一种用于丝状支原体山羊亚种的荧光定量PCR检测引物的制作方法

本发明涉及一种用于丝状支原体山羊亚种的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测引物，属于分子生物学领域。

背景技术：

丝状支原体山羊亚种是丝状支原体簇的成员之一，是羊支原体性肺炎的病原之一。羊支原体性肺炎的潜伏期平均为18-20d，最快3-6d，最长为30-40d。其临床特征主要表现为高热、咳嗽渐进性消瘦以及肺实质、小叶间质及胸膜发生浆液性和纤维素性炎症，肺部有明显的肝变为主要特征的呼吸道疾病，此外还可引起乳房炎、角膜结膜炎和败血病等。该病的发病率为19%-90%，死亡率高达40%。当前国内贵州、重庆、内蒙古、青海、广西、福建等地均有该病发生的报道。

目前羊支原体性肺炎的诊断方法较少，这主要是由于丝状支原体山羊亚种属于丝状支原体簇成员，丝状支原体簇成员之间同源性较高，血清学上有交叉反应。当前已建立的诊断方法主要有病原分离培养鉴定、聚合酶链式反应等。前者费时费力，后者不能定量。SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR是在普通PCR的基础上，在反应体系中加入荧光染料，利用荧光PCR检测仪来检测靶核苷酸序列的技术，具有特异性强、定量准确、灵敏度高等优点。通过查阅文献发现，当前国内外尚未有针对丝状支原体山羊亚种检测的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。本发明的建立可以填补该领域的空白。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于丝状支原体山羊亚种的荧光定量PCR检测引物。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于丝状支原体山羊亚种的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测引物，引物的核苷酸序列为：

上游引物：5’- TGTTGTTGGTGGGTCTGCTT-3’，

下游引物：5’- ACTTTATCAGCCGCCATTTGA-3’，

其目的扩增片段为117 bp。

利用本发明的引物可用于对丝状支原体山羊亚种的相应基因进行检测，尤其适用于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术的检测。通过对反应体系和反应条件的各种优化，建立了一套可用于检测丝状支原体山羊亚种的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。具体操作方法如下：

1、引物设计：根据GenBank上公布的丝状支原体山羊亚种FQ377874.1基因组序列，利用Primer 6.0 软件对MLC_1770基因序列进行引物设计，采用BLAST工具进行检索，初步验证其特异性。

2、反应体系的优化：优化出的25μL最佳反应体系为：SYBR^® Premix Ex Taq^TM(TIiRNaseH Plus) 12.5μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5μL，模板2μL，水补足至25μL。最佳反应条件为：95℃，30s 预变性；95℃，5s，60℃，30s，共40 个循环。

3、阳性标准品的制备：取1 mL丝状支原体山羊亚种培养液加入1.5 mL离心管中，10000r/min离心3min，弃上清收集菌体，使用生工组织DNA提取试剂盒提取DNA，利用蛋白质核酸仪测定其浓度，换算成拷贝数，作为阳性标准品备用。

4、标准曲线的建立：以优化的反应体系进行PCR扩增，以拷贝数为横坐标，以Ct值为纵坐标建立标准曲线，判断阳性的标准。

该方法可用于丝状支原体山羊亚种的病原诊断和流行病学调查，为疾病的早期防治提供检测方法。

有益效果：

本发明根据GenBank登录的FQ377874.1的MLC_1770基因序列，设计特异性引物，于国内外首先建立丝状支原体山羊亚种的实时荧光定量PCR方法，该方法特异性好、灵敏度高、重复性好，可用于检测临床样品中丝状支原体山羊亚种的含量。

附图说明

图1丝状支原体山羊亚种SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的扩增曲线。

图2 为丝状支原体山羊亚种的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的标准曲线。

具体实施方式

实施例1 丝状支原体山羊亚种的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR 方法的建立

一、材料：

丝状支原体山羊亚种（GenBank 登录号：KU870648）

山羊支原体山羊肺炎亚种由中国科学院兰州研究所馈赠，大肠杆菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、副猪嗜血杆菌等由福建省农业科学院畜牧兽医研究所禽病实验室和猪病实验室馈赠；绵肺炎支原体、羊口疮病毒为本科室分离、保存。

二、步骤

1、仪器与试剂：Mastercyclereprealplex荧光定量PCR 仪购自eppendorf公司；SYBR^® Premix Ex Taq^TM (TIi RNaseH Plus)、DL2000 Marker 均购自宝生物工程（大连）有限公司；荧光定量PCR管购自Axygen。

2. 引物的特异性

引物的特异性是本实验所建立方法的最重要因素。根据GenBank登录的FQ377874.1的MLC_1770基因序列，通过比对分析，设计引物。

3、阳性标准品的制备

以提取的DNA为模板，取1 mL丝状支原体山羊亚种培养液加入1.5 mL离心管中，10000r/min离心3min，弃上清收集菌体，使用生工组织DNA提取试剂盒提取DNA，利用蛋白质核酸仪测定其浓度，换算成拷贝数，作为阳性标准品备用。

4、反应条件的优化

采用25μL反应体系SYBR^® Premix Ex Taq^TM(TIiRNaseH Plus) 12.5μL，PCR上游引物（10μmol/L）0.5μL，PCR 下游引物（10μmol/L）0.5μL，倍比稀释后的阳性标准品2μL，补水至终体积25μL，以出现最小的Ct 值以及在熔解曲线分析中不出现非特异性峰为指标，分别对退火温度（55～68℃）和引物浓度（0.2～1.0μmol/L）进行优化。

将阳性标准品进行连续10倍系列稀释（10^-1～10^-8），以优化的条件进行扩增，以拷贝数为横坐标，以Ct 值为纵坐标建立标准曲线。

对阳性标准品的扩增曲线和标准曲线显示，SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR 方法对丝状支原体山羊亚种的CT与拷贝数在1.12×10²～1.12×10⁹拷贝/ 反应范围内有很好的线性关系，相关系数为0.996，扩增效率为162%。扩增曲线见图1，标准曲线见图2。

5、特异性检测

5.1 特异性检测

用优化的条件分别检测山羊支原体山羊肺炎亚种，大肠杆菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、副猪嗜血杆菌、绵肺炎支原体、羊口疮病毒核酸样品进行检测，对其特异性进行评价。检测结果均为阴性。

5.2 可重复性及再现性评估

对同一阳性标准品设3个重复管，用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR 进行检测，评价其重复性，

计算组内变异系数；将阳性标准品置于-20℃冰箱保存，分别于第7、14、21d 重检，评价其再现性，计算其组间变异系数。计算得组内变异系数为0.60%～2.46%，组间变异系数为1.07%～2.67%，可重复性好。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种用于丝状支原体山羊亚种的荧光定量PCR检测引物

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

actttatcag ccgccatttg a 21