疱疹病毒4、5型高灵敏定量检测试剂盒的制作方法

本发明涉及一种疱疹病毒4、5型高灵敏荧光定量PCR检测试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术：

疱疹病毒（Herpesviruses）是一群中等大小、有包膜的双链DNA病毒，已知有120多种，根据其理化性质分α、β、γ、未分类疱疹病毒四个亚科。它们可感染人类和其他脊椎动物，主要侵犯外胚层来源的组织，包括皮肤、粘膜和神经组织，其感染部位和引起的疾病多种多样，并有潜伏感染的趋向。现知感染人类的常见疱疹病毒有人类疱疹病毒1型、2型、3型、4型、5型、6型、7型、8型（HHV 1～8）这八种，它们引起人类各种疾病，还可以长期潜伏在人体组织中，当机体免疫功能低下时，特别是对白血病、免疫移植病人，潜伏的疱疹病毒活化形成复发感染，严重时引起移植器官坏死并危害病人生命，威胁人类健康。

大量的临床样本研究发现，人类疱疹病毒4型（HHV4，又称EB病毒，属于γ疱疹病毒亚科）和5型（HHV5，又称人巨细胞病毒，属于β疱疹病毒亚科）最常见，HHV4感染的靶细胞是淋巴样细胞，可引起淋巴增生；HHV5是最大的动物病毒，其生长周期长，感染细胞形成巨细胞。传统的疱疹病毒检测一般采用金标准病毒分离培养、血清学以及核酸检测方法，并各有优缺点。由于HHV4难于分离培养，HHV5生长周期长（30天），病毒分离培养法不适合临床实验室使用。血清学检测利用抗原抗体反应检测病毒相关蛋白，具有检测快速、简单、易于操作的优点，但检测灵敏度不高，由于感染后抗体产生“窗口期”，检测还存在一定的滞后性。核酸检测技术中，特别是荧光PCR方法具有特异性和灵敏度高、可定量、操作简便、成本较低等优点，在疱疹病毒检测中已经公开了很多技术方案（CN201110373390、CN201410026783、CN201410027036、CN201410028810、CN201610682298、CN201610841711、CN201610848377）。但值得注意的是，上述技术方案很多只是对疱疹病毒进行定性核酸检测，不能报告核酸定量结果，特别是方案中荧光PCR检测都没有使用内参照，当临床样本提取的核酸中含有PCR抑制物时，或者实验操作失误丢失核酸，将导致检测结果“假阴性”，引起漏检和误诊，延误患者治疗和恢复健康。

本发明基于上述技术背景，目的是设计筛选常见的疱疹病毒4、5型和内参照特异性引物探针，开发单管定量分型检测疱疹病毒4、5型核酸的荧光PCR试剂盒，满足临床对疱疹病毒4、5型感染快速、准确、定量检测的需求，为临床疱疹病毒感染的针对性治疗提供依据。

技术实现要素：

本发明提供一种高灵敏定量分型检测疱疹病毒4、5型核酸的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒同时采用一对疱疹病毒4型引物和荧光探针、一对疱疹病毒5型引物和荧光探针、一对内参照特异性引物和荧光探针，疱疹病毒4型上下游引物具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列、荧光探针具有SEQ ID NO：3序列且其5’端标记FAM荧光基团，疱疹病毒5型上下游引物具有SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的序列、荧光探针具有SEQ ID NO：6序列且其5’端标记ROX荧光基团，内参照上下游引物具有SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的序列、荧光探针具有SEQ ID NO：9序列且其5’端标记Cy5荧光基团。本发明引入的内参照可以用于监控PCR扩增中可能的反应抑制物、以及监控从核酸提取到扩增检测全过程的误操作，出现疱疹病毒、内参照双阴性的样本可通过稀释提取的模板或改进样本处理方法复检获得正确结果，从而避免检测漏检；试剂盒确定样本是否存在疱疹病毒4、5型核酸并准确载量，适合临床推广使用。

技术方案

通过对GenBank中疱疹病毒4、5型和人内源性管家（House-keeping）基因序列查询，用Vector NTI、Oligo等软件对各种来源的基因序列进行比对设计，按照TaqMan荧光PCR设计的原则，优选了一对疱疹病毒4型特异性引物和荧光探针扩增基因组中高度保守、多拷贝重复基因（BamHI-W）上的115bp片段，一对疱疹病毒5型特异性引物和荧光探针扩增基因组中高度保守的即可早期基因（IE2）中UL122区域的91bp片段，一对人GAPDH（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）基因特异性引物和荧光探针扩增其保守区域144bp片段，9条引物和探针核苷酸序列（5’ -> 3’）如下：

HHV4上游引物：CCCATAgACTCCCATgTAAgC，序列记为SEQ ID NO：1。

HHV4下游引物：CCCTggACATCTggACAAAg ，序列记为SEQ ID NO：2。

HHV4荧光探针：CgAgTAggTgCCTCCAgAgCC ，序列记为SEQ ID NO：3，其中探针5’端标记FAM（6-carboxy-fluorescein）荧光基团、3’端标记BHQ（Black hole quencher）淬灭基团。

HHV5上游引物：ACCCTgTTCTTCCTCgCTAT，序列记为SEQ ID NO：4。

HHV5下游引物：gCCCgAgCCCgACTTTA ，序列记为SEQ ID NO：5。

HHV5荧光探针：gATACAgCCggCggTATCgA ，序列记为SEQ ID NO：6，其中探针5’端标记ROX（5-Carboxy-X-rhodamine）荧光基团、3’端标记BHQ淬灭基团。

内参照上游引物：TgCTTTTAACTCTggTAAAgTgg ，序列记为SEQ ID NO：7。

内参照下游引物：ATgACAAgCTTCCCgTTCTC ，序列记为SEQ ID NO：8。

内参照荧光探针：TTgTTgCCATCAATgACCCCTTCA，序列记为SEQ ID NO：9，其中探针5’端标记Cy5（Cyanine 5）荧光基团、3’端标记BHQ淬灭基团。

本发明设计疱疹病毒4、5型以及内参引物探针具有非常接近的Tm值，且序列之间没有明显的引物二聚体或发夹结构，保证了三个靶序列扩增具有相近的扩增效率，有利于提高试剂盒检测灵敏度；上述引物探针序列也可以是和上述序列同源性大于85%以上的序列。

所述扩增反应体系各成分组成如下：10mM Tris-HCl（pH8.3）、50mM KCl、0.2～0.5mM dNTPs、1.5～5 mM MgCl₂、各0.1～0.5μM HHV4、HHV5和内参照引物和荧光探针（SEQ ID NO：1～9）、1～5 U Taq DNA聚合酶和0.01～1 U UNG酶，提取的模板10μl，总反应体积30μl。更具体的，扩增反应液各成分终浓度为：Tris-HCl（pH8.3）10 mM、KCl 50 mM、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.2 mM、MgCl₂ 3.5 mM、HHV4和HHV5引物和荧光探针（SEQ ID NO：1～6）各0.3 μM、内参照引物和荧光探针（SEQ ID NO：7～9）各0.15 μM、Taq DNA聚合酶2 U、UNG酶0.5 U。

所述疱疹病毒4、5型荧光定量PCR试剂盒使用扩增程序如下：50℃ 2min、94℃ 5min后按照94℃ 10sec、60℃ 45sec循环扩增45次，循环步骤中60℃时采集FAM、ROX和Cy5波长荧光信号。

所述疱疹病毒4、5型荧光定量PCR试剂盒包括1个阴性对照、1个阳性对照、以及4个线性梯度浓度的病毒核酸定量校准品，4个校准品HHV4、HHV5核酸浓度分别为5.0x10⁷copies/ml、5.0x10⁶ copies/ml、5.0x10⁵ copies/ml、5.0x10⁴ copies/ml，校准品为含有HHV4的SEQ ID NO：1～2、HHV5的SEQ ID NO：4～5引物对扩增靶基因串联序列的TA克隆质粒。阳性对照为含有该克隆质粒的大肠杆菌。

所述疱疹病毒4、5型荧光定量PCR试剂盒，采用基于磁珠法核酸梯度的病毒DNA提取试剂，在核酸提取仪上实现样本核酸自动化提取。

通过上述设计优选获得的一对疱疹病毒4、5型引物和荧光探针、一对内参照引物和荧光探针，本发明提供了实时荧光定量PCR检测的试剂盒，优化了PCR反应体系和扩增程序。当然本研究领域技术人员根据荧光PCR的一般要求可以调整PCR反应体系和程序，也同样能实现检测的目的。

有益效果

本发明根据上述设计的引物探针和技术方案，通过优化反应体系和扩增条件研制成疱疹病毒4、5型核酸荧光PCR定量检测试剂盒，其主要特点如下：

（1）设计的疱疹病毒4、5型引物探针Tm值接近且无交叉次级结构，引物扩增靶基因长度接近，保证了两种病毒有相近的扩增效率，不仅能对疱疹病毒准确分型，还提高了试剂盒检测疱疹病毒4、5型的灵敏度。

（2）引入的内参照能监控反应体系中是否存在因PCR抑制物等引起的假阴性，可以避免检测结果不准确造成的误诊。

（3）试剂盒使用了非竞争性内参，疱疹病毒4、5型和内参照基因序列特异、荧光探针采用不同荧光基团标记，荧光信号之间不会相互干扰，保证了检测特异性。

（4）扩增体系中的dUTP－UNG酶系统更进一步避免了因扩增产物污染导致的结果假阳性，和内参照联合使用后的起到“双质控作用”，提高了试剂盒检测结果的准确性。

（5）试剂盒采用磁珠法自动化提取样本核酸、单管同时检测疱疹病毒4、5型和内参照，避免了同一样本时对两种病毒需分两次检测的重复工作，且操作简便快速，可在2小时内报告检测结果，提高了工作效率。

试剂盒的上述特点，均为采用特异性设计的疱疹病毒4、5型和内参照引物探针并与荧光PCR技术组合应用而直接引起。从原理上说，本发明试剂盒在疱疹病毒4、5型病原体临床样本检测中通过对实时荧光PCR扩增三个通道荧光信号的分析，判断疱疹病毒4、5型核酸特异性片段的存在和病毒载量，本发明的技术方案设计合理，可以广泛应用于临床疱疹病毒4、5型感染的定量检测。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以通过技术常识对本发明作各种技术性改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1：疱疹病毒4、5型核酸荧光PCR定量检测试剂盒引物探针的设计

根据NCBI GenBank数据库中查询的HHV4、HHV5、GAPDH基因序列，采用Vector NTI、Oligo等引物设计软件，优选获得的引物探针序列如表1所示，HHV4引物扩增的是该病毒BamHI-W基因上115bp片段、HHV5引物扩增的是该病毒IE2基因上91bp片段、内参照引物扩增的是人GAPDH基因上的144bp片段。

表1 设计的试剂盒引物探针

以上引物探针委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

实施例2：疱疹病毒4、5型核酸荧光PCR定量检测试剂盒配制

试剂盒反应缓冲液为自行配制，按表2各组分浓度和体积配制32人份试剂盒反应缓冲液，配制的反应缓冲液每个反应分装用量为20μl，加入模板10μl后总反应体积为30μl。

表2 试剂盒反应缓冲液配制各组分体积

试剂盒阴性对照采用正常人阴性血浆；定量校准品为含有HHV4、HHV5扩增片段的克隆质粒，用TE缓冲液稀释到4个浓度作为试剂盒定量校准品：5.0x10⁷ copies/ml、5.0x10⁶copies/ml、5.0x10⁵ copies/ml、5.0x10⁴ copies/ml；阳性对照为含有上述克隆质粒的大肠杆菌，用人阴性血浆稀释到浓度为5.0x10³ copies/ml。

试剂盒病毒DNA提取试剂采用上海星耀医学科技发展有限公司研制的磁珠法病毒DNA提取试剂盒，它包括磁珠、裂解液、蛋白酶K、清洗缓冲液、洗脱缓冲液5个组分，使用时试剂盒阴性对照、阳性对照、标本均采用该试剂盒提取核酸。

试剂盒扩增程序为：50℃ 2min、94℃ 5min后按照94℃ 10sec、60℃ 45sec循环扩增45次，循环步骤中60℃时采集FAM、ROX和Cy5通道荧光信号。

通过上述配制的疱疹病毒4、5型核酸荧光PCR定量检测试剂盒组分包括：反应缓冲液、阴性对照、阳性对照以及4个定量校准品，要求-20℃保存和运输。

实施例3：试剂盒检测灵敏度的测定

（1）疱疹病毒DNA提取

取经临床鉴定、浓度已知的疱疹病毒4、5型阳性血浆，用正常人阴性血浆将两种病毒浓度调整到相同并等体积混合，混合样本中疱疹病毒4、5型浓度均为5x10⁴ copies/ml）。然后采用正常人阴性血浆将该混合样本10倍连续梯度稀释到5x10³ copies/ml、5x10² copies/ml、5x10¹ copies/ml，吸取上述病毒稀释液、试剂盒阴性对照、阳性对照各400μl，一起采用实施例2中的磁珠法病毒DNA提取试剂在核酸提取仪上进行病毒DNA提取，最后每个样品获得的核酸各50 μl。

（2）荧光PCR检测

将实施例2中试剂盒反应缓冲液从-20℃冰箱取出冻融、混匀、短暂离心，按20μl/人份将反应缓冲液分装到PCR反应管中，然后分别加入上述提取的试剂盒阴性对照、阳性对照、病毒稀释液提取的模板、以及无需核酸提取的定量校准品各10 μl。每个反应管体积为30μl，将上述反应管放到ABI7500荧光PCR仪上，设定每个反应管样本类型并设置定量校准品浓度值，按照50℃反应2分钟，然后94℃保温5分钟，再按 94℃10秒→60℃45秒 循环45次（在60℃采集FAM、ROX、Cy5荧光通道的信号）的反应程序运行。扩增结束后按照仪器软件和试剂盒说明书分析判断实验结果。

（3）结果分析

试剂盒对所有样品检测内参照均为阳性；阴性对照FAM和ROX通道检测结果为疱疹病毒4型、5型阴性，阳性对照检测结果为疱疹病毒4型、5型阳性，在FAM、ROX通道按浓度值分别设定疱疹病毒4型、5型定量校准品量值，校准品检测线性相关系数均大于0.98，符合试验质控要求。观察到5x10³ copies/ml、5x10² copies/ml、5x10¹ copies/ml浓度的混合样品梯度分别重复5次检测，疱疹病毒4型、5型结果均为阳性，因此可以确定试剂盒对疱疹病毒4型、5型的检测灵敏度可以达到5x10¹ copies/ml，试剂盒对两种病毒能正确分型和高灵敏定量检测。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海星耀医学科技发展有限公司

<120> 疱疹病毒4、5型高灵敏定量检测试剂盒

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<223> HHV4上游引物

<400> 1

cccatagact cccatgtaag c 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<223> HHV4下游引物

<400> 2

ccctggacat ctggacaaag 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<223> HHV4荧光探针

<221> 3

<222> (1)..(23)

<223> b=FAM; d=BHQ

<400> 3

bcgagtaggt gcctccagag ccd 23

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<223> HHV5上游引物

<400> 4

accctgttct tcctcgctat 20

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial

<223> HHV5下游引物

<400> 5

gcccgagccc gacttta 17

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<223> HHV5荧光探针

<221> 6

<222> (1)..(22)

<223> b=ROX; d=BHQ

<400> 6

bgatacagcc ggcggtatcg ad 22

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<223> 内参照上游引物

<400> 7

tgcttttaac tctggtaaag tgg 23

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<223> 内参照下游引物

<400> 8

atgacaagct tcccgttctc 20

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<223> 内参照荧光探针

<221> 9

<222> (1)..(26)

<223> b=Cy5; d=BHQ

<400> 9

bttgttgcca tcaatgaccc cttcad 26