本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及焦磷酸测序法检测tert启动子突变的试剂盒及方法。
背景技术：
：端粒(telomere)是线性染色体末端的一小段核蛋白结构，它通过防止dna融合和退化保持基因组的稳定性。在正常细胞中，端粒随着细胞有丝分裂而逐渐缩短，从而调节细胞的衰老与凋亡。但在癌细胞中，端粒酶被激活而持续表达，维持端粒的长度，使肿瘤细胞得到永生。端粒酶是一种核糖核蛋白，它以自身rna为模板合成端粒dna，添加到染色体末端，延长端粒。端粒酶在多种肿瘤细胞中高表达，对癌细胞的增殖分化起重要作用，抑制端粒酶活性，能够抑制肿瘤细胞的生长。端粒酶逆转录酶(telomerasereversetranscriptase,tert)是端粒酶的催化亚单位，是端粒酶活性的主要限制因子。与端粒酶rna亚单位相比，tert在端粒酶的活性中起更重要的作用。2013年horns在黑色素瘤中发现了tert启动子突变，随后，tert启动子突变在膀胱癌，恶性胶质瘤以及甲状腺癌中相继被发现。其在中枢神经系统，膀胱癌，分化型甲状腺癌及皮肤癌中的发生率分别为43％，59％，10％，29％。tertc228t/c250t突变与多种癌症的发生，年龄，性别，肿瘤大小，侵袭及转移复发及死亡均有一定的相关性。因此tert启动子突变被认为是致癌突变。tert启动子最常见的两个突变位于5号染色体1295228c>t(c228t)和1295250c>t(c250t)，分别对应于tert转录起始位点上游124bp和146bp处。该突变位于tert启动子区可影响tert的活性，继而影响端粒酶的功能，从而促进癌症细胞的永生，导致病情恶性程度增加，治疗难度加大及预后不良。综上tertc228t突变可作为提示癌症发生及预后的重要分子标志物，开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测tertc228t突变的试剂盒将为癌症的早期诊断筛查及个体化治疗起到积极的推动作用。焦磷酸测序(pyrosequencing)技术是新一代dna序列分析技术，该技术无须进行电泳，dna片段也无须荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。技术实现要素：tert启动子突变具体的是指启动子上游-124bp1295,228c>t和-146bp1259,250c>t突变，tertc228t/c250t突变是癌症发生的重要分子标志物。本发明提供一种检测tert启动子突变的试剂盒，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的癌症早期诊断筛查。为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：所述焦磷酸测序法检测tert启动子(tertc228t/c250t)突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括如下引物：tert上游引物5′-cacagacgcccaggaccg-3′(seqidno.1)；tert下游引物5′-gcgctgcctgaaactcgc-3′(seqidno.2)，下游引物的5′端进行生物素标记；tert测序引物5′-cccgccccgtcccga-3′(seqidno.3)。其中，所述试剂盒中还包括pcr缓冲液、taqdna聚合酶、模板dna、磁珠、结合缓冲溶液、洗涤缓冲溶液、退火缓冲溶液和变性缓冲溶液。利用上述述试剂盒进行tert启动子突变检测的方法，包括如下步骤：(1)dna提取；(2)聚合酶链反应：配制20μlpcr扩增体系，包含：2×gcbuffer10.0μl，dntp1.6μl，tertc228t/c250t上游引物0.4μl，tertc228t/c250t下游引物0.4μl，rtaq0.2μl，水6.4μl，模板1μl；按照下面的循环参数设置扩增仪：98℃10s预变性；然后依次在98℃10s,65℃5s,72℃12s,进行35个循环；再在72℃保持2min，最终保持在4℃，得扩增产物；(3)焦磷酸测序单链样本纯化；(4)tertc228t/c250t测序引物进行焦磷酸测序；(5)分析焦磷酸测序结果。本发明中，tertc228t/c250t(c>t)目标序列如下：野生型ctcccgggtccccggcccagccccctcc(seqidno.4)，c250t突变型cttccgggtccccggcccagccccctcc(seqidno.5)，c228t突变型ctcccgggtccccggcccagccccttcc(seqidno.6)，扩增片段长219bp。本发明适用于对tertc228t/c250t突变进行快速检测，可广泛应用于临床上基因诊断检测。与现有技术相比，其应用焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短dna序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本等特点；pcr产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。本发明的试剂盒，可以实现准确、快捷、高通量tert启动子突变的检测，从而达到对甲状腺癌早期诊断筛查提供依据。附图说明图1为本发明tertc228t/250t焦磷酸测序结果。具体实施方式下面结合实施例对本发明进行详细说明。焦磷酸测序法检测tertc228t试剂盒，其包括：pcr缓冲溶液、高保真taqdna聚合酶、引物、模板dna、焦磷酸测序试剂盒、磁珠、结合缓冲溶液、洗涤缓冲溶液、退火缓冲溶液和变性缓冲溶液；所述引物由pcr扩增引物和测序引物组成：tertc228t/c250t上游引物5′-cacagacgcccaggaccg-3′，tertc228t/c250t下游引物5′-gcgctgcctgaaactcgc-3′，5′进行生物素标记，tertc228t/c250t测序引物5′-cccgccccgtcccga-3′。下面结合实施例对上述试剂盒及检测方法进行详细描述。1.dna提取1.1实验前试剂材料准备与检查工作如下：(1)检查试剂盒保质期以及确保washbuffer1和2中已添加乙醇，并在瓶上相应标识处打勾√；(2)异丙醇(如无，可用无水乙醇替代)和75％乙醇；(3)高压灭菌有效期内的1.5mleppendorf管和各类移液枪头。1.2从4℃冰箱中取出装有全血的edta抗凝管，上下颠倒数次混匀；1.3在1.5mleppendorf管对应标本唯一性标识做好标记；1.4分别移取900ulcelllysissolution加至灭菌的1.5mleppendorf管；1.5小心移取300ul全血转移至上述加有celllysissolution的1.5mlep管；1.6盖上eppendorf管盖，室温孵育10min；1.713,000rpm室温离心20秒；1.8取出eppendorf管，观察白色沉淀；1.9开eppendorf管盖，手持管底部，倾斜ep管口弃去部分红色上清，尽量将红色上清吸尽；1.10盖上eppendorf管，用手指弹击ep管底部，使白色沉淀重悬；1.11移取300ulnucleilysissolution入上述eppendorf管中，盖上管，上下颠倒数次混匀；1.12打开eppendorf管，移取100ulproteinprecipitationsolution入上述eppendorf管中，盖上管管，振荡器上剧烈振荡20秒；13,000rpm室温离心3min；1.13移取上清转移到新的已灭菌1.5mleppendorf管；1.14移取300ul异丙醇入ep管，盖上管盖，上下颠倒数次混匀，可见白色絮状gdna析出；1.1513,000rpm室温离心1min；1.16打开eppendorf管，手捏管底部，倾斜管口弃去上清；1.17移取300ul75％乙醇加入eppendorf管，盖上管盖，轻柔上下颠倒洗涤沉淀；1.1813,000rpm室温离心1min；1.19打开eppendorf管，手持管底部，倾斜管口弃去上清；1.20在实验台上放置新滤纸，倒扣eppendorf管，吸干液体，将eppendorf管开盖侧放风干；1.21目测沉淀大小，加入50～100uldnarehydrationsolution至沉淀；1.22过夜溶解后用nano-space紫外分光光度计进行核酸浓度测定，核酸浓度大于50ng/ul视为合格，如浓度不够，加入乙醇再次沉淀dna，然后重新加适量的dnarehydrationsolution溶解dna。1.23在管壁和管盖上再次标清样本唯一性编号，并用透明胶带缠绕保护；1.24保存核酸标本至4℃冰箱；2.聚合酶链反应2.1在试剂准备区配制20μlpcr扩增体系(模板添加除外)，各组分及添加量如表1所示：表12×gcbuffer10.0μldntp1.5μltert-f0.4μltert-pyror(5’-bio标记)0.4μlrtaq0.2μl水6.4μl2.2在标本制备区对盛有dna模板短暂离心后添加1μl至扩增体系中，在pcr管壁上标记标本唯一性标识，管盖上标记检测项目代号。pcr管震荡混匀，桌面离心机上短暂离心；2.3在扩增区进行pcr扩增反应，按照表2的循环参数设置扩增仪：表2步骤号温度处理时间循环数198℃10s298℃10s365℃5s472℃10sgotostep2，for35cycle572℃2min64℃holding2.4设置程序后在随后的下拉菜单中选择“tube”；2.5点击“start”开始仪器运行。3.焦磷酸测序单链样本纯化3.1纯化前试剂和仪器准备：进行样本纯化前，确保所有溶液都达到室温；打开精密控温加热炉，使温度达到80℃。3.2单链样本纯化操作：3.2.1在psq96板中先加40μlannealingbuffer和2～3μl测序引物(10um)；3.2.2在振荡器上充分混匀sepharosebeads；3.2.3将所需sepharosebeads量(每样本3μl计算)转移到1.5mleppendorf管；3.2.4在sepharosebeads中加入bindingbuffer，使得平均每个样品约有和pcr体系一样的体积，在振荡器上将混合物充分混匀；3.2.5将sepharosebeads混合物加至约15μlpcr产物中，每样本加15μl；3.2.6常温下、在振荡器上将pcr板混匀10分钟；3.2.7在vacuumprepworkstation中，四个液体槽中依次加入180ml纯水、120ml70％乙醇、denaturationbuffer和washingbuffer；3.2.8倒掉与真空泵相连的废液收集桶中的废液；3.2.9打开vacuumprepworkstation的真空泵和阀门，将vacuumpreptool在纯水中清洗30秒；3.2.10将vacuumpreptool移到pcr板孔中，抓取结合了生物素标记核酸的sepharosebeads；3.2.11拿起pcr板，检查beads是否都被吸附在了vacuumpreptool上；3.2.12将vacuumpreptool放入70％乙醇中5秒；3.2.13将vacuumpreptool移到denatureationbuffer中5秒；3.2.14再将vacuumpreptool移到washingbuffer中清洗10秒；3.2.15把tool悬放在pyro反应板；3.2.16vacuumpreptool放入含有测序引物的反应板中，旋转摇动，以释放sepharosebeads；3.2.17放有纯化样本的psq96板放在thermoplate上，置于80℃加热炉中加热2min，取出后自然冷却到室温，进行下游pyrosequencing反应。3.3纯化完毕后清洗：3.3.1不开真空泵和阀门，使用少量纯水清洗vacuumpreptool，使少量未脱落的beads洗脱下来；3.3.2更换纯水后再打开真空泵和阀门，用约300ml纯水清洗tool；3.3.3关掉真空泵和阀门，将vacuumpreptool侧放，室温晾干；3.3.4清洗所有盛装试剂溶液的塑料槽，自然晾干；3.3.5用湿布擦拭纯化设备表面。4.焦磷酸测序4.1调入前述设定的运行程序文件，点击“view”的下拉键，选择“run”，按照软件自动计算本次实验的各试剂使用量，添加各试剂成分至试剂仓；4.2把准备好的样本和试剂舱放入仪器相应的位置，点击屏幕右下端的“run”开始焦磷酸测序；4.3检测完成后，首先点击软件进程状态窗口的“close”键以保存测序结果。5.焦磷酸测序结果分析在“snpruns”文件夹中双击鼠标，打开上述运行文件，选择“snpmode”，点击“analyzeall”键，对所有检测标本进行基因型分析；选择“aqmode”，点击“analyzeall”键，对所有检测标本进行等位基因频率分析。对样本检测tert基因多态性，焦磷酸检测结果见图1。sequencelisting<110>中南大学<120>一种焦磷酸测序法检测检测tert启动子突变的试剂盒及方法<160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>18<212>dna<213>人工合成<400>1cacagacgcccaggaccg18<210>2<211>18<212>dna<213>人工合成<400>2gcgctgcctgaaactcgc18<210>3<211>15<212>dna<213>人工合成<400>3cccgccccgtcccga15<210>4<211>28<212>dna<213>人工合成<400>4ctcccgggtccccggcccagccccctcc28<210>5<211>28<212>dna<213>人工合成<400>5cttccgggtccccggcccagccccctcc28<210>6<211>28<212>dna<213>人工合成<400>6ctcccgggtccccggcccagccccttcc28当前第1页12