本发明涉及植物生物技术领域，具体地说，涉及一种标记植物花粉微丝微管细胞骨架的方法及其试剂盒。
背景技术：
植物的细胞骨架包括微丝和微管，它们组成不同的列阵参与细胞分裂、生长和分化等众多的生理过程。不同的真核生物细胞骨架的排列差异很大，花粉管细胞中的微丝微管骨架在生殖过程中承担着重要的角色。清晰直观地观察细胞骨架的排列对了解花粉管如何通过信号转导、胞吞胞吐、极性生长过程参与有性生殖有着重要的意义。由于花粉管存在材料收集困难及木本植物的细胞壁组成成分较为复杂，因此对于苹果花粉管中细胞骨架的研究更为困难。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种用于标记植物花粉微丝微管细胞骨架的试剂盒。
本发明的另一目的是提供利用上述试剂盒标记苹果花粉微丝微管细胞骨架的方法。
为了实现本发明目的，本发明用于标记植物花粉微丝微管细胞骨架的试剂盒，所述试剂盒包括花粉固定液试剂a，花粉洗涤液试剂b，花粉微丝染料试剂组合c，以及花粉微管染料试剂组合d。
其中，所述试剂a由多聚甲醛、egta、pipes、mgcl2和蔗糖组成；所述试剂b由tris-hcl、nacl和蔗糖组成；所述试剂组合c包括0.1～0.15％np-40(优选0.15％)、0.06～0.08％np-40(优选0.08％)和alex-561-phalloidin染色液；所述试剂组合d包括cellulose和pectolyasey-23混合液、0.1～0.15％np-40(优选0.15％)、0.06～0.08％np-40(优选0.08％)、甘氨酸溶液、一抗anti-a-tubulin、二抗fitc-anti-mouse-igg以及tris-hcl、nacl和甘氨酸的混合液。
优选地，本发明所述植物为苹果。
所述试剂a中多聚甲醛的质量体积比为5～6％(优选6％)、egta的浓度为2～3mm(优选3mm)、pipes的浓度为50～60mm(优选60mm)、mgcl2的浓度为2～3mm(优选3mm)、蔗糖的质量体积比为10～15％(优选15％)。
所述试剂b中tris-hcl的浓度为50～60mm(优选60mm)，ph7.0，nacl的浓度为200～250mm(优选250mm)，蔗糖的质量体积比为10～15％(优选15％)。
所述试剂组合c中，0.1～0.15％np-40用花粉萌发液配制；0.06～0.08％np-40用tbss配制；alex-561-phalloidin染色液中alex-561-phalloidin的浓度为150nm，ph7.0的tris-hcl浓度为50～60mm(优选60mm)，nacl的浓度为200～250mm(优选250mm)，蔗糖的质量体积比为10～15％(优选15％)。
其中，所述花粉萌发液的配方为：葡萄糖0.08～0.1g/ml、cacl20.25～0.3mg/ml和硼酸0.08～0.1mg/ml。
本发明所述tbss由ph7.060mm的tris-hcl，250mmnacl和质量体积比为15％的蔗糖组成。
所述试剂组合d中，cellulose和pectolyasey-23混合液中cellulose的浓度为1.0～1.5％(优选1.5％)，pectolyasey-23的浓度为0.1～0.15％(优选0.15％)；0.1～0.15％和0.06～0.08％的np-40用tbss配制；甘氨酸溶液的浓度为50～60mm(优选60mm)；一抗anti-a-tubulin以及二抗fitc-anti-mouse-igg的浓度配比分别为1:300-400(优选1:400)；tris-hcl、nacl和甘氨酸的混合液中tris-hcl的浓度为50～60mm(优选60mm)，ph7.0，nacl的浓度为200～250mm(优选250mm)，甘氨酸的浓度为50～60mm(优选60mm)。
本发明还提供利用所述试剂盒标记苹果花粉微丝微管细胞骨架的方法，具体流程如下：培养花粉—固定花粉管—洗涤花粉管—微丝染料室温染色花粉管—微管染料室温染色花粉管—激光共聚焦显微镜观察。
所述包括如下步骤：
1)在23℃条件下暗培养苹果花粉2-3h，待花粉管长度至50μm，停止培养；
2)用所述试剂a室温下固定花粉管1-1.5h；
3)固定后的花粉管经离心，弃上清；收集沉淀，用所述试剂组合c中0.15％的np-40室温下处理15min，再用0.08％的np-40室温下处理4次，每次15min；
4)进行花粉管微丝染色：步骤3)所得花粉管经离心，弃上清；沉淀用所述试剂b洗4次，每次15min；然后加入所述试剂组合c中的alex-561-phalloidin染色液，室温下染色3h；
5)进行花粉管微管染色：步骤4)所得花粉管经离心，弃上清；沉淀用所述试剂b洗4次，每次15min；然后向沉淀中加入所述试剂组合d中的cellulose和pectolyasey-23混合液室温下酶解20min；再用所述试剂组合d中的0.15％np-40室温下抽提15min；再用0.08％的np-40室温下抽提15min；再用甘氨酸溶液室温下封闭1h；加入浓度配比为1:300-400(优选1:400)的一抗anti-a-tubulin，于4℃下孵育过夜；再加入浓度配比为1:300-400(优选1:400)的二抗fitc-anti-mouse-igg，室温下孵育3h；最后用tris-hcl、nacl和甘氨酸的混合液漂洗2次，每次15min；
6)向上述处理过的花粉管中滴加抗荧光猝灭剂后，将花粉管在激光共聚焦显微镜下观察，观察花粉管微丝采用激发光为561nm，观察花粉管微管采用激发光为488nm。
前述的方法，步骤1)具体为：将0.5g苹果花粉分散于4ml液体培养基表面，置于23℃培养箱中暗培养2-3h。
本发明所述液体培养基的配方为：葡萄糖0.08～0.1g/ml、cacl20.25～0.3mg/ml和硼酸0.08～0.1mg/ml。
前述的方法，步骤2)具体为：向培养2-3h后的花粉管中加入与液体培养基等体积的试剂a将花粉管在室温下固定1h。
前述的方法，步骤3)具体为：将固定后的花粉管在10000rpm下离心10min，弃上清；向沉淀中加入2ml0.15％的np-40，室温下处理15min，再加入2ml0.08％的np-40，室温下处理4次，每次15min。
前述的方法，步骤4)具体为：将步骤3)所得花粉管在10000rpm下离心10min，弃上清；沉淀用所述试剂b洗4次，每次15min；洗涤完毕后加入200μlalex-561-phalloidin染色液，室温下染色3h。
前述的方法，步骤5)具体为：步骤4)所得花粉管在10000rpm下离心10min，弃上清；沉淀用所述试剂b洗4次，每次10min；然后向沉淀中加入200μlcellulose和pectolyasey-23混合液室温下酶解20min；再用0.15％np-40室温下抽提15min；再用0.08％的np-40室温下抽提15min；再用2ml甘氨酸溶液室温下封闭1h。
本发明以苹果花粉为试材，通过水合花粉、花粉管固定、花粉管微丝染料染色、花粉管微管的免疫染色、激光共聚焦观察染色后的花粉粒和花粉管中微丝微管骨架排列方式，为直观观察木本植物花粉管内微丝微管骨架结构与排列方式提供技术支持。
附图说明
图1为本发明实施例2中苹果花粉微丝微管细胞骨架的标记结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
本发明中，如无特殊说明，各组分浓度均为溶液中的终浓度。
以下实施例中alex-561-phalloidin(目录号为a12380)购于molecularprobes公司、cellulose(目录号为m0512)购于sigma公司，pectolyasey-23(目录号为9032-75-1)、anti-a-tubulin(目录号为t9026-.5ml)、fitc-anti-mouse-igg(目录号为cw0166)均购于北京康为试剂生物科技有限公司，其他常规生化试剂购自北京经科宏达生物技术公司。离心管等一般耗材购于axygen公司。
实施例1用于标记苹果花粉微丝微管细胞骨架的试剂盒
本实施例提供的试剂盒包括花粉固定液试剂a，花粉洗涤液试剂b，花粉微丝染料试剂组合c，以及花粉微管染料试剂组合d。
所述试剂a由多聚甲醛、egta、pipes、mgcl2和蔗糖组成；所述试剂b由tris-hcl、nacl和蔗糖组成；所述试剂组合c包括0.15％np-40、0.08％np-40和alex-561-phalloidin染色液；所述试剂组合d包括cellulose和pectolyasey-23混合液、0.15％np-40、0.08％np-40、甘氨酸溶液、一抗anti-a-tubulin、二抗fitc-anti-mouse-igg以及tris-hcl、nacl和甘氨酸的混合液。
所述试剂a中多聚甲醛的质量体积比为6％、egta的浓度为3mm、pipes的浓度为60mm、mgcl2的浓度为3mm、蔗糖的质量体积比为15％。
所述试剂b中tris-hcl的浓度为60mm，ph7.0，nacl的浓度为250mm，蔗糖的质量体积比为15％。
所述试剂组合c中，0.15％np-40用花粉萌发液配制；0.08％np-40用tbss配制；alex-561-phalloidin染色液中alex-561-phalloidin的浓度为150nm，ph7.0的tris-hcl浓度为60mm，nacl的浓度为250mm，蔗糖的质量体积比为15％。
其中，所述花粉萌发液的配方为：葡萄糖0.08～0.1g/ml、cacl20.25～0.3mg/ml和硼酸0.08～0.1mg/ml。
所述试剂组合d中，cellulose和pectolyasey-23混合液中cellulose的浓度为1.5％，pectolyasey-23的浓度为0.15％；0.15％和0.08％的np-40用tbss配制；甘氨酸溶液的浓度为60mm；一抗anti-a-tubulin以及二抗fitc-anti-mouse-igg的浓度配比分别为1:400；tris-hcl、nacl和甘氨酸的混合液中tris-hcl的浓度为60mm，ph7.0，nacl的浓度为250mm，甘氨酸的浓度为60mm。
实施例2标记苹果花粉微丝微管细胞骨架的方法
本实施例以苹果‘国光’花粉为材料，选择萌发状态良好的花粉为研究对象，利用实施例1试剂盒进行标记微丝微管骨架。具体流程如下：培养花粉—固定花粉管—洗涤花粉管—微丝染料室温染色花粉管—微管染料室温染色花粉管—激光共聚焦显微镜观察。因此分别从以上各个步骤设计实验来确定标记苹果花粉管微丝微管细胞骨架的方法。
1、苹果花粉的培养
将0.5苹果花粉分散于4ml液体培养基表面，置于23℃培养箱中暗培养2-3h，期间利用体式显微镜观察花粉管的长度，待花粉管长度长至50μm，可停止培养。
2、固定花粉管
向上述培养2-3h后的花粉管中加入与培养基等体积的试剂a将花粉管在室温下固定1h。
3、洗涤花粉管
将固定后的花粉管在10000rpm下离心10min，弃上清。向沉淀中加入200μl0.15％的np-40(苹果花粉萌发液配制)，室温下处理15min，再用0.08％的np-40(tbss配制)，室温下处理4次，每次15min。
4、微丝染料室温染色花粉管
将步骤3所得花粉管在10000rpm下离心10min，弃上清。沉淀用试剂b洗涤液洗4次，每次15min。洗涤完毕后加入200μlalex-561-phalloidin染色液，室温下染色3h。
5、微管染料室温染色花粉管
将步骤4所得花粉管在10000rpm下离心10min，弃上清。沉淀用试剂b洗涤液洗4次，每次10min。然后向沉淀中加入200μlcellulose和pectolyasey-23混合液，室温下酶解20min。再用试剂组合d中0.15％np-40室温下抽提15min。再用试剂组合d中0.08％的np-40室温下抽提15min。再用2ml甘氨酸溶液室温下封闭1h。加入anti-a-tubulin的浓度配比为(1:400)，于4℃下孵育过夜。再加入fitc-anti-mouse-igg的浓度配比为(1:400)，室温下孵育3h。最后用tris-hcl、nacl和甘氨酸的混合液漂洗2次，每次15min。
6、激光共聚焦显微镜观察花粉管微丝微管骨架
向上述处理过的花粉管中滴加抗荧光猝灭剂后，将花粉管在激光共聚焦显微镜下观察，观察花粉管微丝采用激发光为561nm，观察花粉管微管采用激发光为488nm。
结果如图1所示，表明本方法可以标记苹果花粉微丝微管细胞骨架，实现快速、灵敏、准确性高、简便地观察木本植物花粉管内微丝微管骨架结构与排列方式。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。