口蹄疫病毒RT－LAMP检测试剂盒的制作方法

本实用新型属于疫病检测技术领域，具体是一种口蹄疫病毒RT-LAMP检测试剂盒，可用于动物口蹄疫病毒的检测。

背景技术：

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV）引起的以口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱性疹为主要症状的急性、烈性、接触性传染病,又称为“口疮”、“辟癀”“5号病”等。FMDV主要侵害猪、牛、羊等主要家畜和其他家养、野生偶蹄动物，宿主范围广泛，易感动物多达70多种。该病传播途径多，速度快。大多数国家都属于“口蹄疫疫区”，非口蹄疫的国家或区域仅占少数。2013 年，全球口蹄疫疫情集中在亚、非地区以及与亚洲相邻的欧洲部分地区暴发，全球共有 44 个国家或地区报告发生口蹄疫疫情或分离到口蹄疫病毒。多次世界范围内的暴发流行，造成巨大的政治、经济损失。

FMDV属于微RNA 病毒科（Picornaviridae）的口蹄疫病毒属（Aphthovirus），与所有微RNA 病毒一样含有单股正链 RNA 基因组，其长度约 8300nt，其功能如同 mRNA，编码病毒聚蛋白。FMDV包括A 型、O型、C型、亚洲I（Asia1）型、SATⅠ型、SATⅡ型和SATⅢ型7个血清型，每个血清型又有许多不同的亚型，各血清型之间没有交叉性免疫，同一血清型的各亚型之间仅有部分交叉免疫，使得口蹄疫的诊断和防控更加困难。在我国，口蹄疫的流行形势比较严峻，目前仅分离得到 A 型、O 型和Asia 1 型。近年来，A 型和O型口蹄疫疫情不断发生，给养殖户造成重大的经济损失。不同血清型、不同遗传谱系口蹄疫病毒的混杂存在及周边国家口蹄疫疫情复杂、流行毒株跨境传播的威胁，进一步加大了我国口蹄疫防控的复杂性和难度。因此，建立一种快速检测口蹄疫病毒及区分血清型的方法有助于该病的防控和诊治。在动物及其副产品的进出口检疫中也有着重要意义。

技术实现要素：

鉴于以上缺陷，本实用新型的目的是提供一种检测灵敏度高、检测快速的口蹄疫病毒RT-LAMP检测试剂盒，且试剂盒在运输过程中对试剂管有更好的稳固效果，在使用中拿取更方便。

为了实现上述目的本实用新型采用如下技术方案：口蹄疫病毒RT-LAMP检测试剂盒，包括盒体，与盒体后侧面连接的盒盖，试剂管固定座和试剂管稳固结构，其中所述试剂管固定座为上、下、前和后四个壁组成的方形管状结构，在所述上壁设置有反应液管存放孔Ⅰ、反应液管存放孔Ⅱ、酶溶液管存放孔、阳性对照管存放孔、阴性对照管存放孔和DEPC水管存放孔，在所述试剂管固定座的上方设置试剂管稳固结构，所述试剂管稳固结构设置有与反应液管存放孔Ⅰ、反应液管存放孔Ⅱ、酶溶液管存放孔、阳性对照管存放孔、阴性对照管存放孔和DEPC水管存放孔相对应的稳固孔。

具体地，所述试剂管稳固结构的上表面设置有说明书存放槽，用于存放操作说明书。

所述试剂管固定座的两相对的边上设置有半圆形缺口，在使用过程中便于将试剂管固定座取出，进行实验时便于试剂管的取放。

所述试剂管稳固结构的两相对的边上设置有凹槽，便于使用时取出试剂管稳固结构。

本实用新型发明的优点是：（1）试剂盒简便、易保存、取用试剂方便；（2）不需要特殊的试剂与设备；（3）特异性好：应用六个区域，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，阳性率可达99.2%，假阳性率小于0.1%；（4）快速、高效简便的扩增，整个检测时间仅需要1小时；（5）鉴定简便，可通过肉眼可视化观察检测结果，无需电泳等其他分析步骤，阳性结果为绿色，阴性结果为橙色；（6）操作简便实用，可广泛应用于基层口岸临床口蹄疫病毒筛查。

附图说明

本实用新型的装置可以通过附图给出的非限定性实施例进一步说明。

图1为本实用新型的俯视结构示意图（不含试剂管稳固结构）；

图2为本实用新型的纵切面结构示意图；

图中：1-盒体，2-试剂管固定座，3-试剂管稳固结构，4-盒盖，5-反应液管存放孔Ⅰ，6-反应液管存放孔Ⅱ，7-酶溶液管存放孔，8-阳性对照管存放孔，9-阴性对照管存放孔，10-DEPC水管存放孔，11-半圆形缺口，12-说明书存放槽，13-凹槽，14-稳固孔。

具体实施方式

下面结合附图对本实用新型做进一步说明。但是应该理解，这些描述只是示例的，而非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略的对公知结构和技术的描述，以避免不要混淆本发明的概念。

参见图1和图2，口蹄疫病毒RT-LAMP检测试剂盒，包括盒体1，与盒体1后侧面连接的盒盖4，其特征在于：还包括试剂管固定座2和试剂管稳固结构3，其中所述试剂管固定座2为上、下、前和后四个壁组成的方形管状结构，在所述上壁设置有反应液管存放孔Ⅰ5、反应液管存放孔Ⅱ6、酶溶液管存放孔7、阳性对照管存放孔8、阴性对照管存放孔9和DEPC水管存放孔10，反应液管存放孔Ⅰ5和反应液管存放孔Ⅱ6中存放反应液管5’，酶溶液管存放孔7中存放酶溶液管，阳性对照管存放孔8中存放阳性对照管，阴性对照管存放孔9中存放阴性对照管9’，DEPC水管存放孔10中存放DEPC水管10’。在所述试剂管固定座2的上方设置试剂管稳固结构3，所述试剂管稳固结构3设置有与反应液管存放孔Ⅰ5、反应液管存放孔Ⅱ6、酶溶液管存放孔7、阳性对照管存放孔8、阴性对照管存放孔9和DEPC水管存放孔10相对应的稳固孔14，使试剂管在试剂盒中更稳固，便于运输。

所述试剂管稳固结构3的上表面设置有说明书存放槽12，用于存放操作说明书。所述试剂管固定座2的两相对的边上设置有半圆形缺口11。所述试剂管稳固结构3的两相对的边上设置有凹槽13。使得试剂管固定座2和试剂管稳固结构3更容易取出。

试剂盒的盒体1、盒盖4、试剂管固定座2和试剂管稳固结构3均由纸板制成。

两支反应液管所含有组分均一致，均包括口蹄疫病毒内引物、外引物、环引物、2*LAMP Buffer缓冲液、钙黄绿素溶液；酶溶液管含有5U/μL Bst DNA聚合酶和反转录酶的混合液；阳性对照管，管内为口蹄疫病毒阳性重组质粒DNA；阴性对照管，管内为无口蹄疫病毒感染的健康牛血清基因组DNA;DEPC水管，管内为无RNA酶的DEPC水。

具体的检测步骤为：1）制备待检测样本的模板RNA，选用商品化的病毒RNA提取试剂盒，提取待测样本中的病毒RNA。2）扩增体系为：20μL扩增反应液，2μL酶混合液，3μL待检测样本模板RNA或阳性对照或阴性对照，反应总体积为25μL；3）将配制好的步骤2）中的扩增反应体系的PCR管置于63 ℃恒温反应60 min，80℃反应10 min终止反应。4）结果判定：反产物显现绿色则为阳性，橙色则为阴性。