质构化乳酸菌的新型EPS基因簇的制作方法

本发明涉及具有改进的质构化(texturizing)性质的新型乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcuslactissubsp.lactis)乳酸菌株。本发明还涉及使用所述菌株制造食品的方法。

背景技术

乳酸菌(lab)被食品工业广泛用于食品发酵。

通过lab将新鲜乳转化为发酵乳是延长乳的寿命的一种方式并提供风味和质构(texture)。

因此，用于乳发酵的菌株的重要特征包括快速酸化、稳定的(无/低)后酸化、长的贮藏寿命和良好的质构。良好的质构通常是高口腔厚重感(mouththickness)(使用流变仪作为高剪切应力测量)和高凝胶硬度。

一些lab菌株显著促成与其产生胞外(或细胞外)多糖(eps)的能力相关的改善的质构，所述胞外多糖可以是荚膜状的(以荚膜形式保持附着于细胞)或分泌到培养基中。eps由单一类型的糖或由不同糖构成的重复单元组成。产生eps的lab值得关注，因为eps充当发酵食品的天然增粘剂和质构增强剂。此外，来自具有确定的流变学性质的食品级lab的eps具有发展和开发为食品添加剂的潜力。

发酵乳可以由导致例如酸乳的嗜温lab例如乳球菌属物种(lactococcussp.)生产，或由用于酸奶的嗜热lab例如嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)和德氏乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillusdelbruckiisubsp.bulgaricus)生产。

用嗜温起子培养物例如乳酸乳球菌乳酸亚种菌株和乳酸乳球菌乳脂亚种(lactococcuslactissubsp.cremoris)菌株的组合制备的乳制品例如新鲜奶酪、酪乳(buttermilk)、酸乳和酸奶油在消费者中有普遍需求。

乳球菌属物种菌株通常产生少量的eps。

期望发现比质构化乳酸乳球菌乳酸亚种菌株更多的质构化乳酸乳球菌乳脂亚种菌株，因为乳脂亚种菌株对于乳环境更特化，因为它们通常是从乳制品中分离出来的，而乳酸亚种菌株可以从例如植物中分离。

尽管已经报道了一些乳酸乳球菌乳酸亚种菌株的eps生产(pan和mei2010；suzuki等2013)，但其eps簇的结构尚未得到阐明。pan和mei(2010)表征了由乳酸乳球菌乳酸亚种生产的eps，该亚种是从酸白菜(chinesepickledcabbage)中分离出来的，但不知道该菌株是否能够酸化乳并促成其质构。没有报道该菌株的eps基因(pan和mei，2010)。suzuki等(2013)报道了5种乳球菌菌株中的高度保守的epsd基因和菌株特异性epse基因的序列，其中两种菌株来自乳酸亚种二乙酰乳酸生物变种，两种菌株来自乳脂亚种。然而，既没有完整的eps基因簇信息，也没有由这些菌株产生的eps是否能够增强乳质构的信息。值得注意的是，并非所有产生eps的lab菌株都能使乳酸化，而且lab菌株产生eps的能力也不能确保它们在乳中增强的质构化性质，所述质构化性质与乳凝胶粘度和粘性有关。eps的类型及其与乳蛋白的相互作用是质构发展的决定性因素。eps可通过充当填料而影响酪蛋白凝胶结构的形成。因此，eps对蛋白基质和结构形成的影响取决于它们的浓度、与蛋白的相互作用以及分子和流变学特征。例如，已报道使用产生eps的嗜热链球菌、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)和乳酸乳球菌乳酸亚种生产酸奶(ai等，专利cn101331900)。尚不清楚粘度是如何测量的、以及在相同条件下用不产生eps的菌株发酵的乳的粘度会是多少、在所用发酵条件下发酵乳粘度的基础水平是什么来表明的，但是与用测试的剩余菌株例如tx(嗜热链球菌)、kl1和j1(干酪乳杆菌)发酵的乳相比，用ks4(乳酸乳球菌乳酸亚种)发酵的乳的粘度最低(cn101331900的表4)。在由这些菌株产生的eps的量(cn101331900的表3)与所得乳粘度(cn101331900的表4)之间似乎存在负相关。例如，嗜热链球菌菌株tx产生最低量的eps，但导致粘度最高的乳，而乳酸乳球菌乳酸亚种菌株ks4产生最高量的eps，但导致粘度最低的乳(cn101331900的表3和表4)。这些结果证实，eps结构和与乳成分的相互作用对于乳质构发展而言至少与产生的eps的量同样重要。没有报道关于所提及的菌株的eps基因簇的信息(cn101331900)。

2015年4月27日在ncbi数据库中可获得其完整基因组或重叠群或支架的13种乳酸乳球菌乳酸亚种菌株中，没有一种菌株被报道为质构化的(细节见实施例3)。由于嗜温培养物用于发酵乳制品，并且质构是重要参数，因此工业上对质构化嗜温菌株例如乳酸乳球菌乳酸亚种的兴趣日益增加。

技术实现要素：

本发明的一个目标是提供适用于制备食品的新型质构化乳酸菌菌株。具体而言，提供适用于制备嗜温食品的质构化乳酸乳球菌乳酸亚种菌株是有益的。

已经通过质构化乳酸乳球菌乳酸亚种菌株解决了这个目标，所述菌株包含如本文所述的新颖的eps基因簇。

如本文的工作实施例中所讨论的(参见例如图1)，本文公开的新型乳酸乳球菌乳酸亚种chcc11848(保藏为dsm29291)具有优异的质构化性质。

本发明人分析了chcc11848的eps基因簇，并鉴定了新的基因序列，其被认为参与胞外多糖(eps)的产生并由此涉及乳酸乳球菌乳酸亚种chcc11848菌株的优异质构化特性。

本文公开的由seqidno:8-13和seqidno:16表示的序列相对于现有技术是新颖的。

不受理论限制，没有充足的理由认为以下是不可行的：包含与chcc11848菌株的本文所述的新颖的特征性eps基因簇基因/序列相似的eps基因簇基因/序列的另一乳酸乳球菌乳酸亚种菌株(即，不同于特定的chcc11848菌株)也具有改进的质构化性质。

因此，本发明的第一方面涉及质构化乳酸乳球菌乳酸亚种乳酸菌菌株，其包含能够产生胞外多糖(eps)的活性eps基因簇；

其中所述eps基因簇的特征在于其包含选自由以下组成的组的至少一种核苷酸序列：

(a)：编码具有聚合酶活性的多肽的核苷酸序列，并且其中所述多肽与由seqidno:9的核苷酸序列(本文称为wzy)编码的氨基酸序列具有至少70％的同一性；

(b)：编码具有多糖转运蛋白活性的多肽的核苷酸序列，并且其中所述多肽与由seqidno:12的核苷酸序列(本文称为wzx)编码的氨基酸序列具有至少80％的同一性；和

(c)：至少一种编码具有糖基转移酶(gt)活性的多肽的核苷酸序列，所述多肽选自由以下组成的组：

(c1)：所述多肽与由seqidno:8的核苷酸序列编码的氨基酸序列(本文称为gt1)具有至少70％的同一性；

(c2)：所述多肽与由seqidno:10的核苷酸序列编码的氨基酸序列(本文称为gt2)具有至少70％的同一性；和

(c3)：所述多肽与由seqidno:11的核苷酸序列编码的氨基酸序列(本文称为gt3)具有至少70％的同一性。

如本文所讨论的，seqidno:16示出了对应于seqidno:1的核苷酸4171至11267的chcc11848的eps簇的可变部分的7097-bp核苷酸序列。

第一方面的seqid编号全部存在于chcc11848的eps簇的可变部分(即seqidno:16)中。

关于乳酸菌菌株，术语“胞外多糖(eps)”是众所周知的，技术人员可以常规地确定感兴趣的乳酸菌是否产生eps。

如本领域技术人员已知和理解的，产生eps的感兴趣的乳酸菌包含活性eps基因簇。

如本领域技术人员已知的，活性eps基因簇包含涉及eps生物合成的调节和调整的基因和参与寡糖重复单元的生物合成和输出的基因，包括糖基转移酶(gt)、聚合酶和转运蛋白。

简而言之且如本领域技术人员所理解的，由于第一方面的乳酸菌菌株能够产生和输出胞外多糖(eps)，因此它包含活性eps基因簇。

关于第一方面的项目(a)，对技术人员而言确定感兴趣的多肽是否具有所需的聚合酶活性是常规工作。

在本申请的申请日时，就seqidno:9而言，本发明人相信最接近的现有技术公布的功能上相似的序列与seqidno:9具有小于45％的同一性。

关于第一方面的项目(b)，对技术人员而言确定感兴趣的多肽是否具有所需的多糖转运蛋白活性是常规工作。

在本申请的申请日时，就seqidno:12而言，本发明人相信最接近的现有技术公布的功能上相似的序列与seqidno:12具有小于75％的同一性。

关于第一方面的项目(b)，具有多糖转运蛋白活性的多肽可以可选地被称为具有多糖输出活性的多肽。

关于第一方面的项目(c)，对技术人员而言确定感兴趣的多肽是否具有所需的糖基转移酶(gt)活性是常规工作。

在本申请的申请日时，就seqidno:8而言，本发明人相信最接近的现有技术公布的功能上相似的序列与seqidno:8具有小于55％的同一性。

在本申请的申请日时，就seqidno:10而言，本发明人相信最接近的现有技术公布的功能上相似的序列与seqidno:10具有小于50％的同一性。

在本申请的申请日时，就seqidno:11而言，本发明人相信最接近的现有技术公布的功能上相似的序列与seqidno:11具有小于55％的同一性。

本发明的第二方面涉及一种生产食品的方法，其包括至少一个阶段，在所述阶段中使用至少一种根据第一方面的乳酸菌菌株或本文所述的任何其实施方案。

定义

本文相关术语的所有定义与本领域技术人员关于本文相关技术背景所理解的一致。

本说明书和权利要求书中的“质构化菌株”意指这样的菌株：所述菌株优选产生在下述和如本文实施例1中举例说明的条件下具有在剪切速率300s^-1下测量的优选大于40pa的剪切应力的发酵乳。

乳酸乳球菌乳酸亚种菌株可被定义为强质构化的，因为它产生的发酵乳在相同的条件下具有在剪切速率300s^-1下测量的大于50pa的剪切应力。

本发明的质构化乳酸菌菌株可以是分离的菌株，例如从天然存在的来源分离的菌株，或者可以是非天然存在的菌株，例如经重组制备的菌株。重组菌株与天然存在的菌株的不同之处在于至少用于转化或转染母株的核酸构建体(一种或多种)的存在。

术语“序列同一性”涉及两条核苷酸序列之间或两条氨基酸序列之间的相关性。

为了本发明的目的，两条核苷酸序列或两条氨基酸序列之间的序列同一性程度分别使用针对核苷酸序列(dna)或氨基酸序列(蛋白)的clustalw版本2(clustalw2)的序列比对方法确定，以默认参数(比对类型：慢；dna加权矩阵：iub；蛋白加权矩阵：gonnet；缺口开口：10；缺口延伸：0.1)进行如larkin等(2007,bioinformatics23:2947-2948)和goujon等(2010,nucleicacidsresearch38suppl:w695-699)所述的成对比对，其可通过clc软件获得。

在本发明上下文中，术语“衍生自…的菌株”和“衍生的菌株”应理解为这样的菌株：所述菌株借助于例如基因工程、辐射和/或化学处理、和/或选择、适应(adaptation)、筛选等而衍生自本发明的菌株。优选衍生的菌株是功能上等同的突变体，例如就质构化能力而言与母株具有基本相同或改进的性质的菌株。这类衍生的菌株是本发明的一部分。特别地，术语“衍生的菌株”是指通过使本发明的菌株经历任何常规使用的诱变处理而获得的菌株或指自发发生的突变体，所述诱变处理包括用化学诱变剂(如乙烷甲烷磺酸盐(ems)或n-甲基-n'-硝基-n-硝基胍(ntg))、紫外线进行的处理。突变体可经历几次诱变处理(单次处理应理解为一个诱变步骤，然后是筛选/选择步骤)，但本发明优选进行不超过20次、不超过10次、或不超过5次处理。在本发明优选的衍生菌株中，与母株相比，细菌基因组中小于1％、或小于0.1％、小于0.01％、小于0.001％或甚至小于0.0001％的核苷酸已被改变(例如通过替换、插入、缺失或其组合)。

本文中的术语“嗜热(thermophilic)”是指在35℃以上的温度生长最好的微生物。工业上最有用的嗜热菌包括链球菌属物种(streptococcusspp.)和乳杆菌属物种(lactobacillusspp.)。本文中的术语“嗜热发酵”是指在约35℃以上，例如在约35℃至约45℃之间的温度的发酵。术语“嗜热发酵乳制品”是指通过嗜热起子培养物的嗜热发酵而制备的发酵乳制品，其包括诸如凝固型酸奶、搅拌型酸奶和饮用型酸奶例如养乐多(yakult)等的发酵乳制品。

本文中的术语“嗜温(mesophilic)”是指在中等温度(15℃-35℃)生长最好的微生物。工业上最有用的嗜温菌包括乳球菌属物种(lactococcusspp.)和明串珠菌属物种(leuconostocspp.)。本文中的术语“嗜温发酵”是指在约22℃至约35℃之间的温度的发酵。术语“嗜温食品”是指通过嗜温起子培养物的嗜温发酵而制备的食品。术语“嗜温发酵乳制品”是指通过嗜温起子培养物的嗜温发酵而制备的发酵乳制品，其包括诸如酪乳、酸乳、培养乳、斯美塔纳(smetana)、酸奶油、克非尔(kefir)和新鲜奶酪例如夸克(quark)、tvarog和奶油奶酪等的发酵乳制品。

本文中的术语“嗜温起子培养物”是指含有至少一种嗜温细菌菌株的任何起子培养物。嗜温起子培养物例如乳酸乳球菌乳酸亚种菌株和乳酸乳球菌乳脂亚种菌株的组合，用于生产发酵乳制品，例如新鲜奶酪、酪乳、酸奶和酸奶油。

术语“发酵乳”和“乳制品”在本文中可互换使用。

在描述本发明的上下文中使用的术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”以及类似的指称对象应被解释为涵盖单数和复数两者，除非在本文中另外指出或明显与上下文矛盾。因此，“一个”、“一种”和“该”可以意指至少一个/种或一个/种或多个/种。

关于本发明，剪切应力可以通过以下方法测量：

在孵育后的当天，使发酵乳制品达到13℃，并通过装有钻孔盘的棒手动轻轻搅拌，直至样品均匀。在流变仪(具有asc(automaticsamplechanger，自动样品更换器)的antonpaarphysicarheometer,antongmbh,奥地利)上通过使用浮杯(bob-cup)评估样品的流变学性质。在测量期间流变仪被设定为13℃的恒定温度。设置如下：

保持时间(在某种程度上重建至最初的结构)

5分钟，在没有任何物理应力(振荡或旋转)应用于样品的情况下。

振荡步骤(以分别测量弹性模量和粘性模量g’和g”，从而计算复数模量g*)

恒定应变＝0.3％，频率(f)＝[0.5…8]hz

在60s内6个测量点(每10s一个)

旋转步骤(从而以3001/s测量剪切应力)

设计了两个步骤：

剪切速率＝[0.3-300]1/s和2)剪切速率＝[275-0.3]1/s。

每个步骤包含在210s内的21个测量点(每10s一个)

选择3001/s下的剪切应力用于进一步分析，因为这与吞咽发酵乳制品时的口腔厚重感相关。

可选地，可以通过以下方法测量剪切应力：通过在富含2％脱脂乳粉的半脂乳(1.5％脂肪)中接种相同的微生物培养物而获得剪切应力数据；将乳在90℃加热20分钟并冷却至接种温度，然后接种1％过夜微生物培养物。接种在30℃，以200-ml规模进行12-15小时，直至ph～4.55，然后冷却至4℃并在4℃储存5天。储存后，通过装有钻孔盘的棒轻轻搅拌发酵乳，直至样品均匀。使用下列设置在流变仪(具有asc(自动样品更换器)的antonpaarphysicarheometer,antongmbh,奥地利)上评估样品的剪切应力。

-等待时间(在某种程度上重建至最初的结构)

-5分钟，在没有振荡或旋转的情况下

-旋转(以测量在300s^-1的剪切应力等)

-γ’＝[0.2707-300]s^-1和y’＝[275-0.2707]s^-1

上升至300s^-1的在210s内的21个测量点(每10s一个)

和下降至0.2707s^-1的在210s内的21个测量点(每10s一个)

对于数据分析，选择剪切速率300s^-1下的剪切应力。

附图说明

图1阐述了来自科汉森菌株保藏所(chr.hansen’sstraincollection)的选定乳酸乳球菌乳酸亚种菌株的tadm(压力曲线导出结果)和流变仪数据。在菌株g的基因组中没有发现eps簇，因此该菌株未在图2-3中显示。从在微量滴定板中制备的1ml样品获得tadm数据，所述样品在30℃接种20小时；因此样品端(end)ph的变化(ph≤4.55)取决于不同菌株在酸化乳的方面有多快。使用汉密尔顿液体处理装置测量吸液和放液(aspirationanddispense)过程中的压力(tadm)。剪切应力数据通过如下手段获得：以200ml规模接种菌株，直至它们达到ph～4.55，然后使用流变仪进行流变学测量。“乳”是指没有接种任何菌株的b-乳。

图2描述了来自科汉森培养物保藏所的乳酸乳球菌乳酸亚种菌株和在图3b中描述的几种公众可获得的乳酸乳球菌基因组的eps簇的概述。基于在ncbi网页上使用默认参数针对refseq蛋白数据库的blast分析，根据其已证实或预测的功能对orf进行注释。由于eps基因命名的差异，属于公众可获得的序列的一些自动注释在本文重新命名以能够进行eps基因簇比较。在结构上与公众可获得的序列的orf相似的、来自科汉森培养物保藏所菌株的eps簇的orf以相同的方式被注释，例如菌株f的eps簇如在ho2中那样注释。gt，糖基转移酶；is，转座酶；hypot，假定蛋白。

图3a显示了使用clcmainworkbench7软件的“alignmentsandtrees(比对和树)”工具集中的“createtree(生成树)”工具(构建方法：upgma；核苷酸取代模型：jukescantor；使用200个重复进行自举(bootstrapping))构建的、来自科汉森培养物保藏所的乳酸乳球菌乳酸亚种菌株和几种公众可获得的乳酸乳球菌基因组的eps簇的系统发育树。图3b描绘了公众可获得序列中的eps簇的定位。图3c显示了在核苷酸水平上在图2和3a所示的eps簇的同一性百分比矩阵。

图4显示了乳酸乳球菌菌株nizob40、chcc11848、嗜热链球菌lmd-9和肺炎链球菌(s.pneumoniae)d39的eps簇的基因结构。以不同的颜色标记基因功能分组。用连线表示具有相似功能的eps基因的相对定位。箭头表示以相反的转录意义(transcriptionalsense)定向的基因。功能未知的基因以白色表示；不太可能参与eps生物合成的基因以灰色表示；转座酶样orf以黑色表示；截短的基因显示为短框。gt，糖基转移酶；init，起始；polym，聚合；transp，转运；ndp-糖，核苷酸二磷酸-糖。

图5描绘了经鉴定的orf的基因结构、由chcc11848的eps基因簇编码的假定蛋白的预测性质以及预测的蛋白与其它细菌中的蛋白的比较。针对非冗余(nr)蛋白、refseq_蛋白和肺炎链球菌(taxid：1313)数据库，使用ncbi的blastp工具(默认参数)，在2015年5月13日进行blast分析；显示每次分析的最高分数。使用interpro和pfam工具鉴定蛋白结构域。然而，只有当针对nr的blastp分析结果与从refseq_蛋白数据库获得的结果不同时，才显示针对nr的blastp分析结果。e值(期望值)是预期在数据库搜索中偶然发生的比对的数目，其中查询序列的相似性分数等于或优于所得序列的相似性分数；它表示为10的指数。gt，糖基转移酶；is，转座酶；hypot，假定蛋白；eps，胞外多糖；aa，氨基酸。

序列表简述

seqidno:1列出了chcc11848的eps簇的13097-bp核苷酸序列。

seqidno:2列出了对应于seqidno:1的核苷酸1至318的epsr基因的开放阅读框(orf)。

seqidno:3列出了对应于seqidno:1的核苷酸352至1119的epsx基因的orf。

seqidno:4列出了对应于seqidno:1的核苷酸1159至1938的epsa基因的orf。

seqidno:5列出了对应于seqidno:1的核苷酸1948至2643的epsb基因的orf。

seqidno:6列出了对应于seqidno:1的核苷酸2698至3462的epsc基因的orf。

seqidno:7列出了对应于seqidno:1的核苷酸3484至4170的epsd基因的orf。

seqidno:8列出了对应于seqidno:1的核苷酸4177至5298和对应于seqidno:16的核苷酸7至1128的、编码推定gt1蛋白的orf。

seqidno:9列出了对应于seqidno:1的核苷酸5562至6665和对应于seqidno:16的核苷酸1392至2495的推定wzy基因的orf。

seqidno:10列出了对应于seqidno:1的核苷酸6686至7561和对应于seqidno:16的核苷酸2516至3391的、编码推定gt2蛋白的orf。

seqidno:11列出了对应于seqidno:1的核苷酸7558至8454和对应于seqidno:16的核苷酸3388至4284的、编码推定gt3蛋白的orf。

seqidno:12列出了对应于seqidno:1的核苷酸8605至10026和对应于seqidno:16的核苷酸4435至5856的推定wzx基因的orf。

seqidno:13列出了对应于seqidno:1的核苷酸10080至11246和对应于seqidno:16的核苷酸5910至7076的推定ugd基因的orf。

seqidno:14列出了对应于seqidno:1的核苷酸11268至12170的epsl基因的orf。

seqidno:15列出了orfy基因的orf的互补链的核苷酸序列，其对应于seqidno:1的核苷酸12195至1397。

seqidno:16列出了对应于seqidno.1的核苷酸4171至11267的、chcc11848的eps簇的可变部分的7097-bp核苷酸序列。

seqidno:17列出了由seqidno:2编码的氨基酸序列。

seqidno:18列出了由seqidno:3编码的氨基酸序列。

seqidno:19列出了由seqidno:4编码的氨基酸序列。

seqidno:20列出了由seqidno:5编码的氨基酸序列。

seqidno:21列出了由seqidno:6编码的氨基酸序列。

seqidno:22列出了由seqidno:7编码的氨基酸序列。

seqidno:23列出了由seqidno:8编码的氨基酸序列。

seqidno:24列出了由seqidno:9编码的氨基酸序列。

seqidno:25列出了由seqidno:10编码的氨基酸序列。

seqidno:26列出了由seqidno:11编码的氨基酸序列。

seqidno:27列出了由seqidno:12编码的氨基酸序列。

seqidno:28列出了由seqidno:13编码的氨基酸序列。

seqidno:29列出了由seqidno:14编码的氨基酸序列。

seqidno:30列出了由seqidno:15的互补链编码的氨基酸序列。

具体实施方式

质构化乳酸乳球菌乳酸亚种乳酸菌菌株

如上所述，本发明的第一方面涉及质构化乳酸乳球菌乳酸亚种乳酸菌菌株，其包含能够产生胞外多糖(eps)的活性eps基因簇；

其中所述eps基因簇的特征在于其包含选自由以下组成的组的至少一种核苷酸序列：

(a)：编码具有聚合酶活性的多肽的核苷酸序列，并且其中所述多肽与由seqidno:9的核苷酸序列(本文称为wzy)编码的氨基酸序列具有至少70％的同一性；

(b)：编码具有多糖转运蛋白活性的多肽的核苷酸序列，并且其中所述多肽与由seqidno:12的核苷酸序列(本文称为wzx)编码的氨基酸序列具有至少80％的同一性；和

(c)：至少一种编码具有糖基转移酶(gt)活性的多肽的核苷酸序列，所述多肽选自由以下组成的组：

(c1)：所述多肽与由seqidno:8的核苷酸序列编码的氨基酸序列(本文称为gt1)具有至少70％的同一性；

(c2)：所述多肽与由seqidno:10的核苷酸序列编码的氨基酸序列(本文称为gt2)具有至少70％的同一性；和

(c3)：所述多肽与由seqidno:11的核苷酸序列编码的氨基酸序列(本文称为gt3)具有至少70％的同一性。

优选地，第一方面的质构化乳酸菌是lab，其中

(a)：编码具有聚合酶活性的多肽的核苷酸序列与由seqidno:9的核苷酸序列(本文称为wzy)编码的氨基酸序列具有至少80％的同一性；

(b)：编码具有多糖转运蛋白活性的多肽的核苷酸序列与由seqidno:12的核苷酸序列(本文称为wzx)编码的氨基酸序列具有至少85％的同一性；和

(c)：编码具有糖基转移酶(gt)的多肽的核苷酸序列：

(c1)：与由seqidno:8的核苷酸序列编码的氨基酸序列(本文称为gt1)具有至少80％的同一性；

(c2)：与由seqidno:10的核苷酸序列编码的氨基酸序列(本文称为gt2)具有至少80％的同一性；和

(c3)：与由seqidno:11的核苷酸序列编码的氨基酸序列(本文称为gt3)具有至少80％的同一性。

优选地，第一方面的质构化乳酸菌是lab，其中

(a)：编码具有聚合酶活性的多肽的核苷酸序列与由seqidno:9的核苷酸序列(本文称为wzy)编码的氨基酸序列具有至少95％的同一性；

(b)：编码具有多糖转运蛋白活性的多肽的核苷酸序列与由seqidno:12的核苷酸序列(本文称为wzx)编码的氨基酸序列具有至少95％的同一性；和

(c)：编码具有糖基转移酶(gt)的多肽的核苷酸序列：

(c1)：与由seqidno:8的核苷酸序列编码的氨基酸序列(本文称为gt1)具有至少95％的同一性；

(c2)：与由seqidno:10的核苷酸序列编码的氨基酸序列(本文称为gt2)具有至少95％的同一性；和

(c3)：与由seqidno:11的核苷酸序列编码的氨基酸序列(本文称为gt3)具有至少95％的同一性。

优选地，第一方面的质构化乳酸菌是lab，其中

(a)：编码具有聚合酶活性的多肽的核苷酸序列与由seqidno:9的核苷酸序列(本文称为wzy)编码的氨基酸序列具有至少80％同一性(优选至少85％同一性，更优选至少90％同一性，更优选至少95％同一性，更优选至少98％同一性，最优选至少100％同一性)。

优选地，第一方面的质构化乳酸菌是lab，其中

(b)：编码具有多糖转运蛋白活性的多肽的核苷酸序列与由seqidno:12的核苷酸序列(本文称为wzx)编码的氨基酸序列具有至少85％同一性(优选至少90％同一性，更优选至少95％同一性，更优选至少98％同一性，最优选至少100％同一性)。

优选地，第一方面的质构化乳酸菌是lab，其中

(c)：编码具有糖基转移酶(gt)的多肽的核苷酸序列：

(c1)：与由seqidno:8的核苷酸序列编码的氨基酸序列(本文称为gt1)具有至少80％的同一性(优选至少85％同一性，更优选至少90％同一性，更优选至少95％同一性，更优选至少98％同一性，最优选至少100％同一性)。

优选地，第一方面的质构化乳酸菌是lab，其中

(c)：编码具有糖基转移酶(gt)的多肽的核苷酸序列：

(c2)：与由seqidno:10的核苷酸序列编码的氨基酸序列(本文称为gt2)具有至少80％的同一性(优选至少85％同一性，更优选至少90％同一性，更优选至少95％同一性，更优选至少98％同一性，最优选至少100％同一性)。

优选地，第一方面的质构化乳酸菌是lab，其中

(c)：编码具有糖基转移酶(gt)的多肽的核苷酸序列：

(c3)：与由seqidno:11的核苷酸序列编码的氨基酸序列(本文称为gt3)具有至少80％的同一性(优选至少85％同一性，更优选至少90％同一性，更优选至少95％同一性，更优选至少98％同一性，最优选至少100％同一性)。

优选地，所述质构化乳酸菌包含多于一种第一方面中指定的核苷酸序列。

因此，优选第一方面的质构化乳酸菌和在本文中描述的其实施方案(即如本文所述的质构化乳酸菌)是lab，其中所述eps基因簇至少包含：

(a)：第一方面的项目(a)的编码具有聚合酶活性的多肽的核苷酸序列和在本文中描述的其实施方案；和

(c)：第一方面的项目(c)的至少一种(优选至少两种，更优选至少三种)编码具有糖基转移酶(gt)活性的多肽的核苷酸序列和在本文中描述的其实施方案。

优选地，本发明的质构化乳酸菌包含选自由以下组成的组的至少一种核苷酸序列：

(a)：编码具有聚合酶活性的多肽的核苷酸序列，并且其中所述多肽与由seqidno:9的核苷酸序列(本文称为wzy)编码的氨基酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选95％的同一性；和

(c)：至少一种编码具有糖基转移酶(gt)活性的多肽的核苷酸序列，所述多肽选自由以下组成的组：

(c1)：所述多肽与由seqidno:8的核苷酸序列编码的氨基酸序列(本文称为gt1)具有至少70％、优选至少80％、更优选95％的同一性；

(c2)：所述多肽与由seqidno:10的核苷酸序列编码的氨基酸序列(本文称为gt2)具有至少70％、优选至少80％、更优选95％的同一性；和

(c3)：所述多肽与由seqidno:11的核苷酸序列编码的氨基酸序列(本文称为gt3)具有至少70％、优选至少80％、更优选95％的同一性。

优选地，本发明的质构化乳酸菌包含选自由以下组成的组的至少一种核苷酸序列：

(a)：编码具有聚合酶活性的多肽的核苷酸序列，并且其中所述多肽与由seqidno:9的核苷酸序列(本文称为wzy)编码的氨基酸序列具有至少70％的同一性；和

(c)：至少一种编码具有糖基转移酶(gt)活性的多肽的核苷酸序列，所述多肽选自由以下组成的组：

(c1)：所述多肽与由seqidno:8的核苷酸序列编码的氨基酸序列(本文称为gt1)具有至少70％的同一性；

(c2)：所述多肽与由seqidno:10的核苷酸序列编码的氨基酸序列(本文称为gt2)具有至少70％的同一性；和

(c3)：所述多肽与由seqidno:11的核苷酸序列编码的氨基酸序列(本文称为gt3)具有至少70％的同一性。

优选地，本发明的质构化乳酸菌包含选自由以下组成的组的至少一种核苷酸序列：

(a)：编码具有聚合酶活性的多肽的核苷酸序列，并且其中所述多肽与由seqidno:9的核苷酸序列(本文称为wzy)编码的氨基酸序列具有至少80％的同一性；和

(c)：至少一种编码具有糖基转移酶(gt)活性的多肽的核苷酸序列，所述多肽选自由以下组成的组：

(c1)：所述多肽与由seqidno:8的核苷酸序列编码的氨基酸序列(本文称为gt1)具有至少80％的同一性；

(c2)：所述多肽与由seqidno:10的核苷酸序列编码的氨基酸序列(本文称为gt2)具有至少80％的同一性；和

(c3)：所述多肽与由seqidno:11的核苷酸序列编码的氨基酸序列(本文称为gt3)具有至少80％的同一性。

优选地，本发明的质构化乳酸菌包含选自由以下组成的组的至少一种核苷酸序列：

(a)：编码具有聚合酶活性的多肽的核苷酸序列，并且其中所述多肽与由seqidno:9的核苷酸序列(本文称为wzy)编码的氨基酸序列具有至少95％的同一性；和

(c)：至少一种编码具有糖基转移酶(gt)活性的多肽的核苷酸序列，所述多肽选自由以下组成的组：

(c1)：所述多肽与由seqidno:8的核苷酸序列编码的氨基酸序列(本文称为gt1)具有至少95％的同一性；

(c2)：所述多肽与由seqidno:10的核苷酸序列编码的氨基酸序列(本文称为gt2)具有至少95％的同一性；和

(c3)：所述多肽与由seqidno:11的核苷酸序列编码的氨基酸序列(本文称为gt3)具有至少95％的同一性。

优选地，第一方面的质构化乳酸菌和在本文中描述的其实施方案是lab，其中eps基因簇包含以下核苷酸序列：

(a)：编码具有聚合酶活性的多肽的核苷酸序列，并且其中所述多肽与由seqidno:9的核苷酸序列(本文称为wzy)编码的氨基酸序列具有至少70％的同一性(优选至少85％同一性，更优选至少90％同一性)；

(b)：编码具有多糖转运蛋白活性的多肽的核苷酸序列，并且其中所述多肽与由seqidno:12的核苷酸序列(本文称为wzx)编码的氨基酸序列具有至少80％的同一性(优选至少90％同一性)；和

(c)：编码具有糖基转移酶(gt)活性的多肽的核苷酸序列，所述多肽选自由以下组成的组：

(c1)：所述多肽与由seqidno:8的核苷酸序列编码的氨基酸序列(本文称为gt1)具有至少70％的同一性(优选至少85％同一性，更优选至少90％同一性)；

(c2)：所述多肽与由seqidno:10的核苷酸序列编码的氨基酸序列(本文称为gt2)具有至少70％的同一性(优选至少85％同一性，更优选至少90％同一性)；和

(c3)：所述多肽与由seqidno:11的核苷酸序列编码的氨基酸序列(本文称为gt3)具有至少70％的同一性(优选至少85％同一性，更优选至少90％同一性)。

关于上面紧邻的实施方案，优选eps基因簇包含：

(c)：上面紧邻的实施方案的项目(c)的编码具有糖基转移酶(gt)活性的多肽的三种核苷酸序列。

如本文所讨论的，seqidno:16列出了对应于seqidno:1的核苷酸4171至11267的chcc11848的eps簇的可变部分的7097-bp核苷酸序列。

在一个优选的实施方案中，如本文所述的质构化乳酸菌菌株是lab，其中所述eps基因簇包含：

(d)：与seqidno:16的核苷酸序列(本文称为chcc11848的eps簇的可变部分)具有至少85％同一性(优选至少90％同一性，更优选至少95％同一性)的核苷酸序列。

在一个优选的实施方案中，如本文所述的质构化乳酸菌菌株是lab，其中所述eps基因簇包含：

(d)：与seqidno:1的核苷酸序列(本文称为chcc11848的eps簇)具有至少85％同一性(优选至少90％同一性，更优选至少95％同一性)的核苷酸序列。

如本文的工作实施例中所讨论的(参见例如图1)，本文公开的新型乳酸乳球菌乳酸亚种chcc11848(保藏为dsm29291)具有优异的质构化性质。

优选地，本文所述的质构化乳酸菌菌株是lab，其中所述质构化乳酸菌菌株是产生发酵乳的菌株，所述发酵乳在剪切速率300s^-1下测量具有大于40pa、更优选41pa、更优选42pa、更优选43pa、更优选44pa、更优选45pa、更优选46pa、更优选47pa、更优选48pa、更优选49pa和最优选50pa的剪切应力，所述剪切应力在以下条件下测量：

将富含2g脱脂乳粉的200ml半脂乳(1.5％脂肪)加热至90℃，持续20min，然后冷却至接种温度，然后使其接种2ml乳酸菌菌株的过夜培养物，并在接种温度放置直至ph4.55，然后在4℃储存5天，接着轻轻搅拌并测量在剪切速率300s^-1下的剪切应力，其中接种温度是30℃。剪切应力使用实施例1中所示的方法测量。

本发明还涉及乳酸乳球菌乳酸亚种菌株，其选自由以下组成的组：2014年8月21日以保藏号dsm29291保藏于布伦瑞克英豪丰街7b(d-38124)的dsmz——德国微生物保藏中心(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh)的菌株和衍生自dsm29291的菌株，其中衍生菌株的特征在于具有与dsm29291至少相同的质构化能力。

在本发明上下文中，术语“衍生的菌株”应理解为借助于例如基因工程、辐射和/或化学处理、和/或选择、适应、筛选等从母株衍生的菌株。在具体的实施方案中，衍生的菌株是功能上等同的突变体，例如与母株具有基本相同的性质或改进的性质(例如就质构而言)的突变体。这类衍生的菌株是本发明的一部分。术语“衍生的菌株”包括通过使本发明的菌株经历任何诱变处理而获得的菌株或自发发生的突变体，所述诱变处理包括用化学诱变剂(如乙烷甲烷磺酸盐(ems)或n-甲基-n'-硝基-n-硝基胍(ntg))、紫外线进行的处理。衍生的菌株可经历几次诱变处理(单次处理应理解为一个诱变步骤，然后是筛选/选择步骤)，但通常进行不超过20次、不超过10次、或不超过5次处理。在衍生菌株的具体实施方案中，与母株相比，细菌基因组中小于1％、或小于0.1％、小于0.01％、小于0.001％或甚至小于0.0001％的核苷酸已被改变(例如通过替换、插入、缺失或其组合)。

包含本发明lab的组合物：

本发明还涉及包含至少一种根据本发明的乳酸菌菌株的组合物。

在一个具体的实施方案中，所述组合物包含至少1x10⁶cfu(细胞形成单位)/ml的至少一种根据本发明的乳酸菌菌株。可优选的是，所述组合物包含至少1x10⁸cfu(细胞形成单位)/ml的至少一种根据本发明的乳酸菌菌株。

生产食品的方法：

本发明进一步涉及生产食品的方法，所述方法包括至少一个阶段，在所述阶段中使用至少一种根据本发明的乳酸菌菌株。

显然可以使用包含至少一种根据本发明的乳酸菌菌株的组合物。

在具体的实施方案中，所述食品是乳制品，并且所述方法包括用至少一种根据本发明的乳酸菌菌株发酵乳底物。

优选地，所述方法包括用包含至少1x10⁶cfu(优选至少1x10⁸cfu)(细胞形成单位)/ml的至少一种根据本发明的乳酸菌菌株的组合物发酵乳底物。

在一些实施方案中，与没有所述菌株的相当的组合物相比，所述食品具有改善的质构。

本发明还涉及包含至少一种根据本发明的乳酸菌菌株的食品。

在一个具体的实施方案中，所述食品是乳制品、肉制品、蔬菜制品、水果制品或谷物制品。在具体的实施方案中，所述食品是乳制品。

本文使用的术语“乳制品”是指由乳制成的食品。在本申请的上下文中，术语“乳”以其常规含义广泛地用于指由动物乳腺或植物产生的液体。根据本发明，乳可被加工，并且术语“乳”包括全脂奶(wholemilk)、脱脂乳、无脂乳、低脂乳、全脂乳(fullfatmilk)、降乳糖乳或炼乳。无脂乳是无脂或脱脂乳制品。低脂乳通常被定义为含有约1％至约2％脂肪的乳。全脂乳通常含有2％或更多的脂肪。术语“乳”旨在包括来自不同哺乳动物和植物来源的乳。乳的哺乳动物来源包括但不限于乳牛、绵羊、山羊、水牛、骆驼、美洲驼(llama)、母马和鹿。乳的植物来源包括但不限于从大豆、豌豆、花生、大麦、大米、燕麦、藜麦、杏仁(almond)、腰果、椰子、榛子、大麻、芝麻籽和葵花籽中提取的乳。在一个具体的实施方案中，所述乳是牛乳。

作为根据本发明的典型乳制品，可以提及发酵乳制品和奶酪。

在一个具体实施方案中，所述乳制品是嗜温乳制品。

乳制品的生产是通过本领域技术人员已知的方法进行的，其具体涉及通过至少一种根据本发明的菌株进行乳的发酵。

chcc11848的eps基因簇的讨论：

发现来自科汉森培养物保藏所的～1000株乳酸乳球菌菌株中只有约1％增强发酵乳的质构，这通过如下手段证明：以1ml规模使用汉密尔顿液体处理装置的基于tadm(总吸液和放液监测)的筛选，接下来以200ml规模进行的确认性流变学测定。大部分的质构化菌株都属于乳脂亚种，并具有与公布的乳酸乳球菌乳脂亚种菌株的eps簇类似的eps簇。然而，其中一种质构化菌株chcc11848属于乳酸亚种，并被发现有独特的eps簇。发现chcc11848的eps簇是独特的，因为发现其含有新的糖基转移酶和可能参与寡糖单元修饰的其它基因，并且作为该簇的产物，eps可能有助于这种菌株在乳中增强的质构化性质。chcc11848的eps簇很可能是染色体相关的，因为chcc11848的含有eps簇的重叠群高于414kbp，这是典型的乳球菌质粒的约10倍大。迄今发现的乳球菌质粒的大小在1.6至80.6kbp之间。此外，发现chcc11848的含有eps簇的重叠群的含量与几种公众可获得的乳酸乳球菌乳酸亚种菌株例如kf147和klds4.0325的染色体相关遗传含量高度相似。据信，chcc11848的eps簇是独特的，在于其是染色体相关的，而非质粒相关的。此外，含有染色体相关eps簇的菌株相对于含有质粒相关eps簇的菌株具有更稳定得多的eps产生性质的优点，因为与染色体基因相反，质粒容易从细菌细胞中丢失。具体而言，含有染色体相关eps簇的菌株提供了更稳定的母株以用作开发突变菌株的基础。

通过wzy依赖性机制进行多糖生物合成的基因座在所有细菌中都是相似的，并且在肺炎链球菌中得到很好的研究。对来自90种肺炎球菌血清型的cps基因座的遗传分析证明了多糖操纵子的显著特征：各种关键酶类别的许多高度不同形式的存在。因此，发现了40个多糖聚合酶同源组、13个脂肪酶组和大量的糖基转移酶。这些酶的多种非同源形式或高度不同形式的存在，以及编码它们的区域中常常不同的g+c含量，支持了这些基因已经从不同的未知来源在多个时机被引入的观点。许多eps基因簇经历了由插入序列(is)元件介导的重排，并通过水平基因转移接收来自其它生物的基因。eps操纵子结构的典型特征是在操纵子侧翼或内部存在is元件。在用于多糖生产的基因座中观察到的过多糖基转移酶提供了通过基因改组持续生成产生独特eps的新菌株的机会。由于eps在单糖结构单元、异头构型、构象和立体化学方面表现出巨大的多样性，因此所产生的eps结构的多样性是不可思议的：例如，两种葡萄糖残基可以以30种不同的方式连接在一起。根据碳水化合物-活性酶(cazy)数据库(cazy.org)，糖基转移酶目前被分类为97个家族(2015年6月)，这可帮助预测其作用模式。尽管如此，这并不意味着家族中的所有酶都识别相同的供体和受体，因为多特异性在糖基转移酶家族中是常见的，因此应该谨慎对待仅基于此分类的预测的过度解释。在大多数情况下，决定糖基转移酶特异性的因素仍然难以捉摸，仅基于序列分析难于预测其作用模式。因此，进一步研究的关键领域是在糖基转移酶和底物二者中寻找决定糖基转移酶底物特异性的因素或基序。然而，一个复杂的方面是一些糖基转移酶显示对不同底物的混杂性。可能依次用以构建寡糖重复单元的chcc11848的三种预测的糖基转移酶基因产物显示出与已知糖基转移酶的低氨基酸相似性。重复单元的结构因此也可以不同于迄今为止已知的乳球菌属的结构。eps生物合成所需的糖基转移酶的糖特异性可能可以根据eps中存在的糖进行预测。然而，chcc11848生产的eps结构尚未得到解析。

在许多环境中都发现了乳酸乳球菌，尽管乳酸乳球菌的原生态位现已被广泛接受为植物基的。用于乳制品工业的乳球菌菌株似乎已经通过还原进化过程广泛适应富营养物的乳制品环境，与从植物材料中分离出的乳球菌菌株相比，其似乎导致较小的基因组尺寸、更多数目的假基因和更广泛的质粒补体的获得。由于大多数非乳制品分离株属于含有乳酸乳球菌乳酸亚种的菌株的谱系，并且代表乳制品菌株中未发现的分子多样性，而乳酸乳球菌乳脂亚种通常在乳制品发酵中发现，因此，与来自乳酸亚种的质构化菌株相比，发现来自乳脂亚种的更多质构化菌株是预期的结果。因此chcc11848是来自乳酸亚种的独特菌株，其能够积极地促进乳质构化性能。

典型的乳球菌eps操纵子由保守部分(包括基因epsr、epsx、epsa、epsb、epsc和epsd)、可变部分(包括聚合酶、转运蛋白和一种或多种葡糖基转移酶或其它聚合物修饰基因)以及另一个保守部分(包括基因epsl和orfy)组成(dabour和lapointe2005；forde和fitzgerald2003；nieropgroot和kleerebezem2007；vankranenburg1997；vankranenburg1999)。eps基因的预测功能将eps操纵子划分成多个区域，所述区域涵盖eps合成的调节(epsr)、调整(包括链长度确定(epsabc))、寡糖重复单元的生物合成(包括第一糖与脂质载体的连接(epsd)和由所述簇的可变部分的基因执行的、向脂质连接的糖随后添加糖或修饰所述重复单元的其它部分)以及聚合(wzy)和输出(wzx)。尚没有推定的功能可以分配给epsx和epsl。可以使用内部基因片段通过单交换中断nizob40epsl或可以过度产生nizob40epsl而对eps生产没有任何影响(vankranenburg1999)。然而，如果来自eps簇的一个拷贝不起作用，有可能是我们在几个乳球菌菌株中的糖基化磷壁酸的推定簇中发现的epsl的第二个拷贝(关于细节参见实施例4)主导。

epsr负责eps生物合成调节，因此某些突变会影响eps生产。据信，epsabc和atp形成稳定的复合物，其充当酪氨酸激酶-磷酸酶系统，该系统可能通过epsd(在eps重复单元组装中催化第一步骤的糖基磷酸转移酶)的磷酸化作用控制eps合成，并定义了添加到脂质载体中用于形成eps的糖的类型。负责酪氨酸磷酸化的所有三个基因对于肺炎球菌的完全包囊化是必不可少的，其中cpsc是主要的毒力因子，其通过其在调节cps生物合成中的作用而是关键的(whittall等2015)。在乳酸乳球菌中，cpsc样基因的产物epsa被分类为链长度决定簇蛋白，而epsb是推定的酪氨酸蛋白激酶，而epsc是推定的酪氨酸蛋白磷酸酶。在乳酸乳球菌中，发现epsa和epsb对eps生产是必不可少的，而epsc并不是严格要求的，因为其缺失的影响是产生的eps的量减少(nieropgroot和kleerebezem2007)。编码起始的单糖(glycose)磷酸转移酶(其不催化糖苷键，但参与将重复单元的第一糖与脂质载体连接)的基因epsd经证明对于乳酸乳球菌中的多糖生物合成是必不可少的，因为其中断消除了eps生产(dabour和lapointe2005；vankranenburg等1997)。

随后，通常编码糖基转移酶、聚合酶和转运蛋白的eps簇的以下基因位于所述簇的可变部分中，并且常常与已表征的基因具有低相似度，这使得难以推测其推定的功能。来自多糖生物合成得到很好地研究的90种肺炎球菌血清型的多糖合成操纵子的比较揭示，负责重复单元的合成和聚合的重要基因高度可变并且通常在血清型之间是非同源的(bentley等2006)。肺炎链球菌中的wzy依赖性cps生物合成类似于肽聚糖合成，由此重复单元被建立在细胞质膜的内表面上，通过wzx转运蛋白(也称为翻转酶)被转运至膜的外表面，并通过wzy聚合酶而被聚合。多糖聚合酶wzy连接各个重复单元以形成脂质连接的cps。在肺炎链球菌中，发现了40个多糖聚合酶同源组。重复寡糖单元的初始糖也是重复单元聚合中的供体糖，并且wzy聚合酶的特异性决定了连接类型。对初始糖以及随后的重复单元聚合连接(polymerizationlinkage)的预测与聚合酶同源组良好相关。在肺炎链球菌中，有32个与wcha相关的聚合酶同源组，5个与wcii相关的聚合酶同源组，4个与wcjg相关的聚合酶同源组，和1个与wcjh相关的聚合酶同源组。这些相关性大多是排他性的，只有5个聚合酶同源组与两种初始转移酶相关，这表明初始转移酶的高度特异性(bentley等2006)。

旨在增加糖核苷酸(即eps前体)库以增加朝向最终聚合物的碳通量的用于增加eps生产的工程化改造策略、涉及eps组装的基因(例如wzx、wzy、糖基转移酶)的过表达、调节蛋白的靶向工程化改造、竞争前体的通路的破坏或单基因敲除，对于一些eps生产者是成功的，但在其它情况下失败了(关于概述，参见schmid等2015)。整个eps基因簇在乳酸乳球菌nizob40菌株中的过表达导致生长速率显著降低，这表明eps生产的增加产生了明显的代谢负担，这是由于所需的高水平糖核苷酸生产所致，糖核苷酸被用于eps生产和生长二者(boels等2003)。对于许多已建立的工业eps生产者，制造工艺参数的优化可能比工程化改造eps生物合成更有前途(schmid等2015)。

seqidno:1的核苷酸序列包括chcc11848的eps基因簇。

上述要素、方面和实施方案以其所有可能的变型的任何组合都包含在本发明中，除非本文另有指示或者与上下文明显矛盾。

下面仅以举例的方式描述本发明的实施方案。

实施例

实施例1.质构化菌株的高通量筛选和乳凝胶质构的测量

当用通常属于嗜热链球菌、乳杆菌属物种和乳酸乳球菌物种(lactococcuslactisspp.)的乳酸菌发酵时，乳(液体)通常被转化为乳凝胶(软固体)。流变仪或质构分析仪通常用于评估发酵乳凝胶的流变学性质例如剪切应力。当感觉小组(sensorypanel)评估乳凝胶的质构时，使剪切应力测量与感知的口腔厚重感相关。高口腔厚重感被认为是酸奶等发酵乳凝胶的重要品质因素，且消费者的接受度通常与口腔厚重感(随着剪切应力而变化)等质构性质密切相关。

在下面的实验中使用了液体处理站hamiltonroboticsmicrolabstar，其在各个移液管的排气筒内配备有压力传感器。液体处理器具有位于每个移液通道的顶部空间中的压力传感器。来自每个传感器的压力数据通过hamiltonroboticsmicrolabstar液体处理器(hamiltonrobotics)的tadm(总吸液和放液监测)软件收集。

图1显示了针对在剪切速率300s^-1下的剪切应力(pa)数据绘制的吸液压力值(pa)，所述吸液压力值(pa)通过使用汉密尔顿液体处理装置移液在1s测量，所述剪切应力(pa)使用针对选择的乳凝胶样品的流变仪来测量，所述乳凝胶样品通过使用八种不同的乳酸乳球菌乳酸亚种菌株发酵乳而获得。“乳”是指没有接种任何菌株的b-乳，其被用作对照。在本发明的上下文中，9.5％b-乳是通过以下方式制备的煮沸的乳：将低脂脱脂奶粉重构至干物质水平为9.5％，并在99℃巴氏灭菌30分钟，随后冷却至40℃。

压力对时间数据(tadm)是从96孔微量滴定板中制备的1ml样品获得的，其中b-乳在30℃在不同菌株(1％接种物)存在下接种20h(除非另有说明)，然后在4℃储存1天。使用汉密尔顿液体处理装置测量吸液期间的压力，并且将对应于1s的时间点的每个样品的压力值绘制在图4的y轴上。500μl体积被抽吸(350μl/s)。

通过在富含2％脱脂乳粉的半脂乳(1.5％脂肪)中接种相同的微生物培养物而获得剪切应力数据；将乳在90℃加热20分钟，然后冷却至接种温度，然后接种1％过夜微生物培养物。接种在30℃以200-ml规模进行12-15小时，直至ph～4.55，然后冷却至4℃并在4℃储存5天。储存后，通过装有钻孔盘的棒轻轻搅拌发酵乳，直至样品均匀。使用下列设置在流变仪(具有asc(自动样品更换器)的antonpaarphysicarheometer,antongmbh,奥地利)上评估样品的剪切应力：

-等待时间(在某种程度上重建至最初的结构)

-5分钟，在没有振荡或旋转的情况下

-旋转(以测量在300s^-1的剪切应力等)

-y’＝[0.2707-300]s^-1和y’＝[275-0.2707]s^-1

在210s内21个测量点(每10s一个)，上升至300s-¹

和在210s内21个测量点(每10s一个)，下降至0.2707s-¹

对于数据分析，选择在剪切速率300s-¹下的剪切应力。

根据tadm和流变仪测量结果(图1)，菌株chcc11848在测试的八种不同的乳酸乳球菌乳酸亚种菌株中具有最高的剪切应力。在tadm和流变仪测量结果之间观察到显著相关性(r²为0.97)。

实施例2.乳球菌菌株的基因组测序

使用dneasyblood&tissuekit(qiagen)，从在30℃在含有1％乳糖和1％葡萄糖的m17培养基中生长过夜的培养物中纯化总dna。使用凝胶电泳检查dna质量，使用nanodrop2000分光光度计估计dna浓度，并且将15μgdna(约150ng/μl)用于在bgi(中国香港)使用illuminahiseq设备进行测序，所述illuminahiseq设备具有双端通道模块(pair-endchannelmodule)(具有2x100bp读取长度和500bp插入尺寸)。以默认参数使用clcgenomicsworkbench7.0软件将原始读长(reads)组装成重叠群，得到48个重叠群(平均长度57325bp，平均覆盖度317)，其用于eps基因挖掘。

实施例3.乳球菌菌株的eps基因簇的表征

由于增强的质构与eps的产生相关，因此对图1所示的来自chcc培养物保藏所的质构化和非质构化乳球菌菌株进行基因组测序。进行了eps基因簇的挖掘，并将发现的eps簇与公众可获得的乳球菌基因组序列的eps簇进行比较。我们关注于乳酸亚种，因为没有来自该亚种的、可获得基因组序列菌株被报道为质构化的，这表明chcc11848是来自乳酸亚种的具有增强的质构化性质的独特菌株。

为了在所研究的乳球菌菌株中找到eps基因簇，使用标准参数应用软件“clcmainworkbench7”的“blast”工具。将13种乳酸乳球菌乳酸亚种菌株(在2015年4月27日，其完整基因组或重叠群可在ncbi数据库获得)用于eps基因簇挖掘：klds4.0325(genbankcp006766)、il1403(genbankae005176)、cncmi-1631(genbankaghx00000000)、cv56(genbankcp002365)、dephy1(genbankcbuj000000000)、kf147(genbankcp001834)、yf11(genbankapav00000000)、io-1(genbankap012281)、a12(genbankcblu000000000)、1aa59(genbankazqt00000000)、jcm5805＝nbrc100933(genbankbbsi00000000)、k214质粒pk214(genbanknc_009751)、ncdo2118(genbankcp009054)和ncdo2118质粒pncdo2118(genbankcp009055)。在cv56、il1403、io-1、jcm5805、a12、dephy1、k214质粒pk214、ncdo2118基因组和质粒pncdo2118中未发现eps簇。在剩下的五种菌株中发现的eps簇以及来自五种不同乳酸乳球菌乳脂亚种菌株例如nizob40(genbankaf036485)、smq-461(genbankay741550.2)、ropy352(genbankef192213)、ho2(genbankaf142639)和a76(genbankcp003132)的eps簇用作eps簇参照，用于blast分析来自chcc培养物保藏所的乳球菌菌株(图3b)。首先使用组装的基因组(包含重叠群)对来自chcc培养物保藏所的乳球菌菌株中的eps基因簇进行挖掘，并且在组装的基因组中没有发现eps基因的情况下，使用标准参数应用clcmainworkbench7软件的“mapreadstoreference”工具。执行后者是为了确保在原始基因组数据中不存在表示未组装成重叠群的eps基因的原始读长。

blast分析结果和来自不同乳球菌菌株的eps基因簇彼此比对的结果用于对来自chcc培养物保藏所的菌株的orf进行注释，所述比对使用clcmainworkbench7软件的“alignmentsandtrees”工具集中的“createalignment”工具进行。使用clcmainworkbench7软件的“alignmentsandtrees”工具集中的“createtree”工具(构建方法：upgma；核苷酸取代模型：jukescantor；使用200个重复进行自举)，基于乳酸乳球菌乳酸亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种比对文件，创建系统发育树(图3a)。通过clustalw2(可通过clc软件获得)，使用同一性百分比矩阵来计算序列的同一性(图3c)。interpro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)和pfam(http://pfam.xfam.org/)工具用于通过将它们分类为家族来对蛋白进行功能表征，从而预测疏水性概况、结构域和重要位点。

在所研究的乳球菌菌株中观察到大的eps簇多样性(图2)。基于它们经由clustalw2的核苷酸序列分析，发现只有两种来自乳酸亚种的菌株kf147和yf11有非常相似(从epsx到epsl，99％同一性)的eps簇(图3a、3c)，但包含显著数量的单核苷酸多态性(snp)，例如，在epsx中有13个snp(10个导致氨基酸变化)，epsa中有13个snp(4个导致氨基酸变化)，epsb中有4个(1个导致氨基酸变化)，epsc中有6个(3个导致氨基酸变化)，epsd中有29个snp(14个导致氨基酸变化)。尽管chcc11848的eps簇似乎在某种程度上与公众可得到的乳球菌菌株的eps簇和来自chcc培养物保藏所的eps簇相似(图2)，但是从epsr到epsd以及从epsl到orfy，在簇的保守区域中的相似度最高。当将chcc11848的eps簇与klds4.0325的eps簇进行比较时，从epsx到epsd的eps簇的保守区域的同一性是97％，从epsl到orfy是98％，而在epsd和epsl之间的可变区的同一性在核苷酸水平上是71％。

实施例4.chcc11848的eps基因簇的表征

chcc11848的eps操纵子包括14个开放阅读框(orf)，它们覆盖13kb，并且除了该簇的最后一个基因orfy外都以相同的转录意义定向(图4、图5)。至于包括nizob40、ho2和smq-461在内的许多乳球菌菌株，orfy存在于eps基因簇的3'末端并且以相反的转录意义定向(图4)。该基因之后是推定的镉抗性蛋白cada。根据氨基酸相似性，可以将推定的功能分配给经鉴定的14个orf中的12个(图5)。eps基因的预测功能将eps操纵子划分为多个区域，所述区域涵盖eps合成的调节(epsr)、调整(包括链长度确定(epsabc))、寡糖重复单元的生物合成(包括第一糖与脂质载体的连接(epsd)和糖或修饰重复单元的其它部分的随后添加(gt1、gt2、gt3、ugd))以及聚合(wzy)和输出(wzx)的区域。尚没有推定的功能可以分配给epsx和epsl。

来自乳酸乳球菌的eps基因簇的结构与编码嗜热链球菌中的eps生物合成和肺炎链球菌中的cps生物合成的基因簇的结构相似(图4)。我们根据通常用于乳球菌eps基因的命名法(dabour和lapointe2005；forde和fitzgerald2003；nieropgroot和kleerebezem2007；vankranenburg1997；vankranenburg1999)命名了chcc11848的保守基因。然而，具有相同名称的eps基因在不同生物体中通常具有不同的功能，因为基因通常根据在给定基因座中的出现顺序(而不是基于其功能)而按字母顺序命名。因此，epsb在乳酸乳球菌中编码酪氨酸蛋白激酶，而相应的基因在嗜热链球菌中命名为epsd，在肺炎链球菌中命名为cpsd(或wxe)(图4)。在nizo菌株b40中，eps聚合酶命名为epsi，并且输出基因命名为epsk，而在smq-461中，具有相应功能的基因命名为epsh和epsm。肺炎链球菌荚膜的原始命名使用cps，后面是血清型号和基因名称，其中基因根据在给定基因座中的出现顺序按字母顺序命名，而备选命名则基于功能(例如wzg)，但缺乏容易区分血清型的能力。嗜热链球菌eps基因的命名与肺炎球菌基因的命名密切相关；然而该基因通常被命名为eps而不是cps。为了注释chcc11848的基因，除blast分析外，我们还使用interpro和pfam工具进行了蛋白功能表征(图5)。

发现chcc11848含有高度保守的epsr，其被指定用于eps生物合成调节，因为它含有dna结合结构域并且与乳球菌的来自xre家族的推定的转录调节子一致(图5)。在例如嗜热链球菌lmd-9和肺炎链球菌d39中eps合成的相应转录调节子(分别为epsa和cpsa)属于转录调节子的lytr家族，与来自chcc11848的orfy相似。尽管epsa和cpsa含有三个推定的跨膜区段(在n端)和大疏水性区段，orfy具有相似的疏水性谱，但只有一个跨膜区段。转录调节子的lytr组代表了迄今尚未得到研究的与epsr不同的调节机制。

epsx和epsl二者与来自乳球菌菌株的相关序列共有非常显著的相似度(分别为98％和99％同一性)(图5)。但是，迄今为止还没有可用的实验来评估它们的功能。可以使用内部基因片段通过单交换中断nizob40epsl或可以过度产生nizob40epsl而对eps生产没有任何影响(vankranenburg1999)。chcc11848的epsl的疏水性图显示出大的疏水性、胞质和跨膜区段。预测epsl是一种功能未知的含有duf2233结构域的周质蛋白(图5)。奇怪的是，我们发现epsl样基因在存在时是乳球菌eps簇的一部分，但也在磷壁酸簇中。例如，发现乳酸乳球菌菌株kf147在其基因组中含有两个epsl样基因，一个在推定的磷壁酸簇中(蛋白idabx75721，genbank序列cp001834的基因座标签llkf_0940)而另一个在eps基因簇中(蛋白idabx75689，基因座标签llkf_0142)。发现似乎不具有eps簇的菌株cv56和il1403在其推定的磷壁酸簇中各自含有一个epsl样基因。epsx的疏水性谱表明它具有大的胞质、非胞质和跨膜区段；后者可以起到膜锚着点的作用。epsx的胞质区域包括与假定的脂肪酶和相关酶的gdsl样脂肪酶/酰基水解酶家族以及与属于脂肪酶和酯酶的不同家族的sgnh水解酶超家族酶具有相似性的结构域。epsx和epsl在eps生物合成中的作用仍有待确定。

菌株cv56和il1403均具有推定的(脂)磷壁酸簇。cv56在其推定的脂磷壁酸簇中含有编码o-抗原输出系统atp结合蛋白的基因；它代表脂多糖输出体(exporter)(genbank序列cp002365的基因座标签cvcas_0185，蛋白idadz62853，蛋白名称rfb1又名rfbb，在转运蛋白分类数据库tcdb.org中的登录nrq48476)，其是脂多糖o-抗原侧链转运穿过细胞质膜所需的。基于clustalw2分析，在il1403的推定的脂磷壁酸簇内发现的abc转运蛋白(蛋白idaak04301，ncbi序列nc_002662的基因座标签l4342)与cv56的转运蛋白有79％同一性，并且被分类为o-抗原生物合成和多细胞发育所需的abc转运蛋白，rfbab(tcdb.org中的登录nrq50863)。基于clustalw2分析，在cv56(蛋白idadz63531，genbank序列cp002365的基因座标签cvcas_0878)和il1403(蛋白idaak05013，ncbi序列nc_002662的基因座标签l137446)的推定磷壁酸簇内发现的磷壁酸abc转运蛋白atp结合蛋白有99.8％同一性，并被分类为磷壁酸输出体taggh(在tcdb.org的登录nrp42954)。

据信，epsabc和atp形成稳定的复合物，其充当酪氨酸激酶-磷酸酶系统，该系统可能通过epsd(在eps重复单元组装中催化第一步骤的糖基磷酸转移酶)的磷酸化作用控制eps合成，并定义了添加到脂质载体中用于形成eps的糖的类型。负责酪氨酸磷酸化的所有三个基因对于肺炎球菌的完全包囊化是必不可少的，其中cpsc是主要的毒力因子，其通过其在调节cps生物合成中的作用而是关键的。在chcc11848中，cpsc样基因的产物epsa已被分类为链长度决定簇蛋白，而发现epsb是推定的酪氨酸蛋白激酶，而epsc是推定的酪氨酸蛋白磷酸酶。这三种蛋白与其它生物体中的相应蛋白具有高度相似度(图5)，但是在chcc11848的eps簇中与在嗜热链球菌lmd-9和肺炎链球菌d39中具有不同的顺序(图4)。基因epsd可能编码起始的单糖磷酸转移酶，所述转移酶不催化糖苷键，但参与将重复单元的第一糖与脂质载体连接。经证明起始的单糖磷酸转移酶对于多糖生物合成必不可少的，因为其中断消除了eps生产。虽然大多数肺炎球菌血清型含有wcha，并且在wcha不存在时，第五cps基因的产物落入同源组wcii、wcjg或wcjh，发现包含大的胞质区段和一个跨膜区段的chcc11848的epsd属于wcjg组(图5)。

随后，编码糖基转移酶的chcc11848的eps簇的以下基因可以转移各种核苷酸糖(包括udp-葡萄糖、udp-半乳糖、dtdp-鼠李糖、udp-glcnac和udp-呋喃半乳糖)，从而以糖苷键依赖性方式形成重复单元。chcc11848的所有三种预测的糖基转移酶基因产物均显示出与已知的糖基转移酶相对低的氨基酸相似度(图5)。三种糖基转移酶gt1、gt2、gt3以及编码udp-葡萄糖6-脱氢酶的ugd一起潜在地涉及重复单元的顺序构建，尽管尚未证明它们的具体功能(因此也未证明它们的作用顺序)。由ugd编码的蛋白之前在乳酸乳球菌pci658编码的eps操纵子中被发现。它将udp-葡萄糖转化为udp-葡萄糖醛酸，其可能是chcc11848的eps结构的组分之一。然而，chcc11848的eps重复单元的化学结构和糖组成仍有待确定。来自90种肺炎球菌血清型的多糖合成操纵子的比较揭示，负责重复单元的合成和聚合的重要基因高度可变且通常在血清型之间是非同源的(bentley等2006)。肺炎链球菌中的wzy依赖性cps生物合成类似于肽聚糖合成，由此重复单元被建立在细胞质膜的内表面上，通过wzx翻转酶被转运至膜的外表面，并通过wzy聚合酶而被聚合。多糖聚合酶wzy连接各个重复单元以形成脂质连接的cps。在嗜热链球菌lmd-9中，编码多糖聚合酶的epsk具有9个跨膜区段，而在肺炎链球菌d39中的相应聚合酶epsh或wzy具有11个跨膜区段，两者都代表o-抗原连接酶样膜蛋白。基于通过clustalw2进行的序列同一性分析，chcc11848的推定聚合酶wzy与来自lmd-9和d39的聚合酶分别仅有12％和14％的同一性。来自chcc11848的wzy的疏水性图显示10个跨膜区段，并似乎与包括来自枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)的epsg和来自鲍曼不动杆菌(acinetobacterbaumannii)的wzy的蛋白家族相关(图5)。尽管通过blast分析和interpro以及pfam工具被分类为属于相同的蛋白类型，但发现来自lmd-9和d39的聚合酶在氨基酸水平上彼此仅有14％同一性。在肺炎链球菌中，发现了40个多糖聚合酶的同源组。重复寡糖单元的初始糖也是重复单元聚合中的供体糖，并且wzy聚合酶的特异性决定了连接类型。对初始糖以及随后的重复单元聚合连接的预测与聚合酶同源组良好相关。在肺炎链球菌中，有32个与wcha相关的聚合酶同源组，5个与wcii相关的聚合酶同源组，4个与wcjg相关的聚合酶同源组，和1个与wcjh相关的聚合酶同源组。这些相关性大多是排他性的，只有5个聚合酶同源组与两种初始转移酶相关，这表明初始转移酶的高度特异性(bentley等2006)。chcc11848的wzx基因产物与其它预测的乳球菌翻转酶共有中等相似度，并具有12个预测的跨膜区。

保藏物和专门的方案

申请人要求如下所述的为本申请保藏的微生物样品只能提供给专家，直到本专利的授权日。

乳酸乳球菌乳酸亚种chcc11848以保藏号dsm29291于2014年8月21日保藏在dsmz(德国微生物保藏中心)，布伦瑞克英豪丰街7b(d-38124)。

保藏是根据《国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约》而进行的。

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序列表

<110>科·汉森有限公司

<120>质构化乳酸菌的新型eps基因簇

<130>p5499ep02

<160>30

<170>bissap1.3

<210>1

<211>13097

<212>dna

<213>乳酸乳球菌乳酸亚种

<220>

<223>全eps操纵子序列

<400>1

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