一种梭子蟹肌孢虫实时定量PCR检测试剂盒的制作方法

本发明属于三疣梭子蟹疾病检测领域，特别涉及一种梭子蟹肌孢虫实时定量PCR检测试剂盒。

背景技术：

近年来，我国养殖三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)普遍流行一种以肌肉白浊为典型特征的疾病，俗称“牙膏病(toothpaste crab)”，研究者通过病理学和分子生物学等方法诊断出该病病原为一种微孢子虫——梭子蟹肌孢虫(Ameson portunus)。据我们2013年以来的流行病学调查结果，我国东黄海野生三疣梭子蟹肌孢虫感染率平均为6.9％，江苏、上海沿海感染率高达10.6％；养殖三疣梭子蟹感染率更高，流行地区感染率高达90％以上，气温降低后发病蟹大面积死亡以致塘口绝收，未发病蟹也由于经济价值丧失而对养殖业造成重大经济损失。由于微孢子虫在宿主细胞内寄生并拥有坚固的几丁质外壳保护，到目前为止仍然没有较好的治疗和控制措施，建立病原的早期定量诊断技术，及早预警病原感染和疾病暴发风险，对于该病的防控具有重要意义。

聚合酶链式反应(PCR)可通过对特定核苷酸片断进行指数级的扩增实现对微量目的基因的检测，而实时荧光定量PCR技术是在传统PCR扩增的基础上，通过对反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测实现对起始模板的定量及定性分析，不仅灵敏度更高，还可以实现对病原感染量的准确认定，有利于及早、准确评估疾病发生风险。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种梭子蟹肌孢虫实时定量PCR检测试剂盒，该试剂盒具有成本低、操作简便的特点，具有良好的稳定性以及组内和组间重复性，因此，适用于梭子蟹肌孢虫微量潜伏感染时期的监测；同时，也具有较高的检出率，显示了较高的检测灵敏性，具有良好的应用前景。

本发明的一种梭子蟹肌孢虫实时定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括特异性引物：

AP-F：5'-AACARATAGATAGGGGCAGTA-3'；

AP-R：5'-TCTTCCGTCAATTTCTTTAA-3'。

所述试剂盒还包括2×SYBR Premix Ex Taq^TMⅡ。

所述试剂盒的PCR反应体系为：总体积10μl，2×SYBR Premix Ex Taq^TMⅡ5μl，1.0μmol/L上、下游引物各2μl，DNA模板1μl。

所述试剂盒的PCR反应条件为：95℃30s预变性；然后，95℃5s，60℃20s，循环40次。

本发明是基于染料法建立的梭子蟹肌孢虫实时定量PCR检测技术，具有成本低、操作简便的特点。特异性试验显示，本发明对宿主三疣梭子蟹及其养殖过程中的常见病原——溶藻弧菌、副溶血弧菌和WSSV等的DNA模板都没有产生有效扩增，而对“牙膏蟹”的DNA模板和阳性质粒扩增良好，形成典型的“S”形扩增曲线，显示本发明具有高效的扩增效率和极强的病原特异性；而且，灵敏性试验表明，当反应体系中的阳性质粒或养殖三疣梭子蟹样品DNA的模板量为20个拷贝(copies)时，仍能保持有效扩增。查阅国内外同类技术研究可见，Durand等采用探针法针对WSSV建立的实时定量PCR技术在体系中含有400个拷贝以上时，Ct值在35以下；Phelps等基于探针法建立了针对金体美洲鳊鱼(Notemigonus crysoleucas)微孢子虫(Ovipleistophora ovariae)的实时定量检测方法，对阳性质粒模板的检测下限为9个拷贝/体系，但是，此检测下限对应的Ct值大于了35个循环；我国刘珍等针对感染凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)的虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)建立了基于染料法的实时定量检测方法，对反应体系中质粒标准品的检测灵敏度约为83个拷贝。综合以上分析可知，本发明建立的梭子蟹肌孢虫实时定量PCR检测试剂盒具有很高的病原特异性和灵敏性；组内与组间试验也表明，具有良好的稳定性以及组内和组间重复性，因此，适用于梭子蟹肌孢虫微量潜伏感染时期的监测。另外，在与套式PCR的对比分析中还发现，本发明比先前的套式PCR方法具有更高的检出率，显示了更高的检测灵敏性，这与刘珍等的研究报道一致。综上，本发明基于SYBR Green I染料法建立的梭子蟹肌孢虫实时定量PCR检测试剂盒具有很高的病原特异性、灵敏性和实用性，可作为梭子蟹肌孢虫防控过程的技术支撑。

有益效果

本发明具有成本低、操作简便的特点，具有良好的稳定性以及组内和组间重复性，因此，适用于梭子蟹肌孢虫微量潜伏感染时期的监测；同时，也具有较高的检出率，显示了较高的检测灵敏性，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为实施例1实时定量PCR扩增产物的熔解曲线；其中，A-H为不同浓度质粒标准品(从高到低依次为2.0×10⁹-2.0×10²copies/μL)；

图2为实施例1实时定量PCR的标准曲线；

图3为实施例1实时定量PCR的灵敏性试验；其中，1-9为不同浓度质粒标准品(从高到低依次为2.0×10⁹-2.0×10¹copies/μL)，10为无DNA酶水；

图4为梭子蟹肌孢虫质粒标准品的常规PCR扩增结果；其中，1-9为不同浓度质粒标准品(从高到低依次为2.0×10⁹-2.0×10¹copies/μL)，10为无DNA酶水；

图5为实施例1实时定量PCR的特异性试验；1为2×10⁶copies/μL质粒，2为“牙膏蟹”肌肉，3为WSSV，4为健康三疣梭子蟹肌肉，5为溶藻弧菌，6为副溶血弧菌，7为无DNA酶水。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

1引物

根据梭子蟹肌孢虫SSU rRNA序列设计了一对特异性引物，即：AP-F：5'-AACARATAGATAGGGGCAGTA-3'；AP-R：5'-TCTTCCGTCAATTTCTTTAA-3'。并经生工生物工程股份有限公司合成备用。

2样品处理与DNA提取

用采集的“牙膏蟹”制备梭子蟹肌孢虫悬浮液，制备方法参照文献【王元.脊尾白虾与三疣梭子蟹微孢子虫病的病原和病理[D]、王浩，王元，房文红等微孢子虫感染三疣梭子蟹的肌组织病理及其免疫相关酶活性[J].海洋渔业.2015,37(5):457-464.】.进行。随后，取1mL梭子蟹肌胞虫悬浮液，经5000rpm离心5min后去上清，沉淀孢子用作后续实验；

梭子蟹肌孢虫和三疣梭子蟹样品肌肉组织以及其他病原DNA的提取，分别参照文献^[1]和天根组织DNA提取试剂盒的操作说明书进行。其中，提取的肌肉样品DNA做10倍稀释后作为DNA模板。

3梭子蟹肌孢虫实时定量PCR方法

3.1反应体系

不同引物浓度的实时定量PCR扩增结果显示，当引物的终浓度为0.2μmol/L时，对同一标准品能获得较小的Ct值和较强的荧光信号强度，对不同标准品的扩增产物熔解曲线分别均为单一尖锐峰，而对阴性对照无扩增(图1)，因此，确定该浓度为引物最佳终浓度。如此经过一系列优化参数后，最终确定最佳梭子蟹肌孢虫实时荧光定量PCR反应体系为：总体积10μl，其中，2×SYBR Premix Ex Taq^TMⅡ5μl，1.0μmol/L上、下游引物各2μl，DNA模板1μl；当退火温度为60℃时，扩增效率和引物特异性最佳，因此，确定该实时定量PCR方法的最优扩增条件为：95℃30s预变性；然后，95℃5s，60℃20s，循环40次。

3.2标准曲线

运用优化好的实时定量PCR反应体系和条件，取浓度为2.0×10⁹-2.0×10²copies/μL的质粒标准品作为模板进行实时定量PCR扩增，获得本定量方法的标准曲线。如图2所示，该标准曲线的线性方程为Ct＝-3.26X+35.57(X为质粒拷贝数的对数)，相关系数R²＝0.999，表明标准曲线线性关系良好；由标准曲线斜率计算出反应扩增效率为101.45％，介于最优值范围内(95％-105％)；得到的组内的变异系数范围在0.35％-1.33％之内(表1)。以上系列标准品置于-80℃冰箱保存60天后，重复上述扩增，结果如表2所示，8个浓度梯度显著性分析结果P＞0.05，说明储存-80℃下60d和即时稀释的标准品扩增的标准曲线差异不显著。组内和组间重复性结果均表明，本实施例重复性好、稳定性高。

表1实时定量PCR检测不同浓度质粒标准品的组内重复性

表2实时定量PCR检测不同浓度质粒标准品的组间重复性

3.3方法敏感性

用浓度为2.0×10⁹-2.0×10¹copies/μL的质粒作为模板，用本实施例试剂盒检测，结果如图3所示。所有模板均有较强的荧光信号，并得到良好的“S”型扩增曲线。至模板浓度为20copies/μL时仍能有效扩增(Ct＝35)，符合荧光定量PCR扩增效率要求(Ct≤35)，表明此时的检测值仍在标准曲线的线性范围内。与此同时，把这些模板进行常规PCR扩增，发现当模板浓度为2.0×10³copies/μL时，扩增条带就开始不清晰(图4)。可见，本实施例具有更高的检测灵敏度。

3.4方法特异性

运用本实施例对典型“牙膏蟹”的肌肉DNA模板进行扩增后，获得了与质粒标准品类似的“S”形扩增曲线(图5-1，2)，而对其他样品如WSSV、健康梭子蟹肌肉、溶藻弧菌(图5-3,4,5)以及副溶血弧菌(图5-6)的DNA模板均为未出现明显的扩增曲线。检测结果表明，本实施例具有良好的病原特异性。

实施例2

分别运用此定量方法和梭子蟹肌孢虫套式PCR检测方法，对来自梭子蟹肌孢虫流行区的3组养殖三疣梭子蟹样品进行检测，结果如表3所示：套式PCR方法对梭子蟹肌孢虫的检出率为64.71％，而本实施例的检出率为82.35％，显示了梭子蟹肌孢虫实时定量PCR方法更高的灵敏度。检测结果显示，活蟹多数个体的带虫量很低甚至无虫，而死蟹大多带虫量很高，说明该地区梭子蟹的死亡与肌孢虫的感染密切相关；而且，活蟹与死蟹的最高带虫量分析表明，当梭子蟹肌孢虫载量达到1.0×10⁹copies/mg左右时就预示了三疣梭子蟹存在发生“牙膏病”甚至死亡的风险。

表3养殖三疣梭子蟹中梭子蟹肌孢虫的检测结果

注：+：阳性；-：阴性；D：死；A：活；Mu：肌肉。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院东海水产研究所

<120> 一种梭子蟹肌孢虫实时定量PCR检测试剂盒

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<170> PatentIn version 3.3

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tcttccgtca atttctttaa 20