磁性提取液体样品中组分的方法和系统与流程

本发明涉及用磁性颗粒提取溶液所含组分的领域。

本发明能具体用于生物学样品制备领域，尤其是实施体外诊断，这是通过捕获溶液中存在的生物学来源的分析物(核酸、微生物、蛋白质、肽等)进行的。

现有技术

文献us5234809最早开发并描述生物学样品中存在的核酸提取，技术包括：向液体样品引入能结合感兴趣的组分的磁性颗粒，然后通过一个或多个磁体来分离磁性颗粒与样品。因而是捕获的颗粒随后能经历后续处理以，例如，将其组分释放到回收溶液中。由于此技术的效率，已开发并销售了许多装置，特别是用于dna和rna等，这些是手动装置(例如来自申请人的)和自动装置(来自申请人的)。然而，这些自动装置有多种限制。

第一个限制涉及其多价性和其庞大性。实际上，这些装置通常是笨重庞大的自动装置，其设计用于实施用户无法修饰的一系列处理。因此，自动装置设计用于单一类型的提取，例如设计用于纯化核酸，但不能实施磁性免疫浓缩。

第二个限制涉及提取期间所用多种液体的注射和吸入回路。由于液体数量高，这意味着回路也众多和/或复杂。此外，由于可能的污染，这些注射/吸入回路必须定期清洁，这意味着使装置停止运行。

第三个限制涉及搅拌操作，其实施是为了在捕获前获得含磁性颗粒的样品的均一性，以使所述颗粒最大化捕获感兴趣的分析物或有效洗涤磁性颗粒。此类搅拌通常需要复杂机制，例如基于导致磁性颗粒移动的移动磁体。

第四个限制涉及提取期间所用的各种液体。通常，为提取而实施的步骤在单一容器中进行或从单一容器开始。结果，此容器就涉及的所有液体固定相同体积(如样品、各种洗涤液、洗脱液等)，这限制提取过程的总体效率。实际上，一些处理(如洗涤)需要大体积以完全有效，而其它处理仅需要少量液体(如洗脱)。

技术实现要素：

本发明目的是提供通过在提取期间所用的磁性颗粒提取液体样品中组分的方法，所述磁性颗粒在液体体积选择中提供很大的自由，具体是多至10ml。

为此，本发明的一个主题是提取液体形式的生物学样品中所含有的组分的方法，所述组分能结合磁性颗粒，所述方法包括：

-混合样品与磁性颗粒的阶段；

-从孔中将混合物吸入管状的移液锥体的阶段，所述移液锥体含有意在用于移液的尖端；

-在移液锥体内壁上捕获磁性颗粒的阶段，所述捕获通过以下进行：

o对移液锥体施加第一磁场，所述场能吸引和保持磁性颗粒于移液锥体的预定区，称为“捕获”区，在所述锥体尖端上方；

o和在孔中应用至少一个循环的吸入及放出移液锥体中所含有的混合物；

-至少一个洗涤移液锥体内壁上所捕获的颗粒的阶段，这是通过以下进行的：

o放出移液锥体中所含有的混合物；和

o应用至少一个循环的从含有洗涤液的孔将洗涤液吸入移液锥体内及放出；

-通过实施移液锥体相对于第一磁场的相对移动将移液锥体内壁上的磁性颗粒从捕获区迁移到移液锥体的尖端的阶段；

-和将迁移到移液锥体尖端的所述磁性颗粒转移到含有溶液的回收孔内的阶段。

换言之，本发明利用移液锥体，当将所述移液锥体伸入孔内时，可以在所述移液椎体中实施吸入及放出循环。通过这类循环，能捕获样品中存在的所有颗粒，样品的体积远大于实施提取的体积，即锥体。通过调节吸入和放出循环数目，甚至能使远大于样品本身体积的累积体积的液体的通过锥体。同样，如果适当，提取期间所用洗涤液的体积可远大于锥体体积。就其本身而言，迁移阶段能使磁性颗粒定位于锥体的部分，即能伸入体积非常小的孔的尖端。因此，若需要，回收溶液的体积可以小。回收溶液的体积因而独立于样品体积和实施提取的移液锥体的体积。通过本发明，有可能优化所用各液体体积，并因而优化提取。

此外，由于管形锥体的几何结构和吸入/放出循环，获得锥体中样品的有效搅拌以及有效洗涤，所述搅拌例如在捕获前实施，而不依赖于移动磁体类型机制。另外，发明人注意到，在锥体中获得有效洗涤，即使颗粒捕获在移液锥体的壁上。能使用大体积洗涤液，进一步增加洗涤效率。因此，所有提取步骤(搅拌、捕获、洗涤、移入回收溶液)能在移液锥体中实施。

根据一个实施方案，第一磁场的移动包括使移液锥体相对所述锥体纵轴平行移动，并保持第一磁场恒定，在移液锥体移动期间移液锥体纵轴与第一磁场的距离维持相等。

换言之，所述颗粒的迁移能通过使移液锥体相对于例如永久磁体移动来简单实施。

根据一个实施方案，所述转移阶段包括：

-将移液锥体的尖端置于回收孔中；

-和从回收孔底部施加第二磁场以引起移液锥体的尖端中所含有的磁性颗粒迁移到回收孔内。

具体地，第二磁场通过部分或整体位于移液锥体尖端下的磁体生成。施加于移液锥体的第一磁场在施加第二磁场期间失效。

换言之，第二磁场能简单地吸引颗粒到回收孔内，这增加回收孔中磁性颗粒的回收速度，以及回收的颗粒的数目。此外，第二磁场自动捕获回收孔中的磁性颗粒。例如，若回收溶液是洗脱液，结合颗粒的组分被释放且技术人员能直接吸入没有磁性颗粒的溶液。

根据一个优选变型，所述转移阶段包括第一磁场失效，然后是在移液锥体尖端中应用吸入和放出回收孔的溶液的循环，所述应用包括：

-以第一频率应用循环的第一阶段；

-然后是以第二频率应用循环的第二阶段，第二频率低于第一频率。

第一阶段能使移液锥体上捕获的颗粒团(也称为“沉淀(pellet)”)解聚，并因而在回收溶液中重悬颗粒。第二阶段能继续搅拌溶液，同时不对抗磁场作用下的颗粒迁移。这能更进一步增加回收速度和回收孔中回收的颗粒数目。此外，如果溶液是洗脱液，其功能是释放由磁性颗粒捕获的组分，这些循环具有搅拌洗脱液中颗粒的作用，这增加洗脱液效率，尤其是当洗脱溶液在没有加热步骤情况下用于分离分析物与磁性颗粒的时候。

根据一个实施方案，所述方法包括在捕获阶段前，搅拌移液锥体中所含有的混合物的阶段，这是通过应用至少一个循环的吸入和放出移液锥体中的所述混合物进行的。由于锥体为管型的几何结构，能相对于锥体的横截面获得高体积通过量，和因而获得的有效搅拌。此外，锥体中存在通过液体流动自然产生的高湍流，所述湍流增加搅拌效率。有利地，在锥体中提供一次性配件以增加此效果。

根据一个实施方案，在转移阶段前，所述方法包括至少一个洗涤移液锥体内壁上所捕获的颗粒的阶段，通过以下进行：

-使磁场失效；

-释放所捕获颗粒，这是通过中应用至少一个循环的从含有洗涤液的孔将洗涤液吸入移液锥体内并放出进行的；

-应用在移液锥体内壁上捕获的第二阶段，通过以下进行：

o向移液锥体内施加第一磁场，

o和在含洗涤液的孔中应用至少一个循环的吸入及放出移液锥体所含有的混合物。

根据一个实施方案，所捕获的颗粒的释放包括应用循环的阶段，采用的方式是使所述溶液的弯液面在移液锥体中所捕获颗粒沉淀上上下移动，所述弯液面的所述上下移动在小于移液锥体总长的锥体部分上实施。

更具体地，所捕获的颗粒的释放包括应用完全吸入和放出锥体洗涤液的循环的第二阶段。第二阶段的循环的应用频率低于第一阶段的循环的应用频率。

具体地，在捕获颗粒释放前，所述方法包括在2种不同洗涤液中实施的至少2个洗涤阶段。

当生物学样品所含组分是核酸(如dna、rna)时，此实施方案尤其有利。

根据另一个实施方案，所述生物学样品所含组分是微生物(如细菌、真菌、酵母)，且所述方法包括单一捕获阶段和单一洗涤阶段。

具体地，样品与磁性颗粒的混合物具有大于1毫升的体积，优选大于或等于2毫升，回收孔的体积小于或等于200微升，优选小于或等于100微升。

根据一个实施方案，在转移阶段前，所述方法包括至少一个洗涤移液锥体内壁上所捕获的颗粒的阶段，所述洗涤通过以下进行：

o将洗涤液吸入所述移液锥体中；

o然后调节施加于磁性颗粒的第一磁场，以在洗涤移液锥体内壁上捕获所述颗粒；

o随后放出移液锥体洗涤液体。

换言之，调节磁场诱导锥体壁上所捕获的沉淀重组。具体地，沉淀能改变形状或能在移液锥体壁上扩散、滑动或“滚动”。此沉淀重组能进一步增加洗涤效率，由于此重组能与洗涤液吸入和放出的循环一起实施，就更能增加洗涤效率。

具体地，所述第一磁场的调节如下实施：

-使移液锥体相对所述锥体纵轴平行移动，并保持第一磁场恒定；

-和/或通过在捕获颗粒前面彼此分隔开的磁体。

换言之，例如由技术员滑动磁体条或由自动装置应用磁条平移的简单机制简单地获得调节。

根据一个实施方案，所述移液锥体体积是回收孔体积的至少10倍。根据一个实施方案，所述混合物体积是移液锥体体积的至少3倍。

根据一个实施方案，所述组分属于由单链或双链核酸(dna和/或rna)、微生物、蛋白质和肽形成的组。所述组分由任何其它分子类型组成，这取决于给予磁性颗粒的功能化。

本发明也旨在提供装置以实施刚刚描述的方法，该装置不是很庞大且易于实验室技术员使用。

为此，本发明的主题还是移液器支架，包含：

-基底；

-基底中制备的凹处，其能可移动地安置孔支撑物；

-移液器支撑物，包含第一容置部(logement)，其中能，有利地可移动地，插入移液器，所述移液器装有至少一个包含有用于移液的尖端的管状的移液锥体，第一容置部开口到基底凹处上，移液器支撑物可以平行于移液锥体轴的方向相对于基底平移，并在第一位置与至少一个第二位置之间移动，在第一位置，各移液锥体的尖端插入孔支撑物的孔，在第二位置，所述尖端在所述孔外；

-第二容置部，能可移动安置磁化部分，当移液器支撑物处于第一位置时，第二容置部面向各移液锥体的位置在其尖端上方，当移液器支撑物处于第二位置时，第二容置部面向移液锥体的尖端。

换言之，移液器支架接收移液器，技术人员通过升起/放低移液器来实施提取方法的步骤，尤其是引起移液锥体尖端中的沉淀迁移，这是通过将孔(采用平板、条带等的形式)引入基底和通过驱动移液器进行的。

移液器支架不是很庞大且可移动，当使用电动式移液器时，也允许提取方法的半自动化。这类移液器事实上包括在装备其的各移液锥体中用于吸入和放出的回路，以及基于微处理器的电子线路。此电子线路根据技术人员输入的设定点来控制吸入和放出回路，这是通过装有移液器的界面和/或连接移液器(如通过蓝牙类型的无线连接)的计算机/平板电脑/智能手机等方式。这些设定点由例如吸入/放出循环说明书和/或移液器预录的特定操作选择组成。

由于电动式移液器可编程，在提取方法定义中也获得大量多价性，其能调整为所需特定磁性捕获的功能(例如：核酸纯化、磁性免疫浓缩等)。具体地，适合预期提取的操作能记录于移液器，该操作依据以下进行定义：吸入和放出循环数目、循环顺序、循环频率、循环之间的时间、所定义的体积等。因而获得自动和半自动系统。

最后，移液锥体可与移液器分开，因此易更换，而不需要移液器长时间停用。

根据一个实施方案，第一容置部包括用于使移液器正面插入移液器支撑物第一容置部和从所述第一容置部正面移出移液器的开口。正面插入和移出处于合适位置的移液器和锥体会尽可能减少移液器支架触碰锥体尖端的风险，并因而尽可能减少移液器支架污染的风险。

根据一个实施方案，在基底中制备第二容置部。

具体地，移液器支撑物包括第三容置部，磁化部分能可移动地插入其中这是为了当移液器支撑物处于第二位置时，所述磁化部分面向各移液锥体的位置在所述锥体的尖端上方。

换言之，当磁化部分(如包括一个或多个永久磁体)存在于第三容置部时，其牢固连接移液锥体并因而遵循其相对于基底的平移。在这些移动期间，磁化部分由此保持磁性颗粒的沉淀附于锥体。因此，技术人员能例如升起移液器以更容易移动基底中的孔支撑物，而没有移动锥体中的颗粒沉淀的风险。

根据一个特定实施方案，第二和第三容置部联通，且移液器支撑物包括能可移动维持第三容置部中磁化部分的构件。这样，技术人员能分开磁化部分与移液器支撑物，其随后通过落入第二容置部而在基底中自动占有一席之地。尤其是在锥体尖端中操作磁性颗粒迁移时此分开发生。

根据一个实施方案：

-所述基底包括至少一个能旋转的齿轮；

-所述移液器支撑物包括啮合齿轮的齿条以使移液器支撑物在齿轮旋转期间相对于基底平移。

具体地，移液器支架包括在第一位置锁定和解锁移液器支撑物的装置。具体地，移液器支架包括至少一个手柄，其牢固连接齿轮以转动所述轮并且能可移动地附着于牢固连接另一移液器支架齿轮的手柄，这因而能在提取方法期间增加移液锥体数目。

本发明的主题还是用于提取液体形式生物学样品所含组分的系统，所述组分能结合磁性颗粒，所述系统包括：

-移液器，装有至少一个管状的移液锥体和回路，所述移液锥体包含用于移液的尖端，所述回路用于各移液锥体的吸入和放出；

-至少一个孔支撑物；

-移液器支架，包括：

o基底；

o基底中制备的凹处，其能可移动接受各孔支撑物；

o移液器支撑物，包括第一容置部，其中能，有利地可移动地，插入移液器，第一容置部开口到基底凹处上，移液器支撑物以平行于移液锥体轴的方向相对于基底平移，并在第一位置与至少一个第二位置之间流动，在第一位置，各移液锥体的尖端插入孔支撑物的孔，在第二位置，所述尖端在所述孔外；

o第二容置部，当移液器支撑物处于第一位置时，第二容置部面向各移液锥体的位置在其尖端上方，当移液器支撑物处于第二位置时，第二容置部面向移液锥体尖端；和

-磁化部分，其可移动地插入第二容置部。

具体地，移液器支架与如上所述的移液器支架是一致的。

本发明还旨在提供孔支撑物，用于使磁性颗粒从移液锥体的尖端迁移到回收孔内。

为此，本发明的主题还是孔支撑物，包括其中制备了用于接受孔的凹处的部分和至少一个面向所述部分中制备的各凹处的磁体。

附图简要说明

通过阅读之后的描述，本发明会得到更清晰理解，所述描述仅通过举例给出并结合附图，其中相同的标记表示相同的元件，且其中：

-图1是本发明的提取系统的透视图；

-图2a和2b是电动式移液器和其可移动的移液锥体的正面透视图；

-图3a和3b是本发明的移液器支架的正面透视图；

-图4a和4b是图3的移液器支架的分别沿着图3b的平面a-a和b-b的详细截面图；

-图5是包含孔的“深孔”板的透视图；

-图6a和6b是磁力架和能插入磁力架的pcr洗脱管的透视图；

-图7是本发明的磁化部分的正面图；

-图8是本发明的提取方法的流程图；

-图9是本发明的系统的移液锥体的照片，磁性颗粒沉淀位于锥体的大致一半位置；

-图10是这些相同锥体的照片，沉淀位于所述锥体的尖端；

-图11是pcr洗脱管的照片，其中已回收了磁性颗粒；

-图12和13阐明本发明的移液器支架的第二实施方案；

-图14是两个图1的系统的透视图，所述系统连接旋转手柄构件；

-图15的图解视图阐明溶液弯液面在颗粒的沉淀上的上下移动，以使所述沉淀与移液锥体壁分离。

除了图15，给出的描述涉及缩小比例实际系统的平面和照片。

发明详述

参考图1-7，用于提取液体样品所含组分的系统10(图1)包括电动式移液器12(图2)，其中插入移液器12的移液器支架14(图3)，能各自插入移液器支架14的一个或多个孔支撑物18a、18b(图5和6)，以及第一磁化部分16(图7)。

便携式移液器12包括一排移液锥体20和上面安装锥体20的主体22(图2a)。此主体22安置用于锥体20中液体吸入/放出的回路(如由电动机驱动的一套活塞)，和用于控制吸入/放出回路的电子线路。电子线路含有例如微处理器和一个或多个计算机内存，是可编程，且具有嵌入其中的用于实施一或多种移液方案的说明书，各方案包括一个或多个步骤。电子线路也包括主体22的手柄26中安置的人机界面24，该界面包括一套选择和导航按钮28以及显示屏30，允许多个经记录的移液方案的可视化和选择。用户可特定编程电动式移液器12，如通过无线连接例如蓝牙从连接移液器12的计算机下载说明书到所述移液器。用户也能经界面24选择预记录的操作。而且移液器12能将预定体积的液体吸入各锥体20，从各锥体放出预定体积，并实施不同时间和频率的自动吸入/放出循环。

如图2b更具体阐明的，锥体20为管型且具有纵轴x，其通过拟合从主体22伸出的凸耳32而可移动，这允许其被替换。锥体进一步由塑料例如聚丙烯组成，其具有使其对磁场“透明”的效果且允许捕获磁性颗粒，这会在后面更详细描述。最终，各锥体20在其移液开口端具有锥形轮廓21或“尖端”。此部分21在垂直于轴x的平面具有减小的横截面，众所周知，这使得将其引入容器或孔变得更容易。

例如，电动式移液器12是瑞士因特瑞公司(biosciencesag)销售的“8通道viafloii”型，该型的元件描述于专利申请us2009/071266、us2009/074622、us2011/076205和us2008/095671。

就其本身而言，移液器支架14包括(图3a和3b)意在置于工作台(如实验台或实验工作台)上的基底34，以及相对于基底34移动的可移动部分36。可移动部分36也称为“移液器支撑物”，包括容置部38，移液器12能可移动地插入其中并保持固定，如图1所示。对于移液器支撑物36相对于基底34的平移，支撑物36包括一个或多个齿条40，例如其中的2个啮合轮轴44上安装的齿轮42，轮轴44旋转并且插入基底34。一个或多个棒杆46也附于支撑物36(分别在基底34中)并在基底34的孔口中滑动(分别在支撑物36中)以引导支撑物36平移。一个或两个旋转手柄50也附于轮轴44末端以允许用户容易以箭头52的方向转动后者(图1)并因而导致移液器支撑物36如箭头54所示上升和下降(图1)。当移液器12置于支撑物36的容置部38中时，移液器支撑物36相对于基底34的平移因而与锥体20的轴x平行，当基底34置于水平工作台上时，所述平移因而与重力方向平行，从而支撑物36“上升”或“下降”。

基底34在其正面56上开口，以允许引入和取出孔支撑物18a、18b，从而定义用于后者的容置部。此容置部在其上部开口以允许移液器12的锥体20在移液器下降时到达所述孔支撑物。因此，如下更详细所述，移液器12能相对于基底34(并因而相对于插入后者的孔支撑物18a、18b)占据数个位置。具体地，移液器12能占据位置，在所述位置，锥体20的尖端21伸入支撑物18a、18b的孔内，且在至少一个位置，尖端21不伸入孔，并与后者有一定距离以允许孔支撑物被用户操作和磁性颗粒在锥体20的中央位置捕获。

参考图5和6，根据所需的提取，孔支撑物可具有若干形式。具体地，孔支撑物是区室化的板18a(图5)，通常称为“微孔板”或“deepwell”类型。此类板包括多行60的孔52，其中移液锥体20的行能伸入。各行60可因而接受系统10所实施的提取步骤中使用的特定液体。然后，由用户简单实施从一个行60传递到其他行，用户将特定的行60放置成与移液锥体20对齐，行60含有必须实施的步骤所需的液体。

图6a所述的另一孔支撑物是磁化的并特别设计用于使磁性颗粒从移液锥体20的尖端21迁移到孔内。出于此目的，支撑物18b包括主体64，其中制成能接受成行的移液锥体20的一行容置部66，且其中插入含一个或多个永久磁体的第二磁化部分68，例如靠近各孔66的永久磁体。如所阐明的，磁化部分68置于孔66下或面向其下部。因此，当移液锥体20的尖端21伸入孔66时，所述尖端置于磁化部分68上方。最终，支撑物18b用作磁力架，其可移动地接受容置部66中的管69，例如图6b所示的pcr洗脱管，用于诸如后续转移其中回收的提取产物等目的。

第一磁化部分16的功能是捕获锥体20中的磁化颗粒，所述捕获以后面更详细描述的方式进行，就其本身而言，第一磁化部分16包括一个或多个永久磁体72，有利地是一行彼此由空间74分开的永久磁体，甚至更有利的是，当部分16完整插入基底34时，永久磁体面向各移液锥体20。部分16也包括由用户更好抓握的手柄76。

基底34中提供用于接受磁化部分16的容置部78，放置容置部78使得部分16面向移液锥体20，在其尖端21上方，且优选地，在大于孔的高度面向中央区80(当尖端21伸入保持在孔支撑物中的孔时)。这样，捕获颗粒的锥体体积大到足以不在锥体中形成堵塞。

移液器支架14也包括用于控制支撑物36上升速度的构件。具体地，设计齿条和齿轮使得轮50转半圈(180°)能通过整个齿条，且配重块(masselotte)58以相对于轴44的离轴方式整合入手柄50。这些配重块在其重量和相关杠杆作用下，产生转动力偶，其使轴44旋转，同时限制用户通过手传送的力偶。有利地，如图4a所示，出于同一目的，相当部分的轴44也由半圆柱形配重块形成。此机械辅助有助于升起移液器支撑物，并因而限制肌肉骨骼问题，且实施制动，这允许用户更精确控制支撑物36上升和下降的速度。

可提供控制支撑物36速度的其它机制，尤其是磁制动。例如，参考图4a，配重块59包括可磁化材料(如钢铁或等同物)且第三磁化部分80(平行六面体或与轴44同心的圆弧形状)放置在基底34中，优选涉及轴44面向磁化部分16，从而不破坏提取。当轴的配重块59在磁化部分80前面穿过时，轴44的旋转运动减慢，因为产生制动力偶。这一方面能补偿上升期间升起移液器的努力(通过用作用户辅助)，另一方面，当需要引起磁性颗粒下降到移液锥体底部时，能控制移液器上升的速度，如下所述。

有利地，也提供停止机制，如图4b所示。此变型中，由可变形材料(如弹性体)构成的轮84安装在轴44上并包括2个齿86、88。凸起82例如半球状凸起进一步从基底84面向轮84伸出。当用户通过制动轮50来升起移液器12时，第一齿86遇到凸起82。当应用于轮50的切向力(coupe)增加时，齿86弯曲，通过凸起82，并恢复其形状。在此位置，齿86能随后停在凸起82上，选择该齿的硬度使得其在移液器12和移液器支架36的重量作用下不弯曲。移液器因而在顶部位置受阻，用户由此能释放轮50。第二齿88尺寸更大(如长度和/或宽度)，需要大许多的力偶以使其通过，并因而定义限位器以防止移液器支架36与基底34分离，除非用户使用能破坏该齿的力。作为变型，凸起82被限位器取代，所述限位器包括在基底容置部的弹簧上安装的球。因此，轮84可由硬质材料构成。然后，第一齿86的活动具有将推球到其容置部中的效果，由此允许齿86通过。

目前描述的是通过磁性颗粒提取液体样品中所含有的组分的方法，此方法由刚刚描述的系统实施。所述方法基于移液器支架、可编程的电动式移液器和移液锥体(如体积为1250μl)的组合，是为了实施捕获、洗涤和洗脱磁性颗粒的多个步骤，用于处理1ml-5ml的样品体积/移液锥体。从而，在吸入/放出所有待处理的样品体积的循环期间，在移液锥体中实施磁性颗粒的捕获。例如，结合图8的流程图描述纯化病毒核酸的方法，使用化学，即通过磁性二氧化硅颗粒提取核酸。

所述方法开始于制备纯化所需多种样品和试剂的步骤100，然后是102中的所述纯化。

具体地，制备100包括在104中混合含病毒(想要从其提取核酸)的生物学样品与用于化学裂解病毒的试剂(如来自biomérieux的““nuclisensminimag”裂解试剂，货号200292，或来自biomérieux的“nuclisenseasymag”裂解试剂，货号280130)，比例为2体积裂解试剂用于1体积样品。混合物随后在56℃加热30分钟，由此以已知方式从病毒中释放核酸。然后在106中向裂解样品引入磁性二氧化硅颗粒(如颗粒具有顺磁性、铁磁性或亚铁磁核心，其可显示或不显示剩磁，所述核心覆盖有二氧化硅壳)，其具有结合核酸的性质。

制备100在108中继续，这是通过填充具有5ml孔62的微孔板18a和磁力架18b的0.2mlpcr洗脱管69，从而：

-微孔板18a第一行的各孔填充有含二氧化硅颗粒的裂解样品，下文称为“裂解样品”。第一行各孔的总体积优选大于1.5ml，这是因为使用5mldeepwell微孔板和由电动式移液器处理的体积；

-微孔板18a第二行的各孔66填充有1250μl洗涤缓冲液(如来自biomérieux的“nuclisenseasymag提取缓冲液2号”，bmx货号280131)；

-微孔板18a第三行的各孔66填充有1250μl洗涤缓冲液(如来自biomérieux的“nuclisenseasymag提取缓冲液2号”，bmx货号280131)；

-插入磁力架18b的各pcr洗脱管69填充有100μl体积的洗脱缓冲液(如来自biomérieux的“nuclisenseasymag提取缓冲液3号”，货号280132)。

用户随后放置：

-电动式移液器12，带有其锥体20的行，在移液器支架14的容置部38中处于升起的位置以允许引入板18a；和

-基底34的容置部56中的板18a，含裂解样品的第一行孔与锥体20对齐。

提取102起始于裂解样品匀化。为此，磁化部分16不置于基底34中且因而不干扰锥体20。用户转动轮50之一，以使锥体20的尖端21伸入含裂解样品的板18a的孔行。然后，用户通过移液器12的界面24方式选择第一移液操作，包括至少一个阶段的锥体20中裂解样品吸入/放出，以及启动所选操作。这些阶段(如其中的2个)各包括至少一个吸入/放出循环(如5个循环)，接着是数分钟的等待阶段，例如5分钟。出于本发明目的，除非程序另有说明，吸入和放出循环包括填充至少四分之三锥体，例如完全填充，随后完全排空其。

一旦完成匀化，锥体20是空的且其尖端21伸入含裂解样品的孔。提取102在112中继续于锥体20内壁上捕获二氧化硅颗粒、裂解样品。为此，用户将磁化部分16置于基底34的容置部78中，通过移液器12的界面24选择第二移液操作，然后启动所选操作。第二操作包括多个吸入/等待/放出循环，如约10个循环，吸入操作与放出操作分开数秒，例如约10秒。各吸入操作和各放出操作中，通过磁化部分16的磁场，在移液锥体的壁上捕获裂解样品所含部分颗粒。磁性颗粒以及因而其结合的核酸，由此以面向磁化部分16的颗粒沉淀100形式捕获，且优选在锥体20一半位置的中央区，如图9所示。

一旦完成捕获，裂解样品完全从锥体20中放出且磁化部分16仍处于位置上，提取102继续第一洗涤步骤114。为此，用户升起移液器支架14(分别升起移液器12)以从锥体20释放板18a，使板18a第二行对齐锥体20的行，随后重新放置移液器支架(分别降低移液器)以使锥体尖端21伸入板18a的孔。然后，用户通过界面24方式选择第三移液操作，包括至少一个阶段的锥体20中裂解样品吸入/放出，接着启动所选操作。例如，第三操作与第一操作相同。因此，洗涤缓冲液重复穿过颗粒沉淀能洗涤所述颗粒。有利地实施此洗涤步骤，或与在锥体上捕获颗粒的磁场调节联合实施。例如，用户升起和降低移液器12，这具有在移动锥体上颗粒沉淀的作用，或者磁化部分16包括一套永久磁体且用户从其容置部78上下移动滑动磁化部分16，从而捕获沉淀的磁场的强度和线可变，同时维持锥体上捕获的颗粒。因此，磁场调节具有在洗涤期间重组沉淀以及增加其效率的作用。

随后通过板18a第三行的洗涤缓冲液在116中实施第二洗涤操作。例如，第一洗涤缓冲液完全被清空出锥体，然后实施与第一洗涤操作相同的第二洗涤操作。

此第二洗涤操作后，实施将颗粒沉淀200迁移118到锥体20尖端21的步骤。为此，锥体20优选保持填充有第二洗涤缓冲液以促进沉淀200滑动和保持与板18a第二行对齐。用户随之转动轮50之一以升起锥体20。由于磁化部分16牢固连接基底34，沉淀因而相对于所述部分保持固定并且随着移液器上升，通过沿着锥体20壁滑动而趋向尖端21迁移。如图10所示，一旦沉淀200处于尖端21，用户停止升起移液器12，离锥体开口端的平均距离为若干毫米，如8mm。此位置中，用户通过界面24选择且随后启动将锥体20所含洗涤缓冲液放出到板18a的孔中。任选地，洗涤阶段之一或一个额外洗涤阶段包括移出磁化部分以释放磁性颗粒和实施洗涤操作，同时通过吸入和放出循环在洗涤液中搅拌颗粒。随后通过重新放置磁化部分并如前所述进行吸入和放出循环再次捕获颗粒。

纯化102结束于将锥体20的尖端21中存在的磁性颗粒转移到pcr洗脱管69的步骤120。为此，用户升起移液器支架14，移出板18a，将磁力架18b置于容置部56中以将pcr管69与锥体20行对齐，依靠移液器支架14并从基底14中移出磁化部分16以从锥体释放捕获的磁性颗粒。一旦尖端21伸入管69，用户通过界面24选择第四移液操作，然后启动所选操作。此方案的第一变型由锥体20的尖端21中洗脱缓冲液吸入和放出循环组成，这能通过破裂颗粒沉淀来重悬磁性颗粒。此外，选定用于循环的频率使得一些磁性颗粒能在管69中的各次放出时，通过插入架64的磁化部分68的磁场而捕获于管69。另外，这些循环能“冲洗”尖端21以回收粘附锥体壁的颗粒。在方案的第二变型中，首先以较高频率实施吸入和放出循环以更有力搅拌缓冲液和颗粒，并因而获得加速匀化，促进转移到洗脱管69。转移步骤结束于洗脱缓冲液的完全放出到管69中。如图11所示，在架64的磁场影响下，磁性颗粒随后与洗脱缓冲液明确分离。因此，用户能回收管69用于后续处理，特别是以已知方式通过加热来洗脱核酸。

在前述移液器支架的实施方案中，所述磁化部分16插入基底34。因此，当用户希望前移板18a时，他能升起移液器高到足以执行此操作。就颗粒迁移到尖端而言，这引起沉淀200在锥体20壁上移动，具有能在自身上翻滚的沉淀“重组”优势。从而增强洗涤效率。另一方面，这意味着用户注意永远不要升起移液器到太远，以免导致沉淀离开锥体。为此，用户能例如升起或倾斜移液器支架以使沉淀与锥体开口保持一定距离。此选择需要重复升起装置，其重量可能相当大，但能导致长期肌肉骨骼问题。另外，用户还必须注意不要升起移液器支架太多，从而沉淀不离开锥体。

本发明的移液器支架的第二实施方案允许操作板18a、18b，这是通过仅升起移液器并因而避免升起移液器支架14，同时确保颗粒沉淀与锥体尖端21保持一定距离。图12和13阐明此第二实施方案以及涉及刚刚所述方法产生的变化。

更特定地，第二实施方案与第一实施方案的差异在于接受移液器支架14中磁化部分16的方式。具体地，基底34包括容置部78，用于如前所述插入和移出磁化部分16且容置部78在其上部130打开以同样允许在容置部78中垂直插入和移出部分16。移液器支撑物36还包括根据开放容置部78附着磁化部分16的构件，尤其是一个或多个由可磁化材料制成的块132(如由钢铁制成)附于移动移液器支撑物36的后壁(图12c)。这样，当用户升起和降低移液器(特别是洗涤阶段中)时，磁化部分16牢固连接移动支撑物36并保持面向锥体20，如图12b-13a所示。

为实施沉淀200迁移入锥体20尖端，用户通过对部分16的手柄78施加简单向下压力来分离磁化部分16与移液器支撑物36，并升起移液器12。磁化部分16脱离块134，因而保持在基底的容置部78中并由此牢固连接基底34，诱导沉淀200迁移入锥体尖端21，如前所述(图13a和13b)。一旦沉淀升高，用户用装有pcr洗脱管的架18b取代板18a，移出磁化部分16并重新降低移液器(图13c，管69未表示)。作为变型，移液器支撑物36能包括与基底容置部78类似的容置部，其中用户滑动磁化部分，尤其是用于洗涤阶段。

已描述了一种特别的提取方法。然而，本发明应用于任何类型的磁性颗粒捕获和任何类型的移液顺序。同样，已描述了具有8通道、特定体积的移液器。根据预期应用，移液器能包括任何数目、任何体积的通道。

为增加处理的样品数目，本发明所述2个提前系统能偶联，如图14所示。例如，旋转手柄50可一起拟合，从而2个提取能同时实施，用户同时升起和降低移液器12。为此，移液器也能同步化，例如一个移液器控制另一移液器。

同样，描述了便携式和半自动提取系统，尤其适合每天待实施的提取数目有限的测试实验室。然而，本发明能自动化。例如，移液器整合入自动装置，该装置包括用于升起和降低移液器以及用于移动磁体(或激活/灭活电磁体)的可控机构。

描述了微孔板18a第二行和第三行孔中的2个洗涤操作。然而，可以有任意数目的洗涤操作。同样，描述了在锥体中捕获颗粒的单一步骤。还能提供一个或多个释放颗粒的步骤，各自后面是进一步的捕获步骤。

为释放颗粒，用于捕获颗粒的磁场通过从其容置部中移出磁化部分16来失效，然后，在移液锥体中实施缓冲液吸入/放出循环以使颗粒沉淀脱离锥体壁和并使其解聚。这种过程需要超过10分钟来使沉淀完全脱离锥体壁，每分钟5个循环的吸入/放出频率(锥体中的完整吸入和放出)。关于图15，沉淀200的更快释放如下获得：在沉淀200上实施弯液面300的上下移动，缓冲液302在锥体20中形成。具体地，吸入/放出循环调节成弯液面300经过沉淀200任一面的有限路径304以增加弯液面通过沉淀的频率。同样，吸入/放出循环的频率增加以进一步提高所述通过频率，尤其是循环频率大于区上每秒2个循环，在该处存在磁性颗粒沉淀。应用此过程时，沉淀在小于1分钟内脱离锥体。发明人注意到弯液面通过沉淀可有助于分离后者。确实，试验如下实施：在锥体中迅速搅拌缓冲液，而没有使弯液面通过沉淀(即在沉淀前“简单”移动液体)，没有任何显著的时间节约。一旦沉淀释放阶段实施，所述阶段也具有解聚沉淀的作用，则执行通过锥体中完整吸入/放出来搅拌的阶段(如每分钟8个吸入/放出循环)以结束沉淀解聚和匀化含颗粒的缓冲液。微孔板孔中的这些完整吸入/放出循环可在更长路径中搅拌更大体积，从而促进缓冲液匀化。

现在给出提取核酸(如dna和rna)优选方法的描述，尤其是病毒来源的核酸，例如通过磁性二氧化硅颗粒方式。此方法包括颗粒释放阶段，如前所述，然后是缓冲液中洗涤和重新捕获颗粒的阶段。由于提取改善，获得了显著的时间节约。具体地，一旦实施病毒裂解步骤，所述方法包括：

1.移液锥体中捕获磁性颗粒的第一步骤，如采用前述方式；

2.然后是第一洗涤步骤，且优选至少一个第二洗涤步骤，在填充有洗涤缓冲液(如来自biomérieux的“nuclisenseasymag提取缓冲液1号”，货号280130)的微孔板不同行中。各洗涤操作包括带有移液锥体所捕获颗粒的洗涤缓冲液吸入/放出循环，持续至少15秒，优选25秒-35秒，例如30秒，优选小于1分钟；

3.至少一个第三洗涤步骤，在填充有洗涤缓冲液(如来自biomérieux的“nuclisenseasymag提取缓冲液2号”，货号280131)的微孔板18a第三行中。此第三洗涤步骤中，通过移出磁体来释放颗粒，从而使颗粒重悬，带有悬液中的颗粒的缓冲液在微孔板18a对应孔内吸入/放出。第三洗涤步骤优选包括前述弯液面通过沉淀的阶段，持续数分钟，具体是5分钟；

4.在移液锥体上捕获颗粒的第二步骤，例如，前面所描述的；

5.任选地，第四洗涤步骤，颗粒捕获于微孔板18a第三行，微孔板18a填充有洗涤缓冲液(如来自biomérieux的“nuclisenseasymag提取缓冲液2号”，货号280131)；

6.颗粒沉淀迁移入尖端的步骤，然后是转移到管内的步骤(如含有洗脱缓冲液，例如来自biomérieux的“nuclisenseasymag提取缓冲液3号”，货号280132)，例如，前面所描述的。

描述nuclisens范围内的洗涤缓冲液，尤其是提取缓冲液1号、2号和3号。更普遍地：

-提取缓冲液1号是促进二氧化硅上核酸捕获的缓冲液，这是通过在二氧化硅的硅醇基与核酸的磷酸基之间建立桥联。例如，其包括硫氰酸胍即离液剂，描述于r.boom等.“rapidandsimplemethodforpurificationofnucleicacids.”journalofclinicalmicrobiology.1989；28(3):495-503；

-第一和第二洗涤操作能移出剩余基质或微生物碎片，

-第三和第四洗涤操作能移出微量的guscn和pcr型扩增的抑制剂，所述扩增通常在磁性颗粒捕获的dna/rna上实施，

-pcr锥体中包括的洗脱缓冲液能移出任何痕量的洗涤缓冲液并处于洗脱步骤的最优条件下。

下表比较用本发明所述装置在应用刚刚所描述的方案(2个第一洗涤操作，接着是释放颗粒的第三洗涤操作)时获得的结果与用现有技术装置获得的结果，现有技术装置即biomérieux公司销售的并视作病毒rna提取的参照装置。的操作包括用洗涤缓冲液的4个洗涤步骤(2个用“nuclisenseasymag提取缓冲液1号”且2个用“nuclisenseasymag提取缓冲液2号”)。为确定提取效率，实施所提取裂解物的实时pcr扩增(或“q-pcr”)并测量各样品的ct(“循环阈值”，其定量样品中的核酸检测阈值)。一式二份测试的样品是25克覆盆子或葱的样品，其中加入纯的(对应于500拷贝的基因组/25克)或稀释到1/10^e的门戈病毒溶液。

可以看出，本发明的病毒rna提取给出的结果与用的那些类似。另外，用具有不同品质的多批次磁性二氧化硅颗粒实施试验。注意到本发明的提取在涉及所述颗粒品质方面令人意外地非常稳健。具体地，对颗粒批次性能等级较低的相同样品实施试验，提取不包括前述释放/洗涤/重新捕获步骤。此情况中，提取程度较低。当使用前述带缺陷颗粒的优选方法时，获得类似上表那些的结果。

描述了本发明在捕获核酸如rna和/或dna上的应用，rna和/或dna源自捕获/洗涤/迁移和转移阶段前实施的裂解。本发明还通过磁性颗粒应用于微生物(如细菌、真菌、酵母)捕获，所述颗粒表面功能化以捕获微生物(如覆盖有噬菌体蛋白或已知适合这种捕获的聚阳离子)。带有其捕获的微生物的磁性颗粒转移入管内以随后经历裂解，例如机械裂解。所得裂解物可以直接是处理对象，例如聚合酶链式反应扩增(如定量pcr或q-pcr型)，或能根据前述核酸提取方法纯化。

本发明特别适合制备微生物学样品以用于pcr目的。实际上，在其上实施移液锥体中颗粒捕获的样品可具有极大体积(如数毫升)，而颗粒转移入其中的管的终体积可以极小(如小于或等于200微升，或甚至小于或等于100微升)。由于样品体积大，捕获大量微生物。通过极小的终体积，具有浓缩微生物的作用。因此，发明人注意到，从数毫升样品捕获的单一阶段和之后的单一洗涤步骤，足以通过在5微升体积中实施的q-pcr从裂解物获得结果。

具体地，有液体营养培养基的食物基质(鸡肉)的富集在41.5℃实施5小时。之后用德尔卑沙门氏菌(salmonelladerby)菌株以10²-10⁴cfu/ml水平实施污染，该水平对应于食物基质中存在病原体情况下富集后能达到的浓度(即食物批次确定为不能吃的浓度)。对各污染样品实施2个过程，一式二份，一个根据标准化捕获方案，用来自法国biomérieux的系统，一个根据本发明。

gene-up方案由样品“珠打”步骤(即机械破碎细菌壁)组成，这是通过取20μl所述样品和将其置于含有180μl洗涤缓冲液的珠打管，然后在微孔板振荡器上振动5分钟进行珠打。取5微升终溶液并进行q-pcr。

就其本身而言，本发明所述方法由以下组成：

1.特异性捕获步骤，通过使2ml样品接触生物素化的噬菌体蛋白溶液(终浓度2μg/ml)，所述接触通过以下进行：

a.通过移液锥体中吸入/放出来搅拌10分钟；

b.加入“hyglos链霉亲和素”磁性颗粒(50μl)并通过吸入/放出来搅拌15分钟(细菌-生物素化的噬菌体蛋白复合体结合磁性颗粒)；

c.适当放置磁体以在锥体中收集磁性颗粒的阶段；

d.启动磁性颗粒捕获循环；

2.在含有tst(tris盐水吐温(tween))洗涤液的孔中洗涤的步骤，用5个吸入/放出循环；

3.在接受珠打处理的5微升管中收集磁性颗粒的步骤，5微升终溶液随后进行q-pcr。

根据方案和根据本发明获得的结果如下表所概括：

相较于gene-up标准方案，估计的灵敏度增益是2log。

本发明回答施用多种磁力捕获技术(核酸纯化、磁性免疫浓缩等)的多价性的问题。本发明的系统是可进化和可调节的，允许：

-用自主系统实施捕获/洗涤/洗脱磁性颗粒的步骤，所述系统由可编程电动式移液器和使多个上述待执行步骤可行的支撑物的组合组成；

-处理数目1到8的样品，作为所用电动式移液器配置的功能；

-在上面定义的上下文中用半自动系统平行处理样品；

-如果需要增加待处理的样品数目，合并2个系统；

-在各种类型的管中实施洗脱步骤：0.2mlpcr管，用于在涉及核酸捕获时回收磁性二氧化硅颗粒(如化学)，或珠打管，在回收磁性颗粒的情况中，所述颗粒用于回收病原体(磁性免疫浓缩)。为此，所述洗脱能实施在磁性颗粒上捕获/浓缩病原体和其原位裂解的步骤，通过陶瓷/玻璃珠方式(如型方法)。