微生物(例如，lso、las)定殖，如图1中120所示。在不偏离本公开的情况下，可以使用许多科学方法确认来自外植体或感染的植物的微生物的毛状根被难养微生物定殖，方法包括但不限于pcr、q-pcr、定量实时pcr、逆转录qpcr、酶联免疫吸附测定(elisa)或其任何组合。
被难养微生物定殖的微生物毛状根的繁殖
根据一些实施方案，微生物的毛状根平台工作流程100可以包括繁殖微生物的毛状根用于下游研究和应用。根据一些实施方案，为了成功地利用微生物的毛状根来进行高通量生物学研究，可能期望以足够大的量繁殖微生物的毛状根接种物。毛状根系统适合大规模繁殖。根据一些实施方案，收获的毛状根可以被克隆繁殖。收获的毛状根的克隆繁殖可以提供包含在收获的毛状根(例如，微生物的毛状根接种物)内的难养微生物的增加的来源。根据本公开的一些实施方案，可以使用蛭石法122、水培方法124、体外培养基方法126、生物反应器方法128或其任何组合来执行繁殖微生物的毛状根。
根据一些实施方案，当附着于感染的植物或外植体的微生物的毛状根已经达到期望的长度时，可以进行繁殖微生物的毛状根。在一些实施方案中，当附着于感染的植物或外植体的微生物的毛状根已经达到至少约1cm、或至少约1.5cm、或至少约2cm、或至少约2.5cm、或至少约3cm、或至少约3.5cm、或至少约4cm、或至少约4.5cm、或至少约5cm的长度时，可以进行繁殖微生物的毛状根。
如上所述，可用于产生一个或多个微生物的毛状根的在植物中的方法有多种。这种在植物中产生的微生物的毛状根仍然可以附着于有光合活性能力的感染的植物的至少一部分(即附着的毛状根)。根据一些实施方案，繁殖微生物的毛状根121可以包括将附着的毛状根暴露于一种或多种选择性条件(例如，在繁殖之前)。根据一些实施方案，使附着的毛状根暴露于一种或多种选择性条件可包括将附着的毛状根的一个或多个表面暴露于含有醇(例如70％乙醇)、naclo(漂白剂)(例如2.5％、10％)、非植物毒性的抗真菌剂(例如两性霉素b)、抗菌剂(例如头孢噻肟、羧苄青霉素)化合物或其任何组合的溶液中经过指定的一段时间(例如1至10分钟)。在一些实施方案中，将附着的毛状根暴露于一种或多种选择性条件可包括使附着的毛状根暴露于渗透压力。在一些实施方案中，将附着的毛状根暴露于一种或多种选择性条件可以包括将附着的毛状根转移至选择培养基(例如，约1/2ms、1/2b5+3％蔗糖+200mg/l头孢噻肟或100mg/l羧苄青霉素)以抑制(例如降低其浓度)发根根瘤菌。
根据一些实施方案，繁殖微生物的毛状根121可包括从外植体、感染的植物、感染的植物的一部分或附着的毛状根收获一个或多个微生物的毛状根以形成收获的毛状根。在一些实施方案中，繁殖微生物的毛状根121可以包括将收获的毛状根暴露于选择性条件，其可以降低发根根瘤菌的浓度。根据一些实施方案，将收获的毛状根暴露于一种或多种选择性条件可包括将收获的毛状根的一个或多个表面暴露于含有醇(例如70％乙醇)、naclo(漂白剂)(例如2.5％、10％)、非植物毒性的抗真菌剂(例如两性霉素b)、抗菌剂(例如头孢噻肟或羧苄青霉素)化合物或其任何组合的溶液中经过指定的一段时间(例如1至10分钟)。在一些实施方案中，将收获的毛状根暴露于一种或多种选择性条件可包括将收获的毛状根转移至选择培养基(例如，约1/2ms、1/2b5+3％蔗糖+200mg/l头孢噻肟或100mg/l羧苄青霉素)。在一些实施方案中，将收获的毛状根暴露于一种或多种选择性条件可包括将收获的毛状根暴露于渗透压力。例如，通过在无菌的去离子水中反复冲洗一段时间(例如，约30分钟)可将收获的毛状根暴露于渗透压力。
如图1中122所示，可以使用蛭石法122进行繁殖微生物的毛状根。在一些实施方案中，蛭石法122可以包括将附着的毛状根(例如，表面灭菌的附着的毛状根)移植到蛭石基质。根据一些实施方案，繁殖微生物的毛状根的蛭石法122可以包括周期性地将附着的毛状根转移到新鲜的蛭石基质。在蛭石基质中的移植的附着的毛状根可以放置在合适的条件下，用于维持附着的毛状根的光合部分。例如，蛭石毛状根可以以14小时光照(强度：100μmolm-2s-1)、10小时黑暗的昼夜循环以及21℃至约25℃的生长室中繁殖。
根据一些实施方案，可以使用水培方法124进行繁殖微生物的毛状根。根据一些实施方案，水培方法124可以包括将附着的毛状根(例如，暴露于渗透压力)或收获的毛状根(例如，表面灭菌的)放置在富含营养物的培养基(例如，1/2ms、1/2b5+3％蔗糖培养基)中以产生水培培养物。在一些实施方案中，富含营养物的培养基可以包含抗生素或抗真菌成分。水培培养物可以在任何适当的条件下保持用于附着的毛状根或收获的毛状根的生长。在一些实施方案中，水培培养物可以搅动。根据一些实施方案，水培培养物可以定期补充额外的营养源(例如新鲜的培养基供应)。在一些实施方案中，水培培养物可以维持在约21℃至约25℃的温度。根据一些实施方案，对于水培培养物的生长而言，供应外部光源是不必要的。如图1中126所示，可以使用体外培养基方法126进行繁殖微生物的毛状根。根据一些实施方案，体外培养基方法126可以包括将附着的毛状根(例如，暴露于渗透压力)或收获的毛状根(例如表面灭菌的)放置在营养丰富的培养基(例如，1/2ms、1/2b5+3％蔗糖培养基)的平板上以产生体外培养物。在一些实施方案中，富含营养物的培养基可以包含抗生素或抗真菌成分。体外培养物可以保持在任何适当的条件下，用于附着的毛状根或收获的毛状根的生长。根据一些实施方案，体外培养基方法126可包括周期性地将附着的毛状根或收获的毛状根移植到新鲜的富含营养物的培养基平板上。在一些实施方案中，体外培养物可以维持在约21℃至约25℃的温度。根据一些实施方案，对于体外培养物的生长而言，供应外部光源是不必要的。
如图1中128所示，根据一些实施方案，可以使用生物反应器方法128进行繁殖微生物的毛状根。根据一些实施方案，生物反应器方法128可以包括将附着的毛状根(例如，暴露于渗透压力)或收获的毛状根(例如表面灭菌的)放置在含有富含营养物的培养基(例如，1/2ms、1/2b5+3％蔗糖培养基)的生物反应器系统中以产生生物反应器培养物。在一些实施方案中，富含营养物的培养基可以包含抗生素或抗真菌成分。
在不偏离本公开的情况下可以使用各种生物反应器系统。例如，在一些实施方案中，液相和/或气相生物反应器可以用于繁殖微生物的毛状根的生物反应器方法中。根据一些实施方案，浸没系统生物反应器或临时浸没系统生物反应器(例如setis系统)可以用于繁殖微生物的毛状根的生物反应器方法中。在一些实施方案中，可以将附着的毛状根或收获的毛状根周期性地浸入富含营养物的培养基中经过一段时间，经过计算该时间段允许充分摄取营养物质(例如临时浸没系统生物反应器)。在一些实施方案中，与植物组织永久浸入营养物培养基中的浸入系统相比，临时浸没系统可有助于改善气体交换并避免缺氧/通气问题。临时浸没系统(例如setis系统)可以是便宜的、容易建立的和/或可扩展的(例如高度可扩展的)。在一些实施方案中，临时浸没系统的各个单元可以被设计为功能独立的。根据一些实施方案，生物反应器的各个单元可以被多路复用，使得第一生物反应器单元至少附接到第二生物反应器单元。由于可以防止污染物从单元传播到单元，所以与单个生物反应器单元相比，多路复用生物反应器装置可以减少由于污染而造成的损失。
生物反应器培养物可以保持在任何适当的条件下，用于附着的毛状根或收获的毛状根的生长。在一些实施方案中，生物反应器培养物可以充气。根据一些实施方案，生物反应器培养物可以定期补充额外的营养源(例如新鲜的培养基供应)。在一些实施方案中，生物反应器培养物可以维持在约21℃至约25℃的温度。根据一些实施方案，对于生物反应器毛状根培养物的生长而言，供应外部光源是不必要的。
根据一些实施方案，可以在相对较短的时间段内实现繁殖微生物的毛状根。在一些实施方案中，在约六至十周内可以从感染的植物或外植体产生微生物的毛状根群至微生物的毛状根繁殖的团(mass)。
毛状根遗传筛选系统
如图1中130所示，除了缓解培养难养维管-限制的植物微生物的先前挑战之外，毛状根平台可以容易地用于转化性、高通量功能性研究，包括但不限于新型抗菌剂和杀菌剂的遗传和化学筛选。因为发根根瘤菌可以有效地在多种单子叶和双子叶植物中诱导毛状根，所以用于微生物培养的微生物的毛状根系统、方法和组合物可以应用于其他农作物和植物微生物联合，除维管-定殖的植物细菌(例如真菌、病毒、类病毒和内寄生的微生物)外。
根据一些实施方案，可以使用保持附着于植物组织的微生物的毛状根来进行检测，例如在图1中132所示的气生毛状根或者如图1中134所示使用岩棉或蛭石法生成的微生物的毛状根。在一些实施方案中，可以使用收获的微生物的毛状根进行检测，如图1中136所示，其中示出了多孔检测。
根据一些实施方案，微生物的毛状根系统、方法和组合物可解决植物病理学中长期存在的问题以培养难养微生物和/或能够实现难养微生物的转化生物学和遗传学研究。例如，微生物的毛状根系统可用于快速筛选新型抗性基因、抗菌化合物、杀菌剂等。这种筛选可以帮助抵抗诸如zc和hlb的破坏性疾病。还可以利用微生物的毛状根来更好地了解宿主-病原体-载体之间发生的相互作用。因此，本文公开的微生物的毛状根系统、方法和组合物可通过帮助开发潜在破坏性的难养植物病原体的控制策略来促进美国农业和植物疾病管理。
本文公开的微生物的毛状根平台和系统可以整合到鉴定新型抗性基因和抗菌化合物的程序中。例如，该系统可以帮助实现在植物(例如番茄、马铃薯、柑橘)微生物的毛状根系统中候选疾病抗性基因和抗菌分子(例如抗生素、香精油、氧化脂类)的快速功能和化学遗传筛选。由于发根根瘤菌可以有效地在多种双子叶和单子叶植物中诱导毛状根，所以公开的原理还可以建立用于除维管-限制的植物细菌(例如真菌、病毒、类病毒和有益的内生菌)之外的其他作物和植物微生物联合的微生物的毛状根系统。在一些实施方案中，毛状根系统可用于研究植物病原体(例如，经济上重要的植物病原体)及其相应的疾病(例如斑马片(zc)、hlb)。
在一些实施方案中，本公开涉及微生物的毛状根平台，其用于难养维管定殖的植物微生物(例如病原体)的快速培养、繁殖和功能研究。根据一些实施方案，直接从定殖的植物诱导的微生物-定殖的毛状根可以提供简单、快速和可扩展的平台以培养、繁殖和表征难养维管-限制的植物微生物(例如，在实验室中)。
根据本文公开的一些实施方案，可以使用微生物的毛状根系统进行遗传分析(例如，转基因功能的分析)。在一些实施方案中，毛状根系统可以包括通过转化用发根根瘤菌菌株遗传修饰的植物而从遗传修饰的植物培养毛状根。例如，经过遗传修饰以过表达植物广谱复合物(broad-complex)、tramtrack和bric-abrac(btb)域家族蛋白质、npr1或绿色荧光蛋白质(gfp)的植物可以用发根根瘤菌菌株进行转化以诱导毛状根的产生。在一些实施方案中，被毛状根根瘤菌转化的遗传修饰的植物可以被难养微生物(例如las、lso)定殖。
在一些实施方案中，毛状根系统可以包括用具有一种或多种修饰的t-dna质粒的发根根瘤菌菌株转化植物。例如，在一些实施方案中，可以形成修饰的发根根瘤菌。在一些实施方案中，修饰的发根根瘤菌可包括一种或多种t-dna质粒，每种质粒编码靶基因(例如，npr1、gfp)、crispr/cas、talen或rnai构建体中的至少一种。根据一些实施方案，毛状根系统可包括用具有第一修饰的t-dna质粒和第二修饰的t-dna质粒的发根根瘤菌菌株转化植物，其中第一t-dna质粒和第二t-dna质粒的每一个均编码靶基因、crispr/cas、talen或rnai构建体中的至少一种。在一些实施方案中，t-dna质粒可以编码靶基因文库。因为发根根瘤菌可以同时将t-dna和ri-dna转移到植物细胞中，所以用修饰的发根根瘤菌转化植物可以导致产生表达(例如，过表达)靶基因、crispr/cas、talen或rnai构建体中的至少一种的毛状根的植物的产生。
根据一些实施方案，编码靶基因(例如，npr1、gfp)、crispr/cas、talen或rnai构建体中的至少一种的一种或多种t-dna质粒使用轻度真空渗入或dna轰击可以瞬时递送到毛状根中；从而形成基因修饰的毛状根。
在一些实施方案中，编码靶基因(例如，npr1、gfp)、crispr/cas、talen或rnai构建体中的至少一种的t-dna质粒可以进一步包括报告基因/标记基因(例如gfp、β-葡萄糖醛酸酶[gus]、抗生素抗性基因)。由于用于诱导和选择微生物的毛状根的标准抗生素的用途受到控制，因此可以使用基于绿色荧光蛋白(gfp)或基于gus的筛选(例如，任选地、唯一地)来识别隐匿修饰的t-dna构建体的微生物的毛状根。
在一些实施方案中，可使用逆转录pcr(rt-pcr)、pcr、dna测序、dna印迹分析、rna印迹分析和/或蛋白质印迹分析来确定利用靶基因(例如，npr1、gfp)、crispr/cas、talen或rnai构建体中的至少一种的毛状根的转化。用空的或含有gfp的二元t-dna载体共转化或浸润的毛状根可用作阴性对照。在不偏离本公开的情况下，本领域技术人员会理解可以使用利用靶基因确认转化的其他方法。
靶基因(例如npr1、gfp)、crispr/cas、talen或rnai构建体中的至少一种的评估可以包括难养植物微生物定殖的毛状根系统的效价的定量分析。例如，当与不含有靶基因的定殖的毛状根相比时，参与抗性机制的靶基因可能具有降低的难养植物微生物的效价。难养植物微生物的效价的评估可包括定性或定量评估。
作为例子，毛状根系统可用于进行npr1、gfp基因的遗传分析。广谱复合物、tramtrack和bric-abrac(btb)域蛋白家族在植物中是很保守的并涉及多种植物信号传递途径。例如，植物btb蛋白、npr1可能受到多种非生物和生物胁迫信号的调节，包括水杨酸、茉莉酮酸甲酯、活性氧和拟南芥中的创伤。因此，为了评估npr1基因在对难养植物微生物(例如lso、las)的应答中的潜在作用，可以使用毛状根系统。例如，由其各自的lso或las病原体培养的马铃薯、番茄和柑橘类植物可以用发根根瘤菌菌株转化，该菌株具有含有npr1基因或gfp基因的t-dna质粒。为了确定npr1对lso和las的影响，可以量化在毛状根中过表达npr1的细菌滴度，并与仅表达gfp的对照毛状根比较。例如，所得滴度可能表明npr1基因的表达(例如过表达)促进了对毛状根中lso和las的抗性(或耐受性)。总之，这些测试可以提供使用所公开的微生物的毛状根的快速功能应用。
如受益于本公开内容的本领域技术人员将理解的，可以设想用于培养难养植物病原体的其他等同或替代组合物、装置、方法和系统，这不脱离本文的描述。因此，所示出和描述的执行本公开的方式应被解释为仅是说明性的。
本领域的技术人员可以在不背离本公开的范围的情况下，对步骤的性质、数量和/或布置进行各种改变。根据一些实施方案，可以结合任何其他公开的方法或方法步骤并且以任何顺序来执行每个公开的方法和方法步骤。在出现动词“可能”的地方，除非另有说明，其意图是表达可选的和/或许可的条件，但其用途并不意味着缺乏可操作性。在使用诸如“具有”或“包括”的开放式术语的情况下，受益于本公开的本领域普通技术人员将理解，所公开的特征或步骤可以任选地与附加特征或步骤组合。这样的选择可能不被执行，并且实际上，在一些实施方案中，公开的系统、组合物、装置和/或方法可以排除除本文公开的那些之外的任何其他特征或步骤。未列举的元件、组合物、装置、系统、方法和方法步骤可根据需要或要求被包括或排除。本领域技术人员可以在制备和使用本公开的组合物、装置和/或系统的方法中进行各种改变。
而且，在已经提供范围的情况下，所公开的端点可以被视为特定实施方案期望或要求的精确和/或近似值。如果端点是近似的，则灵活程度可以与范围的数量级成比例地变化。例如，一方面，在约5至约50的范围内的约50的范围端点可以包括50.5，但不是52.5或55，并且另一方面，在约0.5至约50的范围的上下文中约50的范围端点可以包括55，但不包括60或75。另外，在一些实施方案中，可能需要混合和匹配范围端点。而且，在一些实施方案中，公开的每个图(例如，在一个或多个实施例，表格和/或附图中)可以形成范围的基础(例如，所描绘的值+/-约10％，所描绘的值+/-约50％，所描绘值+/-约100％)和/或范围端点。关于前者，在实施例、表格和/或图中描绘的值50可形成例如约45至约55、约25至约100和/或约0至约100的范围的基础。
用于培养难养微生物的装置和/或系统的全部或一部分可以被配置和布置成一次性的、耐用的、可互换的和/或可替换的。这些等价方案和替代方案以及明显的改变和修改意图被包括在本公开的范围内。因此，前述公开内容旨在说明而非限制由所附权利要求所说明的本公开的范围。
标题、摘要、背景技术和小标题是根据法规和/或为了读者的方便而提供的。它们不包括关于现有技术的范围和内容的许可，并且不包括适用于所有公开的实施方案的限制。
实施例
实施例1：产生外植体和/或接种体源
图2a至2g示出了使用携带难养微生物的昆虫载体来产生被难养微生物定殖的植物用作毛状根方法和系统中的外植体的实施例。具体而言，图2a和2b示出了携带lso和不含lso的马铃薯木虱集群(中央单体型)，其保持在texasa&magrilifecenter-weslaco的昆虫笼中。最初在2007年从德克萨斯州达尔哈特市附近的商业马铃薯田收集木虱。如图2a和2b所示，在受控生长箱中，将木虱在茄子上饲养，并保持在25℃，12:12光照:黑暗(l:d)小时的光周期和约50％的相对湿度。定期地，使用16srdnapcr测试木虱集群(例如，携带lso、不含lso)是否存在lso定殖。
为了产生外植体材料，将十只携带lso的成年木虱释放到含有两个月至三个月大的马铃薯和番茄植物的笼中，并且允许饲喂。作为对照，将十只不含lso的木虱释放到含有两个月至三个月大的马铃薯和番茄植物的单独的一组笼中，并允许饲喂。三天后，除去木虱，并且监测感染的马铃薯和番茄植物的叶片症状(萎黄和坏死)。分别如图2d和2f所示，饲喂后2至4周内在暴露于携带lso的木虱的饲喂的番茄和马铃薯植物上开始出现典型的疾病症状。相比之下，那些暴露于不含lso的木虱饲喂的番茄(图2c)和马铃薯(图2e)植物没有表现出疾病症状(分别为图2c和图2e)。
如图2g所示，感染的植物中lso的存在(例如图2d中的番茄和图2f中的马铃薯)通过16srdna的pcr扩增来验证。lso感染的测试阳性的植物材料被用作外植体源(用于体外方法)和用作定殖的植物(用于在植物中的方法)用于微生物的毛状根诱导。
实施例2：培养发根根瘤菌
将发根根瘤菌的新鲜培养物培养至约0.3的光密度(od)。通过离心使培养物成球(pelleted)，并将发根根瘤菌细胞重悬浮于无菌的1/2ms或1/2b5+3％蔗糖培养基中至o.d.为0.3。
实施例3：微生物的毛状根的体外诱导
收获健康植物和被lso定殖的植物的部分，包括子叶、下胚轴、未成熟苗和未成熟根区域。使用含有70％乙醇/2.5％或10％naclo和水的溶液对植物部分进行表面灭菌。如图3a所示，用手术刀将表面灭菌的植物的部分切成块，每个长度约为2厘米。另外，使用无菌的一副细镊子轻轻地损伤每个块，以产生准备的外植体。
如图3b所示，通过浸入如实施例2所述准备的悬浮液中将准备的外植体与发根根瘤菌的悬浮液接触。将浸没的外植体搅拌20分钟。如图3c所示，然后将外植体从发根根瘤菌的悬浮液中移出，并置于1/2ms或1/2b5+3％蔗糖培养基的平板上。将外植体在平板上在约21-25℃培育72小时，从而允许外植体和发根根瘤菌共培养。
共培养后，使外植体经受渗透压力，以降低发根根瘤菌的浓度。如图3d所示，将外植体从1/2ms或1/2b5+3％蔗糖培养基的平板上移除，并置于一定体积的无菌去离子水中。将无菌去离子水中的外植体的悬浮液搅拌约30分钟。如图3e所示，然后移除外植体，并将其转移至1/2ms或1/2b5+3％蔗糖+200mg/l头孢噻肟或100mg/l羧苄青霉素的选择培养基中。
然后将含有外植体的选择培养基的平板置于25℃的培养箱中，并监测毛状根诱导。根据使用的植物种类、外植体源和发根根瘤菌菌株，毛状根在2-6周内出现。
图4a示出了在用发根根瘤菌(菌株atcc15834)转化的番茄外植体上毛状根的体外诱导。图5a示出了在用发根根瘤菌转化的马铃薯外植体上毛状根的体外诱导。图6示出了在用发根根瘤菌(菌株atcc15834)转化的柑橘(尤里卡柠檬)外植体上毛状根的体外诱导。
使用已知根诱导(ri)dna基因rolb和rolc的pcr扩增将该结构证实为毛状根。
图4b示出了用发根根瘤菌(菌株atcc15834)体外诱导的番茄毛状根的pcr验证结果，其中rolb和rolc是转化的毛状根的标记基因。如图4b所示：泳道wt显示未用发根根瘤菌(阴性对照)转化的野生型番茄的dna的pcr扩增；泳道1显示被发根根瘤菌菌株castlemart转化的外植体的毛状根的dna的pcr扩增；泳道2显示被来自加利福尼亚大学82(uc82)的发根根瘤菌菌株转化的外植体的毛状根的dna的pcr扩增；泳道3显示被发根根瘤菌菌株uc82转化的第二外植体的毛状根的dna的pcr扩增；和泳道rh显示来自发根根瘤菌细胞(阳性对照)的dna的pcr扩增。
图5b显示来自用发根根瘤菌(菌株atcc15834)转化的外植体的马铃薯(大西洋)毛状根的pcr验证，其中rolb和rolc是转化的毛状根的标记基因。在图5b中显示的五条泳道中，泳道wt代表来自野生型马铃薯的dna(阴性对照)，泳道1代表马铃薯毛状根样品1，泳道2代表马铃薯毛状根样品2，泳道3代表马铃薯毛状根样品3，以及泳道rh代表发根根瘤菌细胞(阳性对照)。
图6b显示了来自用发根根瘤菌(菌株atcc15834)转化的外植体的柑橘(尤里卡柠檬)毛状根的pcr验证。在图6b中显示的rolb和rolc的各自的两条泳道中，标记hr(毛状根)的泳道代表来自毛状根的dna，泳道wt代表来自野生型柑橘的dna(阴性对照)。
实施例4：气生微生物的毛状根在植物中的诱导和转基因递送
选择健康植物(对照)和感染lso的植物，使用含有70％乙醇、2.5％或10％naclo(漂白剂)和水的溶液对选择的植物表面进行表面灭菌。如实施例2所述准备发根根瘤菌的悬浮液。
通过使用浸入发根根瘤菌溶液中的针轻轻地损伤lso定殖的植物的表面灭菌区域的茎组织和/或叶组织进行气生微生物的毛状根的诱导。所使用的发根根瘤菌菌株含有ri-dna质粒和t-dna质粒，其中t-dna质粒编码绿色荧光蛋白(gfp)。还使用上述用作实验对照的方法诱导健康植物用于气生毛状根形成。将暴露的伤口部位用铝箔包裹以减少暴露于光并有助于在暴露区域保持所需的湿度水平。将植物保持在具有适合每种植物物种的温度、光照和湿度条件的生长室中。监测植物的微生物的毛状根的形成。图7a示出了健康番茄植物上气生毛状根的形成。图7b示出了在lso定殖的番茄植物上气生微生物的毛状根的形成。图8a示出了在lso定殖的马铃薯植物上气生微生物的毛状根的形成。
使用已知根诱导(ri)dna基因rolb和rolc的pcr扩增证实该结构为微生物的毛状根。如图7c所示，使用来自图7a和7b中描绘的微生物的毛状根的dna样品进行气生微生物的毛状根组织的pcr验证。设计引物以扩增lso的16srdna(在标记16srdna的行中标签)、来自毛状根转化的rolb和rolc标记基因、内源番茄基因rpl(对照)和在t-dna质粒上编码的gfp基因。收集来自健康植物组织的dna并使用引物组进行扩增。代表健康植物dna的图7c的泳道如下：wt代表来自野生型番茄植物的dna(阴性对照)，cl代表来自健康番茄叶片的dna(阴性对照)，以及chr代表来自健康毛状根的dna(16srdna引物的阴性对照)。还从lso感染的植物组织提取dna，植物组织包括：lso感染的番茄的顶部叶(tl)、lso感染的番茄的中部叶(ml)和来自lso感染的番茄的气生微生物的毛状根(hr)。对lso感染的组织进行三次复制。如图7c所示，chr和hr样品复制了rolb和rolc基因；从而表明这些实际上是毛状根。hr(而不是chr)扩增了16srdna片段，确定hr是lso定殖的。
运行单独的pcr凝胶以确认ri-dna质粒(编码rolb和rolc)和t-dna质粒(编码gfp)的共转化。对于该包含t-dna载体(标记为v)的凝胶质粒dna，使用gfp引物组提取并扩增。如图7c所示，这用作用于gfp的扩增的阳性对照。图7c显示，在chr和hr样品中，gfp基因被扩增，确定ri-dna和t-dna在气生毛状根的产生过程中共转化。
图8b示出了取自图8a所示的lso感染的马铃薯的21日龄的lso感染的气生毛状根样品中的16srdna的pcr扩增。rpl基因的扩增用作阳性对照。图8c示出了来自健康(“h”)马铃薯植物和lso感染(“l”)的马铃薯植物的毛状根组织中的rolb、rolc和gfp基因的pcr扩增；从而确定ri-dna和t-dna在气生毛状根的产生过程中共转化。
实施例5：使用岩棉法的微生物的毛状根在植物中的诱导和转基因递送
选择健康番茄植物(对照)和用lso感染的番茄植物，并使用含有70％乙醇、2.5％或10％naclo(漂白剂)和水的溶液对选择的植物表面进行表面灭菌。如实施例2所述，准备发根根瘤菌的悬浮液。发根根瘤菌包含ri-dna质粒(包括rolb和rolc基因)和编码gfp的t-dna质粒。
使用手术刀去除所选番茄植物的芽部分，并将芽的创伤部分插入岩棉基质中。使用一定体积的发根根瘤菌悬浮液使岩棉基质饱和，并将基质置于培养容器中以保持高湿度水平。允许发根根瘤菌与健康番茄植物和lso感染的番茄植物的伤口部位共培养72小时。72小时后，除去岩棉基质并使岩棉干燥，从而杀死大部分发根根瘤菌。将岩棉基质在再水化之前暴露于周围环境大约24小时。将经处理的芽和岩棉基质转移至具有营养液(1/2ms或1/2b5)的新的塑料品红色盒式培养容器中，并置于昼夜生长室中以及监测微生物的毛状根的产生。
图9a显示了lso感染的番茄植物上微生物的毛状根的产生。
进行pcr验证以确认微生物的毛状根构建体、用lso的微生物根的定殖以及与ri-dna和t-dna质粒的共转化。图9b示出了来自健康(“h”)马铃薯植物和lso感染(“l”)的马铃薯植物的毛状根组织中rolb、rolc和gfp基因的pcr扩增；从而确定在与发根根瘤菌共培养期间ri-dna和t-dna被共转化。正如所料，16srdna只在lso感染的微生物的毛状根中扩增。
实施例6：使用蛭石法的微生物的毛状根在植物中的诱导和转基因递送
选择健康植物(对照)和感染lso的植物，使用含有70％乙醇、2.5％或10％naclo(漂白剂)和水的溶液对选择的植物表面进行表面灭菌。如实施例2所述，准备发根根瘤菌的悬浮液。发根根瘤菌包含ri-dna质粒(包括rolb和rolc基因)和编码gfp的t-dna质粒。
使用手术刀去除所选植物的芽部分，并将芽的伤口部分浸没在发根根瘤菌悬浮液中。产生约30inhg的真空环境并保持30分钟。释放真空后，将芽从发根根瘤菌悬浮液中移出，并置于蛭石基质中。将芽放置在覆盖的托盘中，在25℃、光照/黑暗循环为14小时光照后接着10小时黑暗的生长室中。监测芽的微生物的毛状根产生。
图10a示出了使用蛭石法诱导的番茄植物的微生物的毛状根生长。进行pcr验证以确认微生物的毛状根构建体、用lso的微生物的根的定殖以及与ri-dna和t-dna质粒的共转化。图10b示出了来自健康(“h”)番茄植物和lso感染(“l”)的番茄植物的毛状根组织中rolb、rolc和gfp基因的pcr扩增；从而确定在与发根根瘤菌共培养期间ri-dna和t-dna被共转化。正如所料，16srdna仅在lso感染的微生物的毛状根中扩增。
图11示出了使用蛭石法来自柑橘(酸橙)的芽的微生物的毛状根的产生。
实施例7：毛状根的繁殖——蛭石法
收获的毛状根可以被克隆繁殖。收获的毛状根的克隆繁殖可以提供包含在收获的毛状根中的难养微生物的增加的来源(例如，微生物的毛状根接种体)。
选择如上面实施例4中所述的由健康番茄植物和lso感染的番茄植物产生的毛状根用于繁殖。将番茄植物在产生气生毛状根的部位下面直接切割，并丢弃植物的下部茎和根部。保留附着于气生毛状根的芽部分(即附着的毛状根)。
通过将根浸没在70％乙醇溶液，2.5％或10％漂白剂溶液中，然后用去离子水冲洗，对气生毛状根进行表面灭菌。然后将附着的毛状根移植到蛭石基质中。将移植的附着的毛状根置于25℃、光照/黑暗周期为14小时光照后接着10小时黑暗的生长室中。监测芽的毛状根的繁殖情况。图12示出了从含蛭石的罐的底部生长的繁殖的毛状根。
实施例8：微生物的毛状根的繁殖——水培法
选择如上面实施例4中所述的由健康番茄植物和lso感染的番茄植物产生的毛状根用于繁殖。当它们达到至少3厘米的长度时收获番茄植物的气生毛状根。通过将收获的根浸没在70％乙醇溶液，2.5％或10％漂白剂溶液中，然后用去离子水冲洗对收获的气生毛状根进行表面灭菌。然后将收获的毛状根置于含有1/2ms或1/2b5+3％蔗糖+200mg/l头孢噻肟或100mg/l羧苄青霉素和2.5mg/l两性霉素b的烧杯中。将水培培养物保持在25℃、以50或100rpm的轻轻搅拌。图13示出了在水培培养物中生长的繁殖的毛状根。
实施例9：微生物的毛状根的繁殖——体外方法
选择如上面实施例4中所述的由健康番茄植物和lso感染的番茄植物产生的毛状根用于繁殖。当它们达到至少3厘米的长度时收获番茄植物的气生毛状根。通过将收获的根浸没在70％乙醇溶液，2.5％或10％漂白剂溶液中，然后用去离子水冲洗对收获的气生毛状根进行表面灭菌。然后将收获的毛状根置于含有1/2ms或1/2b5+3％蔗糖+200mg/l头孢噻肟或100mg/l羧苄青霉素和2.5mg/l两性霉素b的平板上。将体外培养物保持在25℃。图14示出了在水培培养物中生长的繁殖的毛状根。每周用新鲜培养基替换营养培养基。
实施例10：微生物的毛状根的繁殖——生物反应器方法
选择如上面实施例9中所述的由健康番茄植物和lso感染的番茄植物产生的毛状根用于使用生物反应器方法进行繁殖。通过将收获的根浸没在70％乙醇溶液，2.5％或10％漂白剂溶液中，然后用去离子水冲洗，对从体外培养或在植物中的方法收获的毛状根进行表面灭菌，并置于含有1/2ms或1/2b5+3％蔗糖+200mg/l头孢噻肟或100mg/l羧苄青霉素和2.5mg/l两性霉素b的setis系统中。将生物反应器培养物保持在25℃。图15示出了在生物反应器系统中生长的繁殖的毛状根。每三到四周用新鲜的培养基替换营养培养基。
实施例11：高通量抗菌测定
使用微生物的毛状根来分析lso是否被抗生素(例如青霉素)抑制。如图16a所示，从体外或在在植物中的繁殖收获健康的毛状根和lso定殖的微生物的毛状根。将毛状根分开并称重成等量(例如50或100mg/每孔)，而不损坏结构完整性。如图16b所示，将健康毛状根和lso定殖的微生物的毛状根类似地分配为三个或更多个生物复制中到多孔板的孔中。将2毫升1/2ms或1/2b5培养基置于多孔板的每个对照孔中，浸没毛状根，作为阴性对照。将2毫升1/2ms或1/2b5+100mg/l青霉素培养基置于多孔板的每个实验孔中，浸没毛状根。将多孔板置于真空环境中，并抽至25inhg的压力15至30分钟。将带有毛状根的多孔板用铝箔覆盖，以防止暴露于光和可能的抗生素降解。然后将其各自处理的多孔板在25℃的温度下在振荡器(50rpm)上温和振荡培育2天和7天。
使用定量实时pcr来评估使用引物扩增16srdna序列的lso效价。如图16c和16d所示，在暴露2天和7天后，暴露于青霉素的lso定殖的微生物的毛状根显示出比未暴露于青霉素的lso定殖的微生物的毛状根显著更低的lso效价。