使用了抗MCT5抗体的癌症治疗用药物组合物的制作方法

本发明涉及一种治疗用药物组合物，其由抗体偶联物构成，所述抗体偶联物是使单克隆抗体与对癌症等过度增殖性疾病具有活性的化合物结合而成的；所述单克隆抗体针对以乳腺癌、大肠癌为主的癌症识别mct5的胞外结构域。另外，本发明涉及用于基于抗体与该化合物的组合使用、或基于抗体偶联物与该化合物的组合使用进行治疗的使用方法。

背景技术

世界上最主要的死亡原因是癌症。尤其乳腺癌在英国、美国及日本是最为常见的女性癌症。目前国内的乳腺癌发病人数超过4万人，该人数还在持续增加。近些年，随着使用了乳腺x线摄影或其它图像诊断法的医疗设备的进步，使乳腺癌的早期诊断成为可能，乳腺癌的治愈率预计会逐渐上升。

通过早期诊断尽管在乳腺癌的初期阶段接受了外科的摘除、放射线治疗，发生复发或转移的患者也并不少。实际上报道了：尽管原发性乳腺癌的切除手术后的5年生存率为90％以上，但乳腺癌发病者中还是有约40％会死亡(非专利文献1：weigeltb，etal.，naturereviews，2005，5，591-602)。另外，还报道了判断生存率超过20年而得到缓解的患者在整体中仅有2～3％。即，对于乳腺癌的治疗期望开发出能够抑制复发或转移的新型药物。

乳腺癌中也存在不复发或不转移的情况，但难以提前预测，因此出于抑制复发或转移的风险，向多数患者给予了治疗药。这种情况对于没有复发或转移的患者而言就意味着要接受有副作用的不必要的治疗。

另一方面，对于乳腺癌手术，出于提高术后生活质量(qualityoflife：qol)的目的而进行了保守治疗。即使在2001年，也仍有总体的40％以上的患者接受了治疗，但实施了保守疗法的患者中也包括复发或转移的风险高的患者。

癌症的“复发”是指：通过手术摘除原发病灶后，残留未能全部去除的肉眼看不到的小癌而再次形成肿瘤的情况、通过药物疗法(抗癌剂治疗)、放射线治疗而已经缩小了的癌症再次变大的情况，发生在最初出现癌症的附近。另一方面，“转移”是指：癌细胞到达与原发病灶不同的脏器，使相同种类的癌症再次产生。例如，乳腺癌在乳房再次形成肿瘤的情况为“复发”，转移至肺的二次癌症是由恶性的乳腺癌细胞形成的乳腺癌肺“转移”。

作为发生“复发”或“转移”的机理，可认为主要原因在于：浸润能力高的癌细胞局部浸润至与原发病灶相同的组织内的其它部位或癌周边组织中，即使进行手术等也会被残留。

在外科去除癌部分后，癌细胞仍复发或转移的情况下，癌细胞所具有的性质是重要的。作为表示癌细胞的性质的恶性程度、发展的程度的指标，使用了异型度和浸润深度。异型度是指癌细胞在细胞形态上与正常细胞不同的程度。另一方面，浸润深度是指癌的深度，癌细胞的浸润能力高时浸润深度较深，被分类为恶性度更高的癌细胞，用于恶性肿瘤的病期分类。因此，可认为浸润能力高的癌细胞是恶性度高、复发或转移风险高的癌症。即，具有高浸润能力的癌细胞使复发、转移的风险上升。因此，若进行靶向浸润能力高的癌细胞的治疗，则可以减少复发、转移的病例，能够降低死亡率。

关于乳腺癌、大肠癌等各种癌症，外科治疗和化学疗法较为常见，但随着近些年的分子靶向药的出现，人们正在摸索癌特异性的新型疗法。

作为针对乳腺癌的分子靶向药在日本被认可的抗体药物已知有赫赛汀(herceptin)。赫赛汀是以her2(也称为erbb2，her2/neu)这样受体为靶标的抗体药物，已获准用作被证实her2过量表达的转移性乳腺癌的治疗药，可认为其与细胞膜上的her2结合，通过由自然杀伤细胞(nk细胞)、巨噬细胞等所致的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(adcc、antibody-dependentcellularcytotoxicity)而使癌细胞灭亡的作用机理来杀死细胞。

作为针对大肠癌的抗体药物，已知有阿瓦斯汀(avastin)、爱必妥(erbitux)。这些药物是以vegf、egf之类的增殖因子为靶标的抗体药物。阿瓦斯汀已获准用于不能进行治愈切除的晚期/复发的大肠癌，其与vegf结合，通过抑制与vegf受体的结合来抑制血管新生，通过断绝向肿瘤组织中供给营养这样的作用机理来发挥抗癌作用。爱必妥旨在通过与egf受体结合来阻止由egf带来的细胞增殖信号作用，从而使癌细胞的增殖停止。

由此，抗体所代表的分子靶向药是在只要特异性识别癌就能杀伤癌细胞方面优异的物质。然而，在抗体也与正常细胞结合的情况下，有时会表现出严重的副作用。例如，作为乳腺癌治疗药的赫赛汀不仅会引起头痛、肌无力症、恶心/呕吐，而且有时还引起间质性肺炎、骨髓抑制、肝损伤、肾损伤、脑血管损伤。另外，在组织染色时已知也与正常的心肌细胞强烈地反应而引起严重的心力衰竭(非专利文献2：britishjournalofcancer，94，1016-1020，2006)。进而，赫赛汀是以her2为靶标的抗体药物，因此存在仅对表达了her2的患者显示出有效性这样的课题。

作为大肠癌治疗药的阿瓦斯汀的情况，作为副作用可列举出出血、血栓症、胃肠道穿孔、创伤治疗的延迟、血压上升等，其中血栓症和胃肠道穿孔是危及生命的副作用(非专利文献3：cancerresearch，57，4593-4599，1997)。爱必妥的情况，作为副作用已知皮肤损伤等，会出现并不危及生命的瘙痒、白色的脓疱等，存在对患者精神上、肉体上的负担(非专利文献4：journalofclinicaloncology，22，1201-1208，2004)。另外，还存在对于由egf受体下游的信号变化(例如k-ras突变)导致的癌化没有效果这样的问题。

因此，针对癌症的抗体药物存在出现严重的副作用、显示出有效性的患者受限等的课题，需要开发出对癌特异性分子靶向且副作用少的新型药物。

癌细胞与正常细胞相比具有高的增殖力且细胞分裂次数没有限制、引起向周边组织浸润、转移这样的特征。近些年，逐渐认为并不是癌组织中的所有癌细胞都具有这种性质，而是仅一部分有限的细胞具有这种性质。即可以认为：这一部分的癌细胞是具有能制造与自身完全相同的细胞的自我复制能力、及能分化为多种细胞的多分化能力这样的胚胎干细胞、体干细胞等干细胞所共同可见的特征的细胞，由于这些特征而边在癌组织中通过自己复制来维持与自身相同的细胞边通过分化而产生周边的大多数癌细胞。这样的一部分癌细胞被称为癌干细胞，提出了癌症是由该干细胞样的细胞发生/发展而来的这样的假说(癌干细胞假说)。

目前，作为癌干细胞标记物，已知有cd133、cd24、cd44等分子标记物(非专利文献5：gastroenterology，138，2151-2162，2010)，但针对它们的抗体据说仅与一部分癌干细胞结合，没有作为治疗药的有效性。另外，已知有被称为lgr5的标记物。该标记物具有与r-spondinl相互作用而激活wnt/β-连环蛋白信号的机制，启示出用作癌干细胞标记物的可能性(专利文献1：日本特表2010-532169公报)。

癌干细胞被认为是癌症的复发、转移的主要原因并指出在癌治疗中以癌干细胞为靶标的重要性。然而，肿瘤组织内的癌干细胞的比率仅有很少一部分，且仅以癌干细胞为靶标的治疗药也被认为无法杀死全部癌细胞。即，以与正常组织相比在癌干细胞中极高地表达、且在通常的癌细胞中也有所表达那样的标记物为靶标的新型疗法的开发对于癌症医疗来说是重要的课题。

存在如下机制：针对在特定的癌细胞中特异性表达的分子的单克隆抗体与抗体细胞表面上的作为抗原的膜蛋白结合后被摄入细胞内。该现象被称为内在化(internalization)。内在化原本是配体与受体结合时所产生的细胞信号传递机制中的一种，除激素、细胞因子受体之外，还报道了转运蛋白。利用通过抗体结合而发生内在化的事实，开发了新型分子靶向药-药剂混合药物，其以通过使药物与抗体结合来特异性地表达靶分子的细胞为靶标，将这些混合药物称为抗体药物偶联物(antibody-drugconjugate：adc)。

adc当中，使赫赛汀(trastuzumab)与dm1(faxane系药剂)结合而成的kadcyla(曲妥珠单抗-艾美坦辛(trastuzumabemtansine)或t-dm1)已被获准作为针对her2阳性晚期乳腺癌的治疗药。作为其治疗机理，报道了：通过使作为抗癌剂的dm1被摄入至细胞内来有效地杀死her2阳性细胞(非专利文献6：cancerres2008；68：(22).november15，2008)。

膜蛋白中不仅存在与配体结合的受体，而且还存在主动或被动转运氨基酸、糖等低分子化合物的运输蛋白(以下记为转运蛋白)。这些分子具有使细胞内外的分子透过的作用，因此一直认为不会引起内在化。然而，如非专利文献7(thejournalofbiologicalchemistry，285，27289-27301，2010)所示，报道了：钠依赖性多巴胺转运体(slc6a3：sodiumdependeddopaminetransporter)恒久地引发了内在化，将不仅受体而且还有转运蛋白与抗体结合而成的药剂有效地转运至细胞内。

单羧酸转运蛋白5(mct5：monocarboxylatetransporter5)是由487个氨基酸组成的膜蛋白，注册为ncbi(美国生物工程信息中心)referencesequences[refseq]id：nm_004696.2、np_004687.1(序列号1：碱基序列、序列号2：氨基酸序列)。mct5是未确定输送的物质的孤儿转运蛋白，基于氨基酸序列的同源性而分类为mct组。

专利文献

专利文献1：日本特表2010-532169公报

非专利文献

非专利文献1：naturereviews，5，591-602，2005

非专利文献2：britishjournalofcancer，94，1016-1020，2006

非专利文献3：cancerresearch，57，4593-4599，1997

非专利文献4：journalofclinicaloncology，22，1201-1208，2004

非专利文献5：gastroenterology，138，2151-2162，2010

非专利文献6：cancerresearch，68，9280-90，2008

非专利文献7：thejournalofbiologicalchemistry，285，27289-27301，2010

技术实现要素：

通常通过手术进行的癌症治疗不仅难以治疗转移病变，而且存在同时发生侵袭和并发症的问题。另外，化学疗法、放射线治疗的副作用成为问题。进而，已知的抗体药物除了产生副作用之外，还存在完全显示不出有效性的癌症。因此，需要开发出癌特异性分子靶向和副作用少的新型药物。

本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现：在识别与普通的癌细胞相比具有更高浸润能力的癌症中高表达的mct5的胞外结构域的抗mct5单克隆抗体与细胞反应时，至少通过网格蛋白路径而在细胞内发生内在化。即，通过使抗mct5单克隆抗体与抗癌剂结合而能够有效地杀死癌细胞，至此完成了本发明。

即，本发明如下。

(1)一种针对mct5或其片段的单克隆抗体

(2)根据(1)所述的抗体，其中，mct5的片段是mct5的胞外区的片段。

(3)根据(1)或(2)所述的抗体，其中，mct5的胞外区的片段由序列号4所示的氨基酸序列组成。

(4)根据(1)～(3)中任一项所述的抗体，其中，抗体为嵌合抗体、人改型抗体(reshapedhumanantibody)或人源化抗体(humanizedantibody)。

(5)一种抗体，其能与(1)～(4)中任一项所述的抗体所能结合的抗原决定簇结合。

(6)一种(1)～(5)中任一项所述的抗体的片段。

(7)一种杂交瘤，其产生(1)～(4)中任一项所述的抗体。

(8)一种癌症治疗用药物组合物，其包含(1)～(5)中任一项所述的抗体或(6)所述的片段。

(9)一种癌症治疗用药物组合物，其包含(1)～(5)中任一项所述的抗体或(6)所述的片段与化疗剂、毒素或放射性同位素的组合。

(10)一种癌症治疗用药物组合物，其包含化疗剂、毒素或放射性同位素与(1)～(5)中任一项所述的抗体或(6)所述的片段结合的复合物。

根据本发明，可提供一种药物组合物，其包含使mct5单克隆抗体或抗原结合片段、该抗体或抗原结合片段与抗癌剂结合而成的物质。该药物组合物尤其作为乳腺癌、大肠癌症治疗用药物组合物是有用的。

另外，与正常组织相比，mct5在浸润能力高的癌细胞中较高地表达，因此根据本发明，可提供能够以恶性度高的癌细胞为靶标、能抑制癌症的发展、转移、复发的新型癌症的治疗药或疗法。

附图说明

图1是示出对于杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体是否与作为免疫小鼠的抗原的icd4反应进行解析的结果的图。

图2是示出通过细胞免疫染色对于在作为人乳腺癌细胞的mcf7细胞中过量表达mct5的细胞(mcf7-mct5细胞)、作为高转移性的人乳腺癌细胞的mda-mb231细胞和作为人大肠癌细胞的hct116细胞与抗mct5抗体的反应的进行结果的图。为mcf7-mct5细胞的情况下，作为二次抗体使用被alexa555标记的二次抗体进行了解析；为mda-mb231细胞和hct116细胞的情况下，使用被alexa488标记的二次抗体进行了解析。由于mcf7-mct5细胞中组入了设计用于与mct5同时表达egfp的基因，因此在488nm下激发可观察到egfp的荧光。

图3是示出使用流式细胞仪对作为抗mct5单克隆抗体的克隆编号imi4c4a抗体与作为人大肠癌细胞的hct116细胞的细胞表面结合的情况进行解析的结果。是使细胞与抗体反应后与被alexa488标记的二次抗体反应并进行解析的结果的图。

图4是示出对于使作为人乳腺癌细胞的sk-br3细胞、mda-mb231细胞和作为人大肠癌细胞的hct116细胞与imi4c4a抗体反应，并与被alexa488标记的二次抗体反应后，被摄入至抗体的细胞内的情况经时地进行解析的结果的图。图左侧所示的时间表示与抗体反应后的培养时间。另外，图右侧是示出对于赫赛汀和sk-br3细胞同样进行了解析的结果的图。表明抗体(绿色的荧光)被经时地摄入至细胞的内部。另外，溶酶体(lysosome)(红色荧光)是被作为ph敏感性的荧光色素的溶酶体荧光探针dnd-99染色的部分。

图5是示出对于用图上半部分所示的浓度的伴刀豆球蛋白a处理hct116细胞1小时后，使其与imi4c4a抗体反应，被摄入至细胞内的情况经时地进行解析结果的图。

图6是示出用0.5mg/ml的伴刀豆球蛋白a处理hct116细胞1小时后，使其与imi4c4a抗体、107抗体、217抗体、221抗体、223抗体、303抗体、306抗体和301抗体反应，在抑制被摄入至细胞内的状态下，对于抗体与细胞的反应性进行解析的结果的图。

图7是示出对于通过抗体-皂草素复合物是否抑制mcf7-mct5细胞的增殖进行解析的结果的图。图下所示的浓度表示在培养基中添加的链霉亲和素-zap(链霉亲和素-皂草素复合物)的浓度。另外，使用的生物素化抗体全部为50nm。

具体实施方式

以下对本发明进行详细地说明。需要说明的是，本发明不限定于以下的实施方式，可以在本发明的主旨范围内适宜变形地加以实施。

本发明涉及与mct5结合的单克隆抗体或其抗原结合片段。另外，本发明涉及该抗体、抗原结合片段和含有其的药物组合物、以及产生该抗体的杂交瘤细胞、用于制造该抗体和片段的核酸、重组表达载体及细胞。

本发明人在之前的研究中发现：在乳腺癌和大肠癌中表达mct5；以及识别mct5的单克隆抗体能用作大肠癌的检测药和诊断药。进而，已经证实了被认为是胞内结构域的mct5的碱基序列751～774的区域(aatttaacagtctcacaaaatcaa(序列号3))、氨基酸残基251～258的区域(nltvsqnq(序列号4))存在于细胞外。此外，证实了：过量表达了mct5的人乳腺癌细胞的浸润能力增加、抗mct5抗体(克隆编号imi4c4a)仅与一部分肿瘤组织结合、及抗mct5抗体阳性组织根据乳腺癌组织的发展阶段不同表达比例上升，因而表明在浸润能力高的乳腺癌中特异性表达mct5，抗mct5抗体能够检测恶性度高的乳腺癌。进而，证实了：imi4c4a抗体将mct5蛋白质的第251～258位(序列号4：氨基酸序列)作为表位。

本发明涉及药物组合物，其含有使抗癌剂与能和mct5结合的单克隆抗体或其抗原结合片段结合而得到的抗体-抗癌剂复合物。

单羧酸转运蛋白5(mct5：monocarboxylatetransporter5)是多次跨膜型的膜蛋白，是未确定输送物质的孤儿转运蛋白。基于与细胞内外的乳酸浓度调节相关的mct1和mct4的氨基酸序列的同源性，预测出具有相同功能。

本发明是基于如下见解的发明：作为膜蛋白的mct5是在癌的组织中过量表达的蛋白质，与普通的癌细胞相比，在作为癌症复发、转移的主要原因的浸润性高的癌细胞中较高地表达。

本发明提供识别mct5的胞外区的单克隆抗体或其抗原结合片段。由于mct5在乳腺癌和大肠癌等癌细胞中表达，因此该抗体与乳腺癌和大肠癌等癌细胞特异性结合。

1.本发明的抗mct5抗体

本发明的单克隆抗体(以下也称为“本发明的抗mct5抗体”)能够识别天然的mct5。“天然的”是指：处于该蛋白质在生物体内的环境中所具有的完整的立体结构的状态。

另外，在本发明的另一个方式中，本发明的抗mct5抗体能够识别mct5的胞外区。详细而言，本发明的抗mct5抗体识别mct5的胞外区内的至少一部分立体结构作为表位。特别是，胞外区由mct5基因的碱基序列751～774的区域的碱基序列(序列号3)编码，且能够识别氨基酸残基251～258的区域(序列号4)。

对于本发明的抗mct5抗体，只要维持与具有序列号4所示的氨基酸序列的多肽的结合活性的范围、即只要结合对象的多肽具有作为mct5的胞外区的功能，就能够识别如下多肽：序列号4所示的氨基酸序列的1个或多个(例如2、3、4或5个)进行了置换、缺失或插入氨基酸的突变型多肽；与序列号4所示的氨基酸序列具有50％以上、优选为62.5％以上、75％以上或87.5％以上的同源性的突变型多肽。

另外，在本发明的另一个方式中，本发明的抗mct5抗体可以识别具有作为mct5的胞外区功能的多肽，所述多肽有：由序列号3所示的碱基序列组成的多聚核苷酸编码的多肽、由包含序列号3所示的碱基序列的多聚核苷酸编码的多肽、由与序列号3所示的碱基序列具有70％以上、优选为75％以上、79％以上、83％以上、87.5％以上、91％以上或95％以上的同源性的多聚核苷酸编码的突变型多肽；或由包含与序列号3所示的碱基序列在高严格条件下杂交的碱基序列的多聚核苷酸编码的突变型多肽。此处，杂交分析法可以依据公知的方法(例如，molecularcloning2nded(coldspringharborlab.press，1989)进行。高严格的条件是指：所谓形成特异性杂交而不形成非特异性杂交的条件，例如：钠浓度为10mm～300mm、优选为20mm～100mm、温度为25℃～70℃、优选为42℃～55℃下的条件。或者，由于本发明的抗mct5抗体与mct5结合，因此在上述突变型多肽中，本发明的抗mct5抗体能够结合的多肽表现出维持了抗体与具有序列号4的氨基酸序列的多肽的结合活性，即包含在具有作为mct5的胞外区的功能的多肽中。

对于突变型多肽是否具有作为mct5的胞外结构域的功能，可以通过使用基质胶基底膜侵入(matrigelinvasionchamber)等浸润法，对在动物细胞等中强制表达突变型多肽、浸润能力是否增加来加以确认。另外，mct5的胞外区是指在浸润能力高的癌细胞中表达上升的标记物蛋白质的细胞表面部位。突变型多肽是否具有作为mct5的胞外结构域的功能可以通过利用免疫染色、elisa、免疫沉淀、蛋白质印迹法、流式细胞仪等对于在正常细胞和在癌细胞中的突变型多肽的表达进行比较来加以确认。

本发明的抗mct5抗体与表位或突变型多肽的结合可以利用elisa、免疫沉淀、蛋白质印迹法等加以确认。

另外，在本发明的另一个方式中，本发明的抗mct5抗体还识别mct5的mrna可变区所编码的蛋白质。不仅可以与全长mct5结合，而且还可以与缺失了一部分的突变体结合，因此能与表达mct5的癌细胞广泛地结合。

本发明中，“抗体”是由2个重链和2个轻链构成的免疫球蛋白分子。各重链由重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)构成。该重链恒定区由3个结构域ch1、ch2和ch3构成。各轻链由轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)构成。轻链恒定区由1个结构域cl构成。重链可变区和轻链可变区进一步由被称为框架区域(fr)的比较保守的区域和被称为互补决定区(cdr)的超可变区构成。各vh和vl由3个cdr和4个fr构成，从氨基末端至羧基末端依次配置了fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。本发明的抗mct5抗体可以是全长或抗原结合片段。

本发明中，抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)是指保持与抗原(例如，mct5)特异性结合的能力的抗体的1个以上的片段。已知抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段而得到实现。作为抗体的“抗原结合部分”的例子没有限定，可列举出fab、f(ab′)2、fd片段、fv、dab、cdr、scfv、双特异抗体等。fab和f(ab′)2片段等的抗体部分可以使用常用的技术、例如分别使用完整抗体的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化由全长抗体来制备。另外，抗体和抗原结合片段可以使用标准的重组dna技术获得。

本发明中，可以利用各种基因工程和蛋白质工程方法来制作作为单克隆抗体的一部分的抗原结合片段或抗体片段、低分子化抗体、基因重组抗体、抗体修饰物等的抗体样分子、或单克隆抗体所融合的蛋白质。具体而言，没有限定，例如可列举出：h链、l链、fv、fab、fab′、f(ab′)2、scfv、sdfv、sc(fv)2、(scfv)2、双特异抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体、双特异性抗体等的多特异性抗体等。只要是具有与mct5的胞外区的结合能力的分子就都包含在本发明的抗mct5抗体中。

本发明的抗mct5抗体所识别的mct5是在成为检测对象的细胞群体中、在正常细胞中不表达而在浸润能力高的癌细胞中高表达的分子标记物。因此，该抗体与恶性度高的癌细胞结合。

本发明中的“癌细胞”是指具有如下特征的细胞群体：与正常细胞相比具有高的增殖力且没有细胞分裂的次数限制、引起向周边组织浸润、转移等。

本发明中的“浸润能力高的癌细胞”是指癌细胞当中具有浸润至远离最初存在位置的部位的能力的细胞。例如，作为人乳腺癌细胞的mcf7细胞的浸润能力极低或几乎不具有浸润能力。另一方面，源自mcf7细胞的增强了浸润能力的mcf7-14细胞由于浸润能力高且能由移植部位浸润至其它脏器中，因此是具有浸润能力高的性质的细胞(bmccancer(2010)，10，414)。浸润能力高的细胞可以通过使用了基质胶基底膜侵袭小室(matrigelinvasionchamber)等的浸润能力试验进行评价。基质胶模仿基底膜，通过在基质胶层的上部接种、培养细胞，从而能够检测出容易通过(浸润)基质胶层的细胞群体。

本发明中的“正常细胞”是指：在生物体或组织的活动中具有正常功能的细胞。正常细胞可以包含成体干细胞，优选为成熟细胞。

在本发明的另一个方式中，本发明的抗mct5抗体能够与浸润能力高的癌细胞强烈地结合且与1个或多个癌症种类的癌细胞结合。优选的是：该癌症种类和癌细胞为源自心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰腺、脾脏、胸腺、前列腺、精巢、卵巢、小肠、白血球、结肠、胃、骨髓、大肠和外周血单核细胞等细胞或组织中的1个或多个癌症种类，更优选为乳腺癌、大肠癌的癌细胞。

进而，在本发明的另一个方式中，本发明的抗mct5抗体不与正常细胞结合。优选为例如在心脏、脑、胎盘、肺、骨骼肌、肾脏、脾脏、胸腺、前列腺、精巢、卵巢、小肠、白血球、结肠、骨髓、大肠和外周血单核细胞等中的至少1个以上，不与正常细胞结合。

本发明的抗mct5抗体优选由下述杂交瘤产生的抗mct5单克隆抗体。作为产生本发明的单克隆抗体的细胞株(杂交瘤)，例如可列举出：“小鼠-小鼠杂交瘤imi4c4a”(以下称为“imi4c4a”)、“小鼠-小鼠杂交瘤imi4c12a”(以下称为“imi4c12a”)。

在本发明的另一个方式中，本发明的抗mct5抗体为嵌合抗体。“嵌合抗体”是指重链恒定区和轻链恒定区源自人、重链可变区和轻链可变区源自除人之外(例、小鼠)的抗体。本说明书中，有时也将恒定区源自人、可变区源自小鼠的抗体或抗原结合片段称为小鼠-人嵌合抗体或抗原结合片段。

具有这些特征的本发明的抗mct5抗体可以通过使用mct5的胞外结构域的部分蛋白质进行免疫而得到。数据库中的mct5是12次跨膜型的蛋白质，预测作为imi4c4a抗体的抗原的icd4为胞内结构域。然而，如日本特愿2014-203162号公报中记载的那样，mct5的跨膜次数和/或胞外结构域与数据库不一致，至少icd4在细胞外露出。即，识别mct5的胞外结构域的单克隆抗体需要鉴定作为胞外结构域的区域，并制备针对该部分的单克隆抗体。将包含由此新预测出的胞外结构域的氨基酸序列作为抗原而制得的单克隆抗体可以作为抗mct5抗体使用。

在本发明的一个方式中，本发明的抗mct5抗体具有以下的特征。

通过发现mct5的立体结构与数据库不同，本发明的抗体是新得到的抗体，因而能够识别细胞表面上的天然的mct5。另外，以作为抗mct5抗体的imi4c4a的表位附近作为抗原的现有的单克隆抗体(hpa046986)无法识别天然的mct5，且不与细胞表面上的mct5结合。与此相对，本发明的抗体的识别位点能与mct5的胞外结构域结合且能与活细胞结合。因此，本发明的抗mct5抗体作为以表达mct5的癌细胞为靶标的治疗药是有效的。

此外，现有的抗体为多克隆抗体，难以持续性地产生均质的抗体，而本发明的抗体为单克隆抗体，因此能够再现性良好地进行批量生产。基于这些特征，本发明的抗体能用于治疗癌症。

另外，针对mct5的抗体或抗原结合片段不限定于相对于由上述杂交瘤imi4c4a产生的针对mct5的小鼠单克隆抗体本身，只要与由这些杂交瘤产生单克隆抗体所识别的表位结合，就包含在本发明的抗mct5抗体中。此处所谓的“表位”是指：上述杂交瘤所产生的单克隆抗体所识别的表位(还可以是mct5的氨基酸序列中的、除了第196位至第299位的氨基酸残基之外的这些区域的一部分。)。进而，也可以是mct5的区域的、除了从第38位至第87位的氨基酸残基之外的这些区域中的一部分、或者除了从第416位至第458位的氨基酸残基之外的这些区域中的一部分。

本发明的抗体可以是通过重组手段而被制备、表达的基因重组抗体或抗原结合片段。例如，本发明的抗mct5抗体可以是嵌合抗体、人源化抗体、或全人源化抗体。本发明的重组抗体可以通过重链和轻链的重组表达来制造。例如，若为小鼠-人嵌合抗体，则可以通过如下方式制备：从产生针对mct5蛋白质的抗体的小鼠细胞中分离出抗体基因，将其重链(h链)恒定区与人igg的h链恒定区基因重组，再导入至小鼠骨肉瘤细胞中。人源化抗体例如可以通过如下方式制备：将从产生相对于mct5蛋白质的抗体的小鼠细胞中分离的抗体的抗原结合位点的基因移植至源自人的抗体分子中。另外，人抗体可以通过用mct5蛋白质对将免疫系统与人进行了替换的小鼠进行免疫来制备。另外，单克隆抗体所融合的蛋白质可以通过对于与抗原结合的抗体的可变区和其它蛋白质使用现有基因重组的方法来制作。或者，可以通过使用交联剂使单克隆抗体与蛋白质交联来制作。

为了表达基因重组抗体，例如将具有编码该抗体的重链和轻链的核酸的重组表达载体导入宿主细胞中，并对导入了该载体的宿主细胞进行培养。能够从该宿主细胞的培养物中回收目标抗体。这些核酸、重组表达载体、导入了该载体的宿主细胞、使用该宿主细胞的抗体或抗原结合片段的制造方法包含在本发明中。为了获得抗体的重链和轻链的基因、并将这些核酸组入表达载体中、再导入宿主细胞中，可以采用本领域中标准的重组dna方法(sambroock等、molecularcloning,coldspringharbor,n.y.等)。

编码vh和vl的dna片段可以通过本领域中标准的重组dna方法进行进一步操作以便制成例如fab基因、scfv基因、全长抗体基因。

另外，编码vh的核酸(例如dna)通过与编码vh的dna及编码重链恒定区(ch1、ch2和ch3)的dna能表达地结合，从而可转换为全长的重链基因。源自人、小鼠等的重链恒定区的核酸序列在本领域中是公知的。

作为本发明的抗mct5抗体，优选例如：重链可变区(vh)的互补决定区(cdr)1～3的氨基酸序列包含分别由序列号7、8和9所示的氨基酸序列或由这些氨基酸序列组成；和/或、轻链可变区(vl)的互补决定区(cdr)1～3的氨基酸序列包含分别由序列号12、13和14所示的氨基酸序列或由这些氨基酸序列组成。另外，在另一个方式中，作为本发明的抗mct5抗体，优选例如：重链可变区(vh)的氨基酸序列包含由序列号6所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成(由序列号5所示的碱基序列编码)；和/或、轻链可变区(vl)的氨基酸序列包含由序列号11所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成(由序列号10所示的碱基序列编码)。

h链的v区序列dna序列(序列号5)

氨基酸序列(序列号6)

h链的cdr区vh-cdr1：fnikdyymf(46-54)(序列号7)

vh-cdr2：widpengntifdpkfqgk(69-86)(序列号8)

vh-cdr3：widpengntifdpkfqgk(118-129)(序列号9)

l链的v区序列dna序列(序列号10)

氨基酸序列(序列号11)

l链的cdr区vl-cdr1：sqhstyt(45-51)(序列号12)

vl-cdr2：elkdgshst(68-77)(序列号13)

vl-cdr3：(114-120)(序列号14)

此处，编码vh和vl的核酸例如是源自小鼠的核酸，若编码重链和轻链恒定区的核酸使用源自人的核酸，则可以获得小鼠-人嵌合的抗体或抗原结合片段。

为了表达本发明的抗体或抗原结合片段，将如上所述得到的部分或全长的重链基因和轻链基因插入表达载体中。将重链基因和轻链基因插入单独的载体中或者将两个基因均插入相同的表达载体中。可以利用标准的方法将抗体基因插入表达载体内。另外，表达载体还能够对促进宿主细胞分泌抗体链的信号肽进行编码。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽，还可以是不同种类的信号肽。另外，表达载体可以含有其它调节序列，本领域技术人员可以基于公知的技术选择调节序列并导入至表达载体中。

抗mct5抗体的表位

本发明的抗mct5抗体的表位(抗原决定簇)只要是作为抗原的mct5的至少一部分即可没有限定，但优选mct5的胞外区的至少一部分，优选为例如：序列号2所示的mct5的氨基酸序列中的、由第196位～第299位的氨基酸组成的区域(序列号15)的至少一部分。其中，更优选由第227位～第258位的氨基酸组成的区域(序列号16)的至少一部分，特别优选为由第251位～第258位的氨基酸(序列号4)组成的区域的至少一部分。识别该区域的(与该区域结合)抗mct5抗体、例如生物体试样中的mct5的检测灵敏度高、在后述的检测和诊断癌症的用途中极其有用。

icd4(序列号15)

icd4_227-258(序列号16)

另外，mct5中由于mrna的剪接差异而存在6种亚型。具体而言，为人mct5的情况下存在如下亚型：(i)是mct5的代表性序列、具有最长的氨基酸序列的同种型1(序列号2)；(ii)从同种型1的第74位至第121位的氨基酸缺失的肽(同种型2)；(iii)从同种型1的n末端至第62位的氨基酸缺失、且具有与从同种型1的第63位至第73位的氨基酸序列(序列号17)不同的氨基酸序列(序列号18)的肽(同种型3)；(iv)从同种型1的n末端至第110位的氨基酸缺失、且具有与从同种型1的第111位至第120位的氨基酸序列不同的序列(序列号19)、及具有从第446位至c末端的氨基酸序列与同种型1(序列号2)不同的序列(序列号20)的肽(同种型4)；(v)从同种型1的第176位至第343位的氨基酸序列缺失的肽(同种型5)；(vi)具有从同种型1的n末端至第62位的氨基酸缺失、与从同种型1的第63位至第73位的氨基酸序列(序列号17)不同的氨基酸序列(序列号18)、且从同种型1的第176位至343位缺失的肽(同种型6)等。

这些肽中的同种型2、同种型3和同种型4这3种，在由序列号2所示的mct5的同种型1的氨基酸序列中的、由第196位～第299位的氨基酸组成的区域中，与mct5的同种型1共通。因此，本发明的抗体还能够检测出除同种型1以外的这3种同种型。

另外，使用包含序列号17的抗原制作的抗体除了同种型1之外还能够检测出同种型2和同种型5。进而，使用序列号19制作的抗体还能够检测出同种型3、同种型4和同种型6。

另外，本发明的抗mct5抗体的表位(抗原决定簇)中包含源自其它动物的相当于mct5中的上述区域的区域的至少一部分。

本发明的针对mct5的抗体中包含与该抗体所结合的部位(例如表位)结合的抗体、例如与本发明的杂交瘤所产生的抗体所结合的部位结合的抗体。

从同种型1的第63位至第73位的氨基酸序列(序列号17)

与同种型3和同种型6所具有的序列号17不同的序列(序列号18)

同种型4所具有的、与从同种型1的第111位至第120位不同的氨基酸序列(序列号19)

同种型4所具有的、与从同种型1的第446位至c末端不同的氨基酸序列(序列号20)

基因重组抗体的制作

作为本发明的抗体的优选的方式之一，可列举出基因重组抗体。作为基因重组抗体，没有限定，例如可列举出：嵌合抗体、人改型抗体和人源化抗体等。

嵌合抗体(即人源嵌合抗体)是通过将源自小鼠的抗体的可变区与源自人的恒定区连接(接合)而得到的抗体(参照proc.natl.acad.sci.u.s.a.81.6851-6855，(1984)等)，在制作嵌合体时，可以通过基因重组技术容易地构建以获得如此连接的抗体。

此处，作为源自小鼠抗体的可变区，重链可变区优选例如包含序列号6所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成，轻链可变区优选例如包含序列号11所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。

作为小鼠-人嵌合抗体，优选包含使重链可变区与人的恒定区结合而得到的氨基酸序列(序列号29)、包含使轻链可变区与人的恒定区结合而得到的氨基酸序列(序列号32)或由这些氨基酸序列组成。

在制作人改型抗体时，可以采用被称为所谓cdr移植(cdrgrafting)的方法。cdr移植是指将互补决定区(cdr)从小鼠抗体的可变区移植至人可变区中，框架区域(fr)源自人且cdr源自小鼠而构成的、制作经重构的可变区方法。接着，使这些经人源化的重构人可变区与人恒定区连接。这样的人改型抗体的制作法在本领域中是公知的(参照nature，321，522-525(1986)；j.mol.biol.，196，901-917(1987)；queencetal.，proc.natl.acad.sci.usa，86：10029-10033(1989)；专利第2828340号公报等)。此处，作为能用于本发明的人改型抗mct5抗体的源自小鼠的cdr的氨基酸序列，没有特别限定，例如，作为重链可变区的cdr1～3优选分别为由序列号7、8和9所示的氨基酸序列，作为轻链可变区的cdr1～3优选分别为由序列号12、13和14所示的氨基酸序列。

对于人抗体(全人源化抗体)，通常作为可变区(v区)的抗原结合部位的超可变区(hypervariableregion)、v区的其它部分和恒定区的结构具有与人的抗体相同的结构。制作人抗体的技术也是公知的，对于与人共通的基因序列已确立通过基因工程方法来制作的方法。人抗体例如可以通过如下方法获得：使用了具有包含人抗体的重链(h链)和轻链(l链)的基因的人染色体片段的人抗体产生小鼠的方法(参照tomizuka，k.etal.，naturegenetics，(1977)16，133-143；kuroiwa，y.et.al.，nuc.acidsres.，(1998)26，3447-3448；yoshida，h.et.al.，animalcelltechnology：basicandappliedaspects，(1999)10，69-73(kitagawa，y.，matuda，t.andiijima，s.eds.)，kluweracademicpublishers；tomizuka，k.et.al.，proc.natl.acad.sci.usa，(2000)97，722-727等)；获得通过人抗体文库挑选的来源于噬菌体展示的人抗体的方法(参照wormstone，i.m.et.al，investigativeophthalmology&visualscience.，(2002)43(7)，2301-8；carmen，s.et.al.，briefingsinfunctionalgenomicsandproteomics，(2002)1(2)，189-203；siriwardena，d.et.al.，opthalmology，(2002)109(3)，427-431等)。

另外，本发明中可以将杂交瘤或从该杂交瘤中提取的dna或rna等作为原料，依据上述公知的方法来制作嵌合抗体、人改型抗体、人源化抗体。

进而，本发明的抗体所融合的蛋白质可以通过使用公知的基因重组方法使用抗体的可变区和其它蛋白质来制作。另外，该融合蛋白质可以通过使用交联剂使单克隆抗体和其它蛋白质交联来制作。

抗体片段的制作

本发明中使用的针对mct5的抗体的片段与mct5特异地结合。

抗体的片段是指本发明的抗体的一部分区域，例如可列举出：fab、fab′、f(ab′)2、fv、diabody(双抗体)、dsfv、scfv(单链fv)等。上述抗体片段可以根据目的用各种蛋白质分解酶切断本发明的抗体而得到。

例如，分别地，fab通过用木瓜蛋白酶对抗体分子进行处理而得到，f(ab′)2通过用胃蛋白酶对抗体分子进行处理而得到。另外，fab′通过将上述f(ab′)2的铰链区域的二硫键切断而得到。

为scfv的情况下，获得对抗体的重链可变区(h链v区)和轻链可变区(l链v区)进行编码的cdna，从而构建编码scfv的dna。通过将该dna插入表达载体中，将该表达载体导入宿主生物中并使之表达，从而能够制造scfv。

为双抗体(diabody)的情况下，获得对抗体的h链v区和l链v区进行编码的cdna，以肽接头的氨基酸序列的长度为8残基以下的方式构筑编码scfv的dna。通过将该dna插入表达载体中，再将该表达载体导入宿主生物中并使之表达，从而能够制造双抗体(diabody)。

为dsfv的情况下，获得对抗体的h链v区和l链v区进行编码的cdna，构建对dsfv进行编码的dna。将该dna插入表达载体中，再将该表达载体导入宿主生物中并使之表达，从而能够制造dsfv。

本发明中，作为编码重链可变区的dna的碱基序列，例如可列举出包含序列号5所示的碱基序列或由该碱基序列组成，作为对轻链可变区进行编码的dna的碱基序列，例如可列举出包含序列号10所示的碱基序列或由该碱基序列组成。

另外，作为本发明的抗体片段的具体例子，没有特别限定，例如可列举出：作为vhcdr1～3的氨基酸序列分别包含序列号7、8和9所示的氨基酸序列、且/或作为vlcdr1～3的氨基酸序列分别包含序列号12、13和14所示的氨基酸序列的抗体片段。进而可列举出：作为vh包含序列号6所示的氨基酸序列、且/或作为vl包含序列号11所示的氨基酸序列的抗体片段。

包含cdr的抗体片段(肽)包含vh或vl的cdr(cdr1～3)的至少1个区域以上而构成。包含多个cdr的抗体片段可以直接或介由适当的肽接头而结合。包含cdr的抗体片段可以通过如下方式制造：构建对抗体的vh和vl的cdr进行编码的dna，将该dna插入原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，将该表达载体导入原核生物或真核生物中并使之表达。另外，包含cdr的肽还可以利用fmoc法(芴甲氧羰基法)和tboc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法来制造。

作为对vh的cdr1～3进行编码的碱基序列，优选例如分别由序列号21、22和23所示的碱基序列，作为对vl的cdr1～3进行编码的碱基序列，优选例如分别由序列号24、25和26所示的碱基序列。

vh-cdr1碱基序列(序列号21)

vh-cdr2碱基序列(序列号22)

vh-cdr3碱基序列(序列号23)

vl-cdr1碱基序列(序列号24)

vl-cdr2碱基序列(序列号25)

vl-cdr3碱基序列(序列号26)

imi4c4a抗体的小鼠-人嵌合抗体的h链碱基序列(序列号27)

imi4c4a抗体的小鼠-人嵌合抗体的h链氨基酸序列(序列号28)

imi4c4a抗体的小鼠-人嵌合抗体的l链碱基序列(序列号29)

imi4c4a抗体的小鼠-人嵌合抗体的l链氨基酸序列(序列号30)

结合亲和性

结合亲和性可以由结合常数(ka)和解离常数(kd)来确定。亲和性平衡常数(k)由ka/kd之比表示。该结合亲和性可以如下方式进行检测。

结合亲和性至少具有1×10^-10m的解离常数(kd)，且具有比该解离常数高例如2～5倍、5～10倍、10～100倍、100～1000倍或1000～10000倍的亲和性。具体而言，本发明的抗体的有关mct5的结合亲和性的解离常数(kd)为1×10^-10m、5×10^-11m、1×10^-11m、5×10^-12m、1×10^-12m、5×10^-13m、1×10^-13m、5×10^-14m、1×10^-14m、5×10^-15m或1×10^-15m，更优选为1×10^-10m～1×10^-13m。或者可以是低于这些kd的值且为高亲和性。

此处，成为亲和性的测定对象的抗体的解离常数(kd)在本发明的抗体的kd的约1～100倍以内时，该抗体与本发明的抗体实质上相同地包括在本发明中。

结合常数(ka)和解离常数(kd)可以使用表面等离子共振(spr)进行测定，可以实时地检测结合率，进而可以采用进行监视的公知的设备和方法(例如biacore(注册商标)t200(gehealthcare公司)、proteonxpr36(bio-rad公司)等)。

癌症的治疗用试剂(抗癌剂)

作为用于表达本发明的重组抗体的优选的哺乳动物细胞，可列举出中国仓鼠卵巢细胞(cho细胞)、cos细胞、293细胞、hela细胞、3t3细胞等。利用公知的基因导入方法将对抗体重链和轻链进行编码的重组表达载体导入优选的宿主细胞中。培养得到的转化体，从培养物中回收目标抗体或抗原结合片段。还可以利用公知的纯化技术来纯化抗体或抗原结合片段。

在本发明的另一个方式中，本发明的抗mct5抗体为嵌合抗体。“嵌合抗体”是指重链恒定区和轻链恒定区源自人的抗体、重链可变区和轻链可变区源自除人之外(例如小鼠)的抗体。本说明书中，有时也将恒定区源自人、可变区源自小鼠的抗体或抗原结合片段称为人-小鼠嵌合抗体或抗原结合片段。

本发明的抗体偶联物

在本发明的另一个方式中，本发明的单克隆抗体(包括其抗原结合片段)可以与至少1种化疗剂(包括抗癌剂)、毒素或放射性同位素结合而形成复合物，这样的复合物(也称为本发明的抗体偶联物)也包括在本发明的范围中。

例如，在本发明的另一个方式中，可提供一种抗体偶联物，其是包括本发明的单克隆抗体和放射性同位素的抗体偶联物，本发明的单克隆抗体与能够检测的放射性同位素形成了偶联物。能够检测的放射性同位素例如为³h、¹⁴c、³⁵s、⁹⁰y、⁹⁹tc、¹¹¹in、¹²⁵i、¹³¹i、¹⁷⁷lu、¹⁶⁶ho或¹⁵³sm。

例如，在本发明的另一个方式中，可提供一种抗体偶联物，其是包含本发明的单克隆抗体和抗癌剂或毒素的抗体偶联物，本发明的单克隆抗体与抗癌剂或毒素形成了复合物。前述化疗剂优选为抗癌剂。另外，毒素优选为皂苷、dm1(n2′-脱乙酰基-n2′-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素)、dm4(n2′-脱乙酰基-n2′-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素)、mmae(甲基澳瑞他汀e)、sn38。

实施癌症的化学疗法时的化疗剂的作用机理没有限定，“化疗剂”是在癌症治疗中有用的化学化合物。化疗剂的种类没有特别限定，包括：烷基化剂(alkylatingagent)、抗代谢剂、纺锤体抑制剂植物生物碱、细胞毒性/抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、抗体、光敏剂和激酶抑制药。化疗剂包括用于“导向疗法”和用于现有的化学疗法的化合物。化疗剂的例子中包括：埃罗替尼(erlotinib)(tarceva(注册商标)，genentech/osipharm.)、多西他赛(docetaxel)(taxotere(注册商标)，sanofi-aventis)、5-fu(氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、cas号51-21-8)、吉西他滨(gemcitabine)(gemzar(注册商标)，lilly)、pd-0325901(cas号391210-10-9，pfizer)、顺氯氨铂(cisplatin)(顺-二胺、二氯铂(ii)、cas号15，663-27-1)、卡铂(carboplatin)(cas号41575-94-4)、紫杉醇(paclitaxel)(taxol(注册商标)，bristol-myerssquibboncology，princeton，n.j.)、曲妥单抗(trastuzumab)(herceptin(注册商标)，genentech)、替莫唑胺(4-甲基-5-氧代-2,3,4,6,8-五氮杂二环式[4.3.0]壬-2,7,9-三烯-9-羧基酰胺、cas号85622-93-1，temodar(注册商标)，temodal(注册商标)，scheringplough)、他莫昔芬(tamoxifen)((z)-2-[4-(1，2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-n,n-二甲基-乙酰胺，nolvadex(注册商标)，istubal(注册商标)，valodex(注册商标))和阿霉素(doxorubicin)(adriamycin(注册商标))、akti-1/2、hppd和纳巴霉素(rapamycin)。

化疗剂的其它例子中包括：沙利铂(oxaliplatin)(eloxatin(注册商标)，sanofi)、硼替佐米(bortezomib)(velcade(注册商标)，millenniumpharm.)、舒尼替尼(sutent)(sunitinib(注册商标)，su11248，pfizer)、来曲唑(letrozole)(femara(注册商标)，novartis)、甲磺酸伊马替尼(imatinibmesylate)(gleevec(注册商标)，novartis)、xl-518(mek抑制剂，exelixis，国际公开2007/044515)、arry-886(mek抑制剂，azd6244，arraybiopharma，astrazeneca)、sf-1126(pi3k抑制剂，semaforepharmaceuticals)、bez-235(pi3k抑制剂，novartis)、xl-147(pi3k抑制剂，exelixis)、ptk787/zk222584(novartis)、氟维司群(fulvestrant)(faslodex(注册商标)，astrazeneca)、leucovorin(亚叶酸)、纳巴霉素(rapamycin)(西罗莫司(sirolimus)，rapamune(注册商标)，wyeth)、拉帕替尼(lapatinib)(tykerb(注册商标)，gsk572016，glaxosmithkline)、洛那法尼(lonafarnib)(sarasartm，sch66336，scheringplough)、索拉非尼(sorafenib)(nexavar(注册商标)，bay43-9006，bayerlabs)、吉非替尼(gefitinib)(iressa(注册商标)，astrazeneca)、依立替康(irinotecan)(camptosar(注册商标)，cpt-11，pfizer)、替吡法尼(tipifarnib)(zarnestratm，johnson&johnson)、abraxanetm(没有克列莫佛(cremophor-free))、紫杉醇(paclitaxel)的白蛋白-变更纳米颗粒制剂(americanpharmaceuticalpartners，schaumberg，i1)、凡德他尼(vandetanib)(rinn，zd6474，zactima(注册商标)，astrazeneca)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、ag1478、ag1571(su5271；sugen)、西罗莫司(temsirolimus)(sirolimus)(torisel(注册商标)，wyeth)、帕唑帕尼(pazopanib)(glaxosmithkline)、莰佛胺(canfosfamide)(telcyta(注册商标)，telik)、塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)(cytoxan(注册商标)、neosar(注册商标))；白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)之类的磺酸烷基酯类；苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)之类的氮丙啶类；包含六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine)的亚乙基亚胺类和methylamelamine类；番荔素(acetogenins)(特别是布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包含合成类似物托泊替康(topotecan))；苔藓虫素(bryostatin)；卡利他汀(callystatin)；cc-1065(包含阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)的合成类似物)；隐霉素(cryptophycin)(特别是cryptophycin1和cryptophycin8)；多拉司他汀(dolastatin)；多米卡新(duocarmycin)(包含合成类似物kw-2189和cbi-tm1)；软珊瑚醇(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；沙霉素(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、环磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、氮芥盐酸盐、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、苯丁酸氮芥酯(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracilmustard)等氮芥(nitrogenmustard)；亚硝基脲(nitrosureas)、例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；烯二炔(enediyne)抗生素等抗生素(例如包括：卡奇霉素(calicheamicin)、卡奇霉素γ1i和卡奇霉素ωi1、例如参照agnewchemintl.ed.engl.，33：183-186(1994)；达内霉素(dynemicin)、达内霉素a(dynemicina)；氯膦酸盐(clodronate)等的双膦酸盐(bisphosphonates)；埃斯培拉霉素(esperamicin)；同样地新制癌菌素发光团和相关色素蛋白烯二炔(enediyne)抗生素发光团)、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素a(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博来霉素(bleomycins)、放线菌素c(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、色霉素、放线菌素d(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二偶氮-5-氧代-l-正亮氨酸、吗啉代-阿霉素、氰基吗啉代-阿霉素、2-吡咯啉基-阿霉素和脱氧阿霉素、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素c等的丝裂霉素(mitomycins)、菌酚酸(mycophenolicacid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、派来霉素(peplomycin)、泼非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、奎那霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-fu)之类的抗-代谢产物；二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蝶罗呤(pteropterin)、曲麦克特(trimetrexate)之类的叶酸类似物；氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)之类的嘌呤类似物；盐酸环胞苷、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofours)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)之类的嘧啶类似物；卡普睾酮(calusterone)、2-甲氧睾酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内脂(testolactone)之类的雄激素类；氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotan)、腈环氧雄烷(trilostan)之类的抗肾上腺剂；亚叶酸(frolinicacid)之类的叶酸补充物(replenisher)；乙酰葡醛酯；醒磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；阿莫司汀(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依利醋铵(elfornithine)；醋酸羟吡咔唑(elliptiniumacetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)之类的美登木素生物碱(maytansinoid)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；psk(注册商标)多糖类复合物(jhsnaturalproducts，eugene，or)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2′,2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素类(trichothecenes)(t-2毒素、粘液霉素a(verracurina)、漆斑菌素a(roridina)和蛇形菌素(anguidine))；氨基甲酸酯；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿糖胞苷(阿糖胞苷)(“ara-c”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤(methotrexate)；顺氯氨铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)之类的铂类似物；长春碱(vinblastine)；依托泊苷(etoposide)(vp-16)；米托葱醌(mitoxanthone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)(navelbine(注册商标))；诺维本(navelbine)；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；卡培他滨(capecitabine)(xeloda(注册商标)，roche)；伊本膦酸盐(ibandronate)；cpt-11；拓扑异构酶抑制剂rfs2000；依氟鸟氨酸(dmfo)；视黄酸等的类视色素类；以及上述化疗剂在药学上可接受的盐类、酸类和衍生物。

另外，“化疗剂”的定义中包括：(i)用于调节或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂、抗雌激素和选择性雌激素受体调节器(serm)等，例如他莫昔芬(tamoxifen)(nolvadex(注册商标)他莫昔芬(tamoxifen)柠檬酸盐)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、盐酸雷洛昔芬(keoxifene)、ly117018、奥那司酮(onapristone)和fareston(注册商标)(枸橼酸托瑞米芬)；(ii)抑制芳香化酶的芳香化酶抑制物质，它们调节肾上腺中的雌激素产生，例如4(5)-咪唑类、氨鲁米特(aminoglutethimide)、megase(注册商标)(甲地孕酮)、aromasin(注册商标)(依西美坦，pfizer)、福美坦(formestanie)、法倔唑、rivisor(注册商标)(伏罗唑(vorozole))、femara(注册商标)(来曲唑(letrozole)，novartis)和arimidex(注册商标)(阿那曲唑，astrazeneca)；(iii)抗雄激素、例如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮脯利特(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；(iv)蛋白激酶抑制剂，例如mek抑制剂(国际公开2007/044515)；(v)脂质激酶抑制剂；(vi)反义寡核苷酸，特别是抑制有关非贴壁细胞增殖的信号传递通路的基因表达的、例如pkc-α、raf和h-ras、奥利默森(oblimersen)(genasense(注册商标)，gentainc.)；(vii)核酶,例如vegf表达抑制剂(例如angiozyme(注册商标))和her2表达抑制剂；(viii)基因治疗疫苗、例如allovectin(注册商标)、leuvectin(注册商标)和vaxid(注册商标)等的疫苗；proleukin(注册商标)ril-2；lurtotecan(注册商标)等的拓扑异构酶1抑制剂；abarelix(注册商标)rmrh；(ix)贝伐珠单抗(avastin(注册商标)，genentech)等的抗血管形成剂；以及上述化疗剂在药上可接受的盐类、酸类或衍生物。另外，“化疗剂”的定义中作为治疗的抗体的例子，包括：阿仑单抗(alemtuzumab)(campath)、贝伐珠单抗(阿瓦斯汀(注册商标)，genentech)；西妥昔单抗(cetuximab)(erbitux(注册商标)，imclone)；帕尼单抗(panitumumab)(vectibix(注册商标)，amgen)、利妥昔单抗(rituximab)(rituxan(注册商标)，genentech/biogenidec)、帕妥珠单抗(pertuzumab)(omnitargtm，2c4，genentech)、曲妥单抗(trastuzumab)(herceptin(注册商标)，genentech)、托西莫单抗(tositumomab)(bexxar，corixia)、及抗体-药物偶联物、吉妥单抗(mylotarg(注册商标)，wyeth)。

具有mct5单克隆抗体或与其组合的化疗剂的治疗作用的人源化单克隆抗体中包括：阿仑单抗(alemtuzumab)、阿泊珠单抗(apolizumab)、阿塞珠单抗(aselizumab)、托珠单抗(atlizumab)、巴匹珠单抗(bapineuzumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、比伐珠单抗(bivatuzumabmaytansine)、莫坎妥珠单抗(cantuzumabmaytansine)、西利珠单抗(cedelizumab)、赛妥珠单抗(certolizumabpegol)、西弗斯妥珠单抗(cidfusituzumab)、西杜妥珠单抗(cidtuzumab)、达克珠单抗(daclizumab)、依库丽单抗(eculizumab)、依法利珠单抗(efalizumab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、依库珠单抗(eculizumab)、非维珠单抗(felvizumab)、芳妥珠单抗(fontolizumab)、雷珠单抗(gemtuzumabozogamicin)、吉妥单抗(innotuzumabozogamicin)、伊匹单抗(ipilimumab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、莫维珠单抗(motavizumab)、莫妥维珠单抗(motovizumab)、那他珠单抗(natalizumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、诺洛维珠单抗(nolovizumab)、努马维珠单抗(numavizumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕考珠单抗(pascolizumab)、帕氟珠单抗(pecfusituzumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、培克珠单抗(pexelizumab)、若利珠单抗(ralivizumab)、雷珠单抗(ranibizumab)、热利维珠单抗(reslivizumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、热西维珠单抗(resyvizumab)、罗维珠单抗(rovelizumab)、鲁利单抗(ruplizumab)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、希普利珠单抗(siplizumab)、索土珠单抗(sontuzumab)、他珠单抗(tacatuzumabtetraxetan)、他度珠单抗(tadocizumab)、他利珠单抗(talizumab)、特非珠单抗(tefibazumab)、托珠单抗(tocilizumab)、托利珠单抗(toralizumab)、曲妥单抗(trastuzumab)、西莫白介素单抗(tucotuzumabcelmoleukin)、图库斯珠单抗(tucusituzumab)、乌玛珠单抗(umavizumab)、乌珠单抗(urtoxazumab)和维西珠单抗(visilizumab)。

“代谢产物”是特定的化合物或盐通过体内的代谢而产生的产物。化合物的代谢产物可以使用在本领域中公知的惯用技术来鉴定，它们的活性还可以使用本说明书中记载的内容等的试验来确定。这样的产物例如可以由所给予的化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、酰胺分解、酯化、酯分解、酶的切断等而生成。因此，本发明包括本发明的化合物的代谢产物，该代谢产物包含通过如下方法产生的化合物，所述方法中包括：为了得到代谢产物使本发明的化合物与哺乳动物接触充分的时间。

本发明的单克隆抗能与化疗剂(包括抗癌剂)、毒素或放射性同位素直接或间接地缀合(conjugation)。间接地结合包括通过接头的结合、介由与本发明的单克隆抗体结合的抗体或抗体片段的结合。本发明还包括例如：用荧光标记等标记物质连接的抗体与本发明的单克隆抗体结合所形成的抗体偶联物。

进而，本发明的单克隆抗体优选的是，包含针对例如自然杀伤细胞(nk细胞)、巨噬细胞等具有杀肿瘤活性或肿瘤抑制活性的效应细胞的特异性的抗原结合区域。

此处，“杀肿瘤活性”是指使肿瘤细胞破坏或灭亡的活性，“肿瘤抑制活性”是指使肿瘤细胞的数量减少的活性或抑制肿瘤细胞的增殖速度的活性。

当包含针对效应细胞的特异性抗原结合区域的本发明的单克隆抗体与癌细胞结合时，效应细胞与该抗体结合，可以通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(adcc、antibody-dependentcellularcytotoxicity)作用而使癌细胞灭亡。

同样地包含这样的区域的本发明的单克隆抗体与癌细胞结合时，激活补体系统，可以通过cdc(complement-dependentcytotoxicity：补体依赖性细胞毒性)作用而使癌细胞灭亡。

本发明的药物组合物

本发明中，可提供包含本发明的抗mct5抗体(包括抗原结合片段)的药物组合物。本发明的抗mct5抗体识别在癌细胞中表达的mct5。包含本发明的抗mct5抗体的本发明的药物组合物可以用于杀伤表达mct5的癌细胞。即，本发明的药物组合物作为癌症治疗用药物组合物、优选作为大肠癌症治疗用药物组合物是有用的。另外，本发明的药物组合物可以用作癌症治疗剂。

本发明的单克隆抗体还可以与化疗剂、毒素或放射性同位素结合。因此，在本发明的另一个方式中，可提供包含本发明的抗体偶联物的药物组合物。

本发明的单克隆抗体识别在癌细胞中表达的mct5，因此包含本发明的单克隆抗体(包括抗体偶联物)的本发明的药物组合物作为癌症治疗用药物组合物、优选作为大肠癌症治疗用药物组合物是有用的。

另外，本发明的药物组合物还可以用作癌症治疗剂。本发明的癌症治疗剂中包括单独的抗mct5抗体、或根据需要使药学上可接受的抗癌剂、载体与适宜抗mct5抗体结合而成的物质。或者本发明的癌症治疗剂可以与其它治疗样式进行组合使用。

另外，本发明的单克隆抗体识别在癌细胞中表达的mct5，并且在与细胞膜上的mct5结合后，通过内在化(internalization)机制而被摄入细胞内。因此，本发明的药物组合物可以用于杀死表达mct5的癌细胞。特别是在包含含有化疗剂和本发明的单克隆抗体的抗体偶联物的情况下，与抗体结合的化疗剂也能被摄入癌细胞中，因此本发明的药物组合物可以用于杀死癌患者的癌细胞。

本发明中，癌的治疗中包括：杀伤癌细胞、癌症的尺寸减小、抑制癌症的增殖速度或使其停止、或者抑制癌症的发展或使其停止等。

本发明的药物组合物可以是组合本发明的抗体及化疗剂、毒素或放射性同位素的药物组合物。作为组合使用的抗癌剂，可以使用与本发明的药物组合物中包含的化疗剂相同的物质，或者还可以使用不同的化疗剂。对于抗癌剂的给药量和给药方法，本领域技术人员可以进行适宜设定。

本发明的药物组合物的治疗对象的癌症种类没有特别限定，只要表达mct5即可，例如可列举出：恶性黑色素瘤、恶性淋巴瘤、消化系统癌、肺癌、食道癌、胃癌、大肠癌、直肠癌、结肠癌、输尿管肿瘤、胆囊癌、胆管癌、胆道癌、乳腺癌、肝癌(livercancer)、胰腺癌、睾丸肿瘤、上顎癌、舌癌、口唇癌、口腔癌、咽癌、喉癌、肾癌、卵巢癌、子宫癌、前列腺癌、甲状腺癌、脑肿瘤、卡波西肉瘤、血管瘤、白血病、真性红细胞增多症、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、骨肉瘤、膀胱瘤、肉瘤、骨肉瘤、肌肉瘤、皮肤癌、基底细胞瘤、皮肤附件肿瘤、皮肤转移癌、皮肤黑色素瘤等。优选为大肠癌、胃癌、膀胱癌、肾癌、子宫癌、乳腺癌、进一步优选为大肠癌、乳腺癌、子宫癌。

本发明的药物组合物的给药方法可列举出：口服给药、非口服给药(例如，皮下给药、皮内给药、粘膜给药、直肠内给药、阴道内给药、对患部局部给药、皮肤给药等)或对患部直接给药等。

本发明的药物组合物的给药量通常考量到给药对象(患者)的年龄、体重、疾病的种类/发展状况、给药途径、给药次数、给药期间等而可以进行适宜设定。

本发明的药物组合物的给药量通常在考虑制剂中的有效成分的配混比例后，考量给药对象(患者)的年龄、体重、疾病种类/发展状况、给药途径、给药次数、给药期间等而可以进行适宜设定。作为有效成分，可列举出与本发明的单克隆抗体结合的化疗剂、毒素或放射性同位素等。

以下对使用本发明的药物组合物作为非口服制剂的情况进行具体地说明。

在作为非口服制剂使用的情况下，通常其形态不受限定，例如可以是静脉内注射剂(包括点滴)、肌肉内注射剂、腹腔内注射剂、皮下注射剂、栓剂等中的任一种。

在为各种注射剂的情况下，可以以例如单位给药量安瓿或多给药量容器的状态、在使用时再溶解于溶解液中的冷冻干燥粉末的状态提供。该非口服制剂中除了前述的活性成分(本发明的抗mct5抗体或其抗原结合片段)之外，根据各种形态可以在不损害上述活性成分的效果的范围内含有公知的各种赋形剂、添加剂。例如，在为各种注射剂的情况下，可列举出水、甘油、丙二醇、聚乙二醇等脂肪族多元醇等。

非口服制剂的给药量(每1天)不受限定，例如若为各种注射剂，则通常前述的活性成分优选使用对象(患者)的体重每1kg为1mg～15mg/天、更优选为2～12mg/天。

在作为口服制剂使用的情况下，通常其形态没有限定，例如可以是片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂、含片(troche)、内用水剂、悬浮剂、乳剂、糖浆剂等中的任一种，还可以制成在使用时进行再溶解的干燥产物。

本发明的药物组合物可以根据需要配混药学上可接受的添加剂。作为药学上可接受的添加剂的具体例子，可列举出：抗氧化剂、贮存剂、着色剂、风味料和稀释剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、填料、增量剂、缓冲剂、转运载体、稀释剂、载体、赋形剂和/或药物佐剂等，但不限定于这些。

本发明提供包含用于治疗癌症例如大肠癌的本发明的抗mct5抗体的试剂盒。本发明的试剂盒只要包含本发明的抗mct5抗体，构成其的材料就没有特别限定。除了本发明的抗mct5抗体之外具备水、缓冲液、容器、注射器、操作说明书等即可。本发明的抗mct5抗体可以以水溶液、冷冻干燥状态等来提供，在使用前制成适宜的状态。通过使用本发明的试剂盒而能够有效地治疗癌症。

另外，本发明还提供癌症的治疗方法，其包括向对象(例如，人)给予本发明的抗mct5抗体。另外，本发明还提供用于治疗癌症的本发明的抗mct5抗体。抗mct5抗体的给药量、给药方法等可以参照本发明的药物组合物的记载。

本发明还提供癌症的治疗方法，其包括向对象给予本发明的单克隆抗体。在本发明的治疗方法中，本发明的单克隆抗体还可以与化疗剂、毒素或放射性同位素形成偶联物。即，本发明的治疗方法可以包括向对象给予本发明的抗体偶联物。另外，在本发明的癌症治疗方法中，还可以进一步组合使用抗癌剂。

本发明的药物组合物的给药量通常可以考量给药对象(患者)的年龄、体重、疾病的种类/发展状况、给药途径、给药次数、给药期间等而进行适宜设定。

以下对使用本发明的药物组合物作为非口服制剂的情况进行具体地说明。

在作为非口服制剂使用的情况下，通常其形态没有限定，例如可以是静脉内注射剂(包括点滴)、肌肉内注射剂、腹腔内注射剂、皮下注射剂、栓剂等中的任一种。

在各种注射剂的情况下，可以以例如单位给药量安瓿或多给药量容器的状态、在使用时再溶解于溶解液中的冷冻干燥粉末的状态提供。该非口服制剂中除了前述的活性成分(本发明的抗mct5抗体或其抗原结合片段)之外，根据各种形态可以在不损害上述活性成分的效果的范围内含有公知的各种赋形剂、添加剂。例如，在各种注射剂的情况下，可列举出水、甘油、丙二醇、聚乙二醇等脂肪族多元醇等。

非口服制剂的给药量(每1天)不受限定，例如若为各种注射剂，则通常前述的活性成分优选使用对象(患者)的体重每1kg为1mg～15mg/天、更优选为2～12mg/天。

在作为口服制剂使用的情况下，通常其形态没有限定，例如可以是片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂、含片、内用水剂、悬浮剂、乳剂、糖浆剂等中的任一种，还可以制成在使用时进行再溶解的干燥产物。

实施例

以下利用实施例对本发明进行进一步具体地说明。但是，本发明不限定于这些实施例。

实施例1

(1)细胞

hct116由dspharma获得，mda-mb231由美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection)(atcc保藏号htb-26)获得。mcf7细胞中过量表达mct5的细胞使用日本特愿2014-203162公报中记载的细胞。

(2)单克隆抗体

(i)抗体产生细胞的收集

作为与mct5结合的单克隆抗体的克隆编号imi4c4a可以通过单独给予mct5其自身或部分肽、或者与载体和稀释剂一起给药于哺乳动物来获得免疫。例如可以使用由mct5的第196位～第299位的氨基酸组成的区域(序列号32)。以下将该区域称为“icd4”。每1只动物的抗原的给药量、所用的佐剂的种类、免疫方法、免疫的间隔与多克隆抗体的制作相同。从最终的免疫日起1～30天后，优选2～5天后选择可确认到抗体效价的个体并采集抗体产生细胞。作为抗体产生细胞，可列举脾细胞、淋巴细胞、末梢血细胞等，优选脾细胞或淋巴细胞。

icd4的氨基酸序列(序列号32)

icd4的碱基序列(序列号31)

(ii)细胞融合

为了得到杂交瘤，进行抗体产生细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合。融合操作可以按照已知的方法、例如kohler等的方法来实施。作为与抗体产生细胞融合的骨髓瘤细胞，可以使用小鼠等动物的能够常规获得的细胞株化细胞。作为所使用的细胞株，优选具有药剂选择性且具有在未融合的状态下在hat选择培养基(含有次黄嘌呤、氨基喋呤、胸苷)中不能生存、仅在与抗体产生细胞融合的状态下能生存的性质的细胞株。作为骨髓瘤细胞，可列举例如：p3-x63-ag8u.1、sp2/o-ag14、pai、p3u1、nsi/1-ag4-1、nso/1等小鼠骨髓瘤细胞株、yb2/0等大鼠骨髓瘤细胞株等。

对于上述骨髓瘤细胞与抗体产生细胞的细胞融合，可以在不含血清的dmem、rpmi-1640培养基等动物细胞培养用培养基中将1×10⁸～5×10⁸个抗体产生细胞与2×10⁷～10×10⁷个骨髓瘤细胞混合(抗体产生细胞与骨髓瘤细胞的细胞比为10：1～1：1)，在细胞融合促进剂存在下进行融合反应。作为细胞融合促进剂，可以使用平均分子量为1000～6000道尔顿的聚乙二醇或仙台病毒等。另外，也可以使用利用电刺激(例如电穿孔)的市售的细胞融合装置使抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合。

(iii)杂交瘤的挑选和克隆

从细胞融合处理后的细胞中筛选作为目标的杂交瘤。作为其方法，将细胞悬浮液用例如含有10～20％的胎牛血清的rpmi-1640培养基等适当稀释后，在微量滴定板上通过有限稀释法以计算值0.3个/孔左右进行接种，向各孔中加入hat培养基等选择培养基，此后适当更换选择培养基而进行培养。其结果是，可以将用选择培养基开始培养后的10天前后生长出的细胞作为杂交瘤来得到。

然后，对生长出的杂交瘤进行进一步筛选。杂交瘤的筛选按照常规方法即可，没有特别限定。例如，可以采集培养杂交瘤的孔中所含的培养上清的一部分并利用酶免疫测定法、放射免疫测定法等进行筛选。具体而言，使抗原吸附于96孔板后，用小牛血清、脱脂乳等进行封闭。使杂交瘤细胞的培养上清与固相化的抗原在37℃反应1小时后，使过氧化物酶标记的抗小鼠igg在37℃下反应1小时，使用邻苯二胺作为底物进行显色。用酸使反应停止后，测定490nm的波长处的吸光度，从而可以进行筛选。

通过有限稀释法等，对产生利用上述测定法时显示阳性的单克隆抗体的杂交瘤进行克隆。并且最终建立了产生与mct5特异性结合的单克隆抗体的细胞、即杂交瘤。

(iv)单克隆抗体的收集

作为从所建立的杂交瘤中收集单克隆抗体的方法，可以采用常规的细胞培养法或腹水形成法等。就细胞培养法而言，将杂交瘤在含有10％胎牛血清的rpmi-1640培养基、mem培养基或无血清培养基等动物细胞培养培养基中以常规培养条件(例如37℃、5％co2浓度)培养7～14天，从其培养上清中取得抗体。在腹水形成法的情况下，向与作为骨髓瘤细胞来源的哺乳动物同种系的动物、例如小鼠(balb/c)的腹腔内给药约5×10⁶～2×10⁷个杂交瘤，使杂交瘤大量增殖。然后，在1～2周后收集腹水。在上述抗体的收集方法中，在需要纯化抗体时，可以适当选择硫酸铵盐析法、离子交换色谱、凝胶过滤、亲和色谱等公知方法或将这些组合而进行纯化。

(3)elisa

回收用pbs(-)将由小鼠的尾静脉采集的血液稀释至1/160000的样品、或回收杂交瘤已增殖的孔的培养上清，解析了抗体的效价。用pbs(-)稀释icd4，在96孔的elisa孔板(nunc公司)中以每1孔50ng的方式分注，在室温下放置1小时，使其结合至孔板表面。然后，用tbs-t(25mmtris、150mmnacl、0.05％(v/v)吐温20、ph7.4)350μl清洗3次后，各孔中分注300μl包含5％脱脂乳的pbs-t，在室温下封闭1小时。用tbs-t清洗后，在icd4结合elisa孔板中分注稀释的血液或培养上清，在室温下反应1小时。用tbs-t清洗后，将过氧化物酶(以下记为pod)标记抗小鼠免疫球蛋白抗体(bethyl公司制)稀释至10000倍后在各孔中分注100μl，在室温下反应1小时。进行同样的清洗后，加入制备成0.5mg/mlpod的opd基质，在室温下显色5分钟。用1.5n的硫酸使反应停止后，用使用酶标仪(moleculardevices公司)测定了490nm的吸收。关于以icd4作为抗原制作的单克隆抗体，将使用各杂交瘤细胞的培养上清并利用elisa进行解析的结果示于图1。这些克隆中，通过有限稀释法使细胞单克隆化，进行了以下的实验。

(4)免疫细胞染色

培养mcf7-mct5、mda-mb231和hct116细胞直至达到80％汇合，在用cellmatrixtypei-a(nittagelatininc.)涂布的玻璃底培养皿(glassbottomdish)(matsunami公司)上以1×10⁴个细胞/孔进行接种。培养1天后，向细胞添加将上述(2)中记载的imi4c4a抗体用培养基稀释至10μg/ml的溶液，在冰上反应1小时。用包含10％fbs的培养基清洗后，作为二次抗体通过抗小鼠igg多克隆抗体-alexafluor488标记或抗小鼠igg多克隆抗体-alexafluor555标记在冰上反应30分钟。用培养基清洗3次后，用pbs(-)清洗，利用荧光显微镜(bz-8000、keyencecorporation)进行解析。

图2示出用imi4c4a抗体分别对完整的细胞进行染色的结果。mcf7-mct5细胞在过量表达mct5时，也同时过量表达了egfp，因此在488nm下激发可观察到由细胞内的egfp发出的荧光。因此，mcf7-mct5细胞的情况，二次抗体使用了抗小鼠igg多克隆抗体-alexafluor555标记。在所有细胞中，显示出imi4c4a抗体与细胞表面结合。

(5)流式细胞仪解析

对作为人大肠癌细胞的hct116细胞进行培养直至达到90％汇合。将细胞用pbs(-)清洗2次后，使用accutase(lifetechnologies公司)进行回收，以4×10⁵个细胞的方式悬浮在包含1％fbs的pbs(-)100ml中。向该溶液中以最终浓度成为10mg/ml的方式添加imi4c4a抗体，在冰上反应60分钟。作为比较对象，准备了添加了不包含imi4c4a抗体的溶液的细胞。将细胞用pbs+1％pbs清洗2次后，作为二次抗体添加将抗小鼠igg多克隆抗体-alexafluor488标记稀释至1/11000倍而成的溶液，在冰上反应30分钟。用包含1％fbs的pbs清洗2次后，利用facscalibur(bd公司)进行解析。将结果示于图3。

如图3所示，imi4c4a抗体与完整的hct116细胞强烈地反应，由此确认了本发明的抗mct5抗体识别天然的结构的mct5。

实施例2

(1)内在化的解析

如上述实施例1.中所示，解析了作为抗mct5单克隆抗体的imi4c4a抗体与细胞表面上结合后，是否通过内在化被摄入细胞内。

将作为人乳腺癌细胞的sk-br3、mda-mb231和作为人大肠癌细胞的hct116细胞以1×10⁴个细胞/孔的方式接种在玻璃底培养皿上。进行1天培养后，在冰上静置15分钟使细胞冷却。去除培养基后，添加以imi4c4a抗体成为10mg/ml的方式在培养基中制备的一次抗体，在冰上反应30分钟。使用培养基清洗2次后，作为二次抗体用抗小鼠igg多克隆抗体-alexafluor488标记在冰上反应30分钟。用培养基清洗2次后，在37℃、5％co2下进行0、15、30、60、120分钟培养后，用在冰上冷却的培养基进行清洗。进而，为了对细胞内的溶酶体进行染色，添加在pbs中以成为200nm的方式制备的溶酶体荧光探针dnd-99(lifetechnologies公司)，在室温下反应1分钟后，用pbs(-)清洗2次后，使用荧光显微镜进行解析。将结果示于图4。

另一方面，使用作为抗her2单克隆抗体的曲妥珠单抗(trastuzumab)(商品名herceptin)，使用作为her2强阳性的sk-br3细胞进行了与上述同样的解析。将该结果也示于图3。此时，作为二次抗体以相同的浓度使用抗人igg多克隆抗体-alexafluor488标记。

图4表明，在sk-br3、mda-mb231、hct116任意细胞的情况下均显示出imi4c4a抗体被摄入至细胞内。

图4左图所示的曲妥珠单抗(trastuzumab)是一种已被证实抗体(绿色的荧光)被内在化的抗体。在是曲妥珠单抗的情况下，细胞表面上的抗体在细胞表面滞留30分钟，然后被摄入至细胞内之后迅速被摄入至溶酶体(红色荧光)中，因此显示出黄色的荧光。另一方面，在是imi4c4a抗体的情况下，在培养开始15分钟后观察到被摄入至细胞内，在120分钟的期间内显示出经时地继续进行，但未明确地检测出局部地分布在溶酶体中。

(2)内在化机理的解析

内在化通过细胞的内吞作用来进行。内吞作用根据摄入物质的种类、大小、相关细胞分子的差异而不同，大致分为网格蛋白依赖性内吞作用、内陷依赖性内吞作用、吞噬作用、胞饮作用。

受体那样的膜蛋白大多数通过网格蛋白依赖性内吞作用而被摄入，其解析中使用内吞作用抑制剂。

使用作为网格蛋白依赖性内吞作用的抑制剂的刀豆素a(cona)，对是否出现在上述实施例的(1)中观察到的imi4c4a抗体的内在化被抑制的情况进行了解析。

与上述(1)记载的方法同样地在玻璃底培养皿上培养的mda-mb231细胞中添加以0.5mg/ml方式混合了cona的培养基，在37℃、5％co2下进行了60分钟培养。用培养基清洗2次后，与上述方法同样地使用一次抗体、二次抗体对细胞进行染色，在0、30、60、120分钟后使用荧光显微镜进行了解析。

图5示出通过用cona进行预处理在观察期间imi4c4a抗体的内在化被抑制了。左图的0mg/ml示出不包含cona时的经时变化，右图示出包含cona时的结果。通过用cona进行预处理，在原本该将抗体输送至细胞的内部的培养时间内，抗体还滞留在细胞表面上。由该结果确认了，与细胞膜上的mct5结合的imi4c4a抗体通过网格蛋白依赖性内吞作用而被摄入。

另外，对于与用0.5mg/ml浓度的cona处理了60分钟的hct116细胞的反应性进行解析。使制成10mg/ml的imi4c4a、107、217、221、223、303、306和301抗体与细胞反应，作为二次抗体使用抗小鼠igg多克隆抗体-alexafluor488标记进行了检测。将实验结果示于图6。显示出301抗体除外的所有的抗体与hct116细胞的表面结合。

如上述实施例1的(3)记载所示，由于使用的抗体全部为与icd4结合的抗体，因此可认为301抗体是与icd4结合但不与细胞结合的抗体。

据报道，作为内在化的抗体进行了解析的曲妥珠单抗(trastuzumab)，虽然与细胞外结合的抗体内在化，但会发生迅速返回细胞外的反转(turnover)。因此，可认为如图3右图所示在0～30分钟培养的情况系无法明确地检测出内在化。另一方面，imi4c4a的情况，在15分钟培养的情况下也能明确地检测出内在化，因此判断摄入的效率极好。即，可认为低浓度的抗体-药剂偶联物也能够杀死癌细胞。

实施例3

(1)抗体的生物素化

作为imi4c4a抗体使用ez-linknhs-lc-lc-biotin(pierce公司)，按照试剂盒附带的手册进行了生物素化。准备在pbs(-)中制成1mg/ml的imi4c4a抗体，将nhs-lc-lc-biotin粉末溶解于dmso中，添加至抗体溶液中。在室温下反应30分钟后，添加1/100量的1mtris-hcl(ph7.4)，使未反应的nhs-lc-lc-biotin试剂灭活。使用amiconultra30kda(millipore公司)去除未反应的试剂，并用pbs(-)代替溶剂。

(2)使用了链霉亲和素-zap的影响

利用使抗体摄入细胞内的技术对是否能抑制癌细胞的增殖进行了解析。在培养基中添加50nm的生物素化imi4c4a、303、306和107抗体，混合15nm、30nm、50nm的链霉亲和素-zap(advancedtargetingsystems公司制，皂草素-链霉亲和素复合物)，在冰上反应1小时后，添加至前一天预先以2500个细胞/孔方式接种的mcf7-mct5细胞中。皂草素具有核糖体灭活活性，仅在摄入细胞内的情况下抑制细胞增殖。添加溶液后，在37℃、5％co2下进行3天培养，使用wst-8(roche公司)测定了细胞的增殖。将该结果示于图7。

如图7所示，在相对一定量的生物素化抗体增加链霉亲和素-zap量来添加时，imi4c4a抗体的情况显示出显著地抑制了增殖。另外，如实施例2.(2)所示，301抗体是与作为抗原的icd4结合但不与细胞结合的抗体。因此，图7中，在链霉亲和素-zap浓度上升的情况下也几乎未能抑制细胞的增殖。

根据以上结果显示出：imi4c4a抗体显示出能作为抗体-药物偶联物(antibody-drug-conjugate)用于杀死细胞。

产业上的可利用性

根据本发明，可提供与mct5的胞外区特异性结合的单克隆抗体。本发明的抗体通过与表达mct5的癌细胞特异性结合，通过向细胞内输送与抗体结合的分子而能用于治疗癌症。

序列表自由文本

序列号7～9、12～14、21～30：合成序列

序列表

<110>定制药品研究株式会社(order-mademedicalresearchinc.)

<120>使用了抗mct5抗体的癌症治疗用药物组合物

<130>g1443wo

<150>jp2016-076565

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thrlys

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65707580

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thrlys

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serpheserglnleuvalleuthrglnserserseralaserpheser

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glyserserleuseralahisglyproglualahisalathrgluthr

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<210>32

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