本发明属于微生物领域，具体涉及一种伊朗链霉菌及其应用。
背景技术：
生物农药研究的一个重要方向是从微生物代谢产物中寻找控制有害生物的新物质。随着环境保护、绿色食品及农业可持续发展的需要，农用抗生素作为低毒低残留的生物农药日益受到人们的重视。目前，从微生物中发现的大约22500种生物活性物质中近70％是由放线菌产生的。放线菌是抗生素的主要来源，己知抗生素的60％是放线菌产生的，其中主要集中在链霉菌属，如链霉素、金霉素、四环素、巴龙霉素、丝裂霉素等重要抗生素。
随着对土壤放线菌代谢特性的深入研究，以及分离和培养方法的进一步改进，越来越多的土壤放线菌将得到分离。链霉菌一直被认为是产生各种抗生素的主要来源。遗传多样性分析表明，链霉菌属可产生的抗生素约有上万种，而目前发现的只是很小一部分。
虽然放线菌最初应用在医药方面，但随着其对生态环境影响小、污染少而在农业方面得到了广泛的应用。许多研究证实放线菌在植物病虫草害的生物防治方面作用显著，具有很好的应用前景。
因此，发现新的抗菌活性菌株尤为重要。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种放线菌，其为一种伊朗链霉菌，具有广谱抑菌活性，对多种病菌具有良好的拮抗作用，具有广阔的发展空间和应用前景。
本发明的第一个方面是提供一种放线菌，其为伊朗链霉菌xjc-2-11，保藏编号为cctccno：m2017490。
本发明的第二个方面是提供如本发明第一个方面所述的放线菌在拮抗辣椒炭疽病菌、和/或香蕉枯萎病菌4号、和/或香蕉长形斑病菌、和/或黄瓜枯萎病菌、和/或芒果炭疽病菌、和/或水稻稻瘟病菌、和/或胶孢炭疽病菌、和/或小麦赤霉病菌、和/或苹果轮纹病菌、和/或香蕉树木溃疡病菌、和/或香蕉大灰斑病菌、和/或草莓炭疽病菌中的应用。
本发明的第三个方面是提供如本发明第一个方面所述的放线菌在防治辣椒炭疽病、和/或香蕉枯萎病、和/或香蕉长形斑病、和/或黄瓜枯萎病、和/或芒果炭疽病、和/或水稻稻瘟病、和/或胶孢炭疽病、和/或小麦赤霉病、和/或苹果轮纹病、和/或香蕉树木溃疡病、和/或香蕉大灰斑病、和/或草莓炭疽病中的应用。
本发明的第四个方面是提供如本发明第一个方面所述的所述的放线菌的发酵液或发酵液的过滤液或发酵液的乙醇提取物。
本发明的第五个方面是提供如本发明第四个方面所述的放线菌的发酵液或发酵液的过滤液或发酵液的乙醇提取物在拮抗辣椒炭疽病菌、和/或香蕉枯萎病菌4号、和/或香蕉长形斑病菌、和/或黄瓜枯萎病菌、和/或芒果炭疽病菌、和/或水稻稻瘟病菌、和/或胶孢炭疽病菌、和/或小麦赤霉病菌、和/或苹果轮纹病菌、和/或香蕉树木溃疡病菌、和/或香蕉大灰斑病菌、和/或草莓炭疽病菌中的应用。
本发明的第六个方面是提供如本发明第四个方面所述的放线菌的发酵液或发酵液的过滤液或发酵液的乙醇提取物在防治辣椒炭疽病、和/或香蕉枯萎病、和/或香蕉长形斑病、和/或黄瓜枯萎病、和/或芒果炭疽病、和/或水稻稻瘟病、和/或胶孢炭疽病、和/或小麦赤霉病、和/或苹果轮纹病、和/或香蕉树木溃疡病、和/或香蕉大灰斑病、和/或草莓炭疽病中的应用。
本发明的第七个方面是提供一种菌剂，其含有本发明第一个方面所述的放线菌。
本发明的伊朗链霉菌xjc-2-11(streptomycesiranensisxjc-2-11)生长ph范围为5-9，生长温度为25-32℃，不能生长在nacl含量大于5％的培养基上，具有广谱抑菌活性，对香蕉枯萎病菌、辣椒炭疽病菌、香蕉长形斑病菌、黄瓜枯萎病菌、芒果炭疽病菌、水稻稻瘟病菌、胶孢炭疽病菌、小麦赤霉病菌、苹果轮纹病菌、香蕉树木溃疡病菌、香蕉大灰斑病菌和草莓炭疽病菌等具有良好的拮抗作用，具有广阔的发展空间，具有很好的开发应用前景。
附图说明
图1为菌株xjc-2-11的孢子丝(a)和孢子(b)的形态。
图2为基于16srdna序列构建的菌株xjc-2-11与相关菌株的系统发育树。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。
本发明提供了一种放线菌，其为伊朗链霉菌xjc-2-11(streptomycesiranensisxjc-2-11)，保藏编号为cctccno：m2017490，保藏日期为2017年9月11日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址在中国武汉的武汉大学。本发明的伊朗链霉菌xjc-2-11从采集自云南省普洱市茶树根际土壤中分离得到。
1实验材料
1.1供试土壤
采集云南省普洱市茶树根际土壤，置于无菌封口袋中混匀、封口，于冰盒中保存。采集回来后，去除根系、石块等杂物，于冰箱4℃保存备用。
1.2供试培养基
本实验的供试培养基包括了分离培养基、培养特征观察的培养基、生理生化的培养基和发酵培养基等(徐丽华，2007；黄小龙，2009)。
表1放线菌的分离培养基及其配方
表2培养特征观察培养基及其配方
表3生理生化特性观察所需的培养基
表4发酵培养基及其配方
1.3本实验使用的试剂与仪器设备
(1)主要试剂
表5主要生化试剂及来源
(2)仪器与设备
表6仪器与设备
1.4供试病原菌
香蕉枯萎病菌4号生理小种(fusariumoxysporumf.sp.cubense，foc4)，用于抗镰刀菌活性放线菌的筛选及抑菌活性测定。香蕉长形斑病菌(curvulariafallax)、香蕉大灰斑病菌(curvularialunata)、香蕉树木溃疡病菌(btoryosphaeriadothidea)、辣椒炭疽病菌(colletotrichumacutatum)、胶孢炭疽病菌(colletotrichumgloeosporioides)、草莓炭疽病菌(colletotrichumfragariae)、灰葡萄孢病菌(botrytiscinerea)、黄瓜枯萎病(fusariumoxysporum(schl.)f.spcucumerinumowen)、芒果炭疽病(colletotrichumacutatum)、水稻稻瘟病(pyriculariaoryaecav)、小麦赤霉病(fusahumgraminearumsehw)、苹果轮纹病(botryosphaeriadothidea)用于抗菌谱的测定。
2实验方法
2.1根际土壤放线菌的分离及鉴定
2.1.1根际土壤放线菌的分离及纯化
自然风干土样，充分研磨后过筛，称取1g的土样溶于10ml的无菌水中，55℃加热20min后置于180r/min的摇床培养20min，制成悬浮液。取其上清液采用10倍稀释法进行稀释处理，配制成10-1、10-2和10-3的土壤悬液，分别吸取0.1ml的悬液涂布至分离培养基上，28℃倒置培养2-4周，每个梯度设3个重复，挑取不同的单菌落并釆用划线法在ye培养基上进行反复纯化。
2.1.2拮抗菌的筛选
采用平板对峙培养法(孙建波，2010)：使用直径为5mm的打孔器取已接种5d、长势一致的foc4病菌边缘的菌饼，并将其接置每个pda平板的中央，同时距病原菌菌落中央的2.5cm处接种待测菌，每皿接种4个供试菌株，以只接种foc4的病菌作为对照，置于28℃的培养箱中倒置培养7d后，观察结果。
2.1.3皿内抗菌谱的测定
采用对峙培养法(李树正，1997)对菌株进行抑菌谱测定：利用5mm的打孔器取已纯化好的12种植物的病原菌的菌饼，并接种于pda平板的中央，分别在距离病原菌菌饼2.5cm处的四个点上接种少量待测菌，以只接病原菌的培养皿为空白对照组，每个处理3次重复。在培养箱中培养4-7d后，采用十字交叉测量法测量供试病原菌的菌落生长直径，按照下面的公式统计抑菌率(谢颖，2011；夏龙荪，2013)：
菌落直径(mm)＝测量菌落直径平均值-5.0
2.1.4拮抗菌株的培养特征观察
通过参照国际链霉菌规划中关于放线菌的培养特征描述所采用的标准培养基进行培养特征的观察(cuibs，2008)。将拮抗放线菌接种于isp2、isp3、isp4、isp5、isp6、isp7培养基上，于28℃培养7-21d后，分别观察并记录菌株在各培养基上的培养特征，包括菌落的形态、气生菌丝的产生、孢子的颜色以及基内菌丝的颜色等方面的特征。
2.1.5扫描电镜观察
将盖玻片用0.05g/l浓度的重铬酸钾浸泡，使用酒精浸泡洗脱，再用超纯水进行冲洗，吹干，121℃灭菌20分钟。将灭菌的盖玻片以45°插在接有放线菌菌株的高氏一号培养基上，28℃培养7-10天。送至检测中心进行扫描电镜的观察，将长有菌的盖玻片样品置于真空镀膜机内进行喷金镀膜，利用扫描电镜观察菌株的菌丝和孢子表面的细微结构。
2.1.6生理生化特性测定
参照shirking(1966)和徐丽华等(2007)的方法对菌株进行生理生化鉴定，主要有以下方面。
(1)酶学特性的测定
①脲酶实验：
将菌株接种于脲酶培养基上，在28℃条件下培养4d后，观察培养基是否变色。测试供试菌株产生尿素酶的能力，培养基变成桃红色为阳性，不白色则为阴性。
②酯酶(吐温20、吐温80)实验：
划线接种至酯酶培养基上，培养1-2周，每天观察。如在其生长的周围有模糊的晕圈则为阳性，没有晕圈则为阴性。
③淀粉水解：
以营养琼脂为基本培养基，添加1.0％的可溶性淀粉。将供试菌株接种于平板上，采用点接法(接种直径不要超过5mm)，待菌株生长达到良好时，在菌落周围滴加碘液进行检测。若菌株周围产生透明圈，则说明有淀粉酶的产生，圈的大小表示淀粉酶活性的强弱；如不产淀粉酶，则呈蓝色。
④明胶液化：
将菌株接种于明胶培养基的表面，无需刺穿培养基，再28℃下培养，并分别在第5d、10d、20d和30d观察培养基的液化程度。观察前需将试管进行冷却20-30min或用自来水进行冲洗30min，才可以观察培养基的液化程度。
⑤纤维素分解：
将滤纸条的一端浸没在液体培养基当中，经灭菌后，将待测菌株接种在液面以上的滤纸片上，一个月后观察滤纸条是否被分解。
⑥硝酸盐还原：
待测菌株接种于硝酸盐还原培养基中，置28℃下培养7、14d，以不接菌的培养基为对照。在试管中分别加入少许培养了7d、14d的培养液，滴加一滴a液和b液，对照同样滴加。当溶液变成粉红、玫瑰红、橙色或棕色等，为硝酸盐还原阳性；若无红色出现时，滴加1或2滴二苯胺试剂，若呈蓝色，则还原作用为阴性；若不为蓝色，则仍按阳性对待。
(2)单一碳源利用实验
在放线菌鉴定当中，其重要的考察指标之一就是对碳源的利用情况，不同放线菌对糖、醇、有机酸、脂肪酸等的碳源利用能力各有不同。试验所选用的碳源：d-果糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、棉子糖、松三糖、无水乳糖、d-半乳糖、α-乳糖、d-海藻糖、d-甘露糖、d-核糖、肌醇、山梨醇、甘露醇、水杨苷、可溶性淀粉，按1％碳源浓度加入到普戈二氏的基础培养基中。并接入待测菌株，28℃下恒温培养7-14d，以不添加任何碳源的基础培养基接种的菌株作为空白对照，观察菌株的生长情况。若能生长，则表明该菌种能利用这种碳源；若不能生长，则表明该菌种不能利用此碳源。
(3)单一氮源利用实验
试验所选用的氮源：组氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、草氨酸、甘氨酸、羟脯氨酸、苯基丙氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、精氨酸、缬氨酸、四水合钼酸铵、乙酸铵、硝酸铵、硫酸铵，按0.5％的浓度加入基础培养基中。接入菌种，28℃下恒温培养7-14d，以不添加任何氮源的基础培养基接种的菌株作为空白对照，观察菌株的生长情况。若能生长，则表明该菌种能利用这种氮源；若不能生长，则表明该菌种不能利用此氮源。
(4)其他的一些生理生化指标的测定
①温度耐受实验：
将待测菌株接种于相同的培养基后，在其他培养条件均一致的情况下，分别在20℃、24℃、28℃、32℃、36℃下培养7-14d，观察并记录菌落的生长情况，从而确定菌株生长的最适温度。
②ph耐受实验：
在ph值为4、5、6、7、8、9、10的液体培养基内分别接种待测菌株，保证其他的培养条件一致，在28℃下培养，每隔一周都进行一次观察，一直观察到四周为止。每次观察并记录菌株生长情况，以确定菌株生长的最适ph。
③盐耐受性实验：
将待测菌株分别接种在不同浓度的nacl(1％、3％、5％、7％、9％、11％、13％、15％)培养基上，培养基的其它营养成分均相同，在28℃条件下培养，7天为一个观察周期，观察4周，记录其是否能生长，以确定该菌株能耐受nacl的上、下限浓度。
④硫化氢的产生实验：
将待测菌株接种于含有一定比例铵离子的硫化氢培养基上，在28℃条件下培养2周，如培养基呈现黑色，则有硫化氢的产生；无黑色，则无硫化氢的产生。2.1.7拮抗菌株分子生物学鉴定
(1)放线菌基因组dna的提取
采用bioteke的细菌基因组dna快速提取试剂盒(dp1301，北京百泰克生物技术有限公司，中国)进行总dna的提取。
(2)16srdna的测序及分析
①16srdna的pcr扩增：
以放线菌基因组dna为模板，采用通用引物27f和1492r进行pcr的扩增。引物序列如下：上游引物27f(5’agagtttgatcctggctcag3’)、下游引物1492r(5’tacggctaccttgttacgactt3’)。具体反应体系见表7，反应程序(周俊萍，2014；郝菲菲，2015；nayua，2014)见表8。
表716srdna基因的pcr反应体系
表816srdna基因的pcr扩增反应条件
②pcr产物的电泳检测：
pcr反应结束后，取5μl的pcr扩增产物在1％的琼脂糖凝胶上对菌株pcr产物进行电泳检测，根据目的片段的长度大小确定是否连接成功。
③测序及构建系统发育树：
将菌株的pcr产物送至华大基因公司进行序列的测定。将测得的基因序列使用blast软件进行序列的对比，并与genbank和ezbiocloud数据库中已知的16srdna进行同源性的比较。找出同源性较高的序列进行多重匹配排列分析，采用mega5.1软件以邻接法(neighbor-joining)进行聚类的分析和系统发育树的构建(nayua，2014；jianghua，2015)。
2.2拮抗菌株抑菌活性评价
2.2.1平板对峙广谱抑菌活性测定
采用平板对峙法对菌株进行广谱性测定：利用5mm的打孔器取已纯化好的12种植物病原菌的菌饼，接种于pda平板的中央，分别在距离病原菌菌饼2.5cm处的四个点上接种少量待测菌，以只接病原菌的培养皿为空白对照组，每个处理3次重复。在培养箱中培养4～7d后，采用十字交叉法测量供试病原菌的菌落生长直径，按照下面的公式统计抑菌率(谢颖，2011；夏龙荪，2013)：
菌落直径(mm)＝测量菌落直径平均值-5.0
2.2.2次生代谢产物对病原菌的抑菌活性测定
将菌株分别接入slm液体培养基培养7d后，加入无水乙醇震荡10d后，5层滤纸真空抽滤，收集该菌种的次生代谢产物作为样品。采用抑菌纸片法(徐叔云等，2003；wellman-labadieetal,2010)，取灭好菌的培养基倒平板，待平板凝固后，用打孔器制得直径为9mm的滤纸片，将滤纸片干热灭菌2h，在无菌操作台中浸泡于样品中30min，取出挥干溶剂，将滤纸片平贴于上述含药平板上，同时在培养基的中心接种指示菌。最后将所有培养皿置于28℃的恒温培养箱培养，每天观察并进行记录与拍照，每组做三个平行，算出抑菌圈直径平均值。
3结果与分析
3.1放线菌的筛选及形态学特征
经平板涂布分离并划线纯化的菌株，根据其在纯化培养基上的菌落形态及颜色去重，并经过平板对峙培养法初筛、牛津杯法复筛后，获得产生抑菌圈最大的1株放线菌；编号为xjc-2-11。菌株xjc-2-11孢子丝(a)和孢子(b)的形态见图1和表9，菌株xjc-2-11的基内菌丝发达、不断裂，气生菌丝多分枝；孢子丝波曲状，孢子表面褶皱。
表9菌株xjc-2-11在6种培养基上的培养特征
3.2菌株的生理生化特征
表10菌株xjc-2-11的部分生理生化特征
+:结果为阳性；－:结果为阴性。
3.3菌株的系统发育学特征
提取菌株xjc-2-11总dna，通过pcr扩增获得16srdna序列约1.5kb，测序得到其序列，将序列信息提交到eztaxon进行基因序列相似性搜索，共得到9株与菌株xjc-2-11同源性最高、且已定名的模式菌的序列信息，进行系统发育分析，并构建系统进化树(图2)。由图可知，xjc-2-11与链霉菌streptomyces聚成一支，16srdna序列的同源性在98.47％～99.42％区间；其中，与streptomycesiranensis的同源性最高，为99.42％。结合形态特征，生理生化特征和16sdna分子序列分析结果，初步鉴定菌株xjc-2-11为伊朗链霉菌(streptomycesiranensis)。
3.4菌株xjc-2-11抗菌活性评价
3.4.1平板对峙对病原菌的拮抗作用
表11菌株xjc-2-11对12种病原真菌的抑制效果
表中数据为平均数±标准差。同列不同小字母表示经duncan氏新复极差法检验在p＜0.05水平差异显著。
3.4.2菌株xjc-2-11粗提物对病原菌菌丝生长的抑菌活性
表12菌株xjc-2-11粗提物对12种病原真菌的抑制效果
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。