本发明涉及一种检测用试剂盒，特别是一种鲤疱疹病毒Ⅱ型夹心ELISA检测试剂盒，本发明还涉及利用该检测试剂盒进行检测的方法。
背景技术：
：近年来，鲤疱疹病毒Ⅱ型（英文名称：CyprinidherpesvirusⅡ，缩写CyHV-2）给我国鲫鱼和金鱼养殖业带来了巨大的危害，疫病爆发时发病率和死亡率极高，经不完全统计，2006年因该病造成的经济损失高达7.18亿元。现有技术中，对其诊断最直观的方法是对发病鱼组织进行组织学检查后再经电子显微镜观察到疱疹病毒粒子进行确证。目前国内外常用PCR或定量PCR方法检测鲤疱疹病毒Ⅱ型，疱疹病毒存在潜伏感染，外表健康的鱼可能携带病毒，PCR方法能够检测到病毒核酸，但无法确认鱼体内是否存在传染性的病毒粒子，因此有必要建立检测病毒蛋白的免疫学方法。因此，建立检测鲤疱疹病毒Ⅱ型病毒蛋白的夹心ELISA方法对于监控鱼的潜伏感染具有重要意义。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的鲤疱疹病毒Ⅱ型夹心ELISA检测试剂盒，可以用于出入境水生动物检疫和国内养殖场的疫情监控。本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种鲤疱疹病毒Ⅱ型夹心ELISA检测试剂盒，其特点是，该试剂盒的主要组成为：鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF90纯化单抗溶液，1支100μL，为鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF90纯化单抗溶于水制成的溶液，浓度为10-20mg/mL；酶标ORF90多抗溶液，1支100μL，为酶标ORF90多抗溶于水制成的溶液，浓度为10-20mg/mL；稀释液，2瓶，每瓶50mL，溶液为质量体积浓度为10g/L的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；TMB底物溶液，1支，250μL；为TMB的DMSO溶液，其质量体积浓度为6mg/mL；终止液，浓度为2M的硫酸溶液1瓶，20mL；鲤疱疹病毒2型阳性对照1支，500μL，为金鱼阳性组织匀浆；阴性对照1支，500μL，为阴性金鱼组织匀浆；包被液，1瓶，20mL，为含有0.015M碳酸钠和0.035M碳酸氢钠的水溶液；96孔酶标板，1块。本发明所述的一种鲤疱疹病毒Ⅱ型夹心ELISA检测试剂盒，其进一步优选的技术方案是：该试剂盒中，所述的磷酸盐缓冲液的重量体积比组成为：氯化钠8.0g磷酸二氢钾0.2g十二水合磷酸氢二钠2.9g氯化钾0.2g吐温-800.5mL双蒸水1000mL。本发明所述的一种鲤疱疹病毒Ⅱ型夹心ELISA检测试剂盒，其进一步优选的技术方案是：该试剂盒中还包括：磷酸盐缓冲液PBST，1瓶50mL，其质量体积比组成为：氯化钠8.0g磷酸二氢钾0.2g十二水合磷酸氢二钠2.9g氯化钾0.2g吐温-800.5mL双蒸水1000mL。本发明所述的一种鲤疱疹病毒Ⅱ型夹心ELISA检测试剂盒，其进一步优选的技术方案是：该试剂盒还包括：过氧化脲溶液，1瓶100mL，由过氧化脲与乙酸钠-柠檬酸缓冲液混合制成；其中，乙酸钠-柠檬酸缓冲溶液的制法是：将17mL质量体积浓度为94g/L的柠檬酸溶液加入到500mL质量体积浓度为81g/L的乙酸钠溶液中，混合均匀制得；过氧化脲溶液的制法如下：称取140mg过氧化脲，并将其加入到100mL乙酸钠-柠檬酸缓冲溶液中，混合均匀制得。本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。本发明还公开了一种鲤疱疹病毒Ⅱ型夹心ELISA检测方法，其特点是，该方法使用以上技术方案所述的试剂盒进行检测，其步骤如下：（1）将试剂盒中的鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF90纯化单抗溶液用稀释液稀释到10μg/mL，100μL/孔包被酶标板，4℃过夜；（2）用磷酸盐缓冲液PBST洗板，250μL/孔，洗涤三遍；（3）加入稀释液封闭酶标板，200μL/孔，37℃反应2h；（4）用磷酸盐缓冲液PBST洗板，250μL/孔，洗涤三遍；（5）将待检测样品、阳性和阴性对照用稀释液按照1:10稀释，100μL/孔加入酶标板中，25℃反应0.5h；（6）用磷酸盐缓冲液PBST洗板，250μL/孔，洗涤三遍；（7）将酶标ORF90多抗溶液用稀释液按1:1000稀释，100μL/孔，加入酶标板中，25℃反应0.5h；（8）取TMB底物溶液1支，加入18mL双蒸水和2mL过氧化脲溶液配制成工作溶液，100μL/孔加入酶标板，25℃反应15min；（9）加50μL/孔终止液，在450nm测定光密度（OD）值；（10）结果判定：P/N≥2.1，表明对照成立，其中：P为阳性对照OD值，N为阴性对照OD值；当样品OD值/阴性对照OD值≥2.1时，判为鲤疱疹病毒Ⅱ型阳性；样品OD值/阴性对照OD值＜2.1时，判为鲤疱疹病毒Ⅱ型阴性。本发明试剂盒中，所述的鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF90纯化单抗和酶标ORF90多抗购自青岛瑞尔生物技术有限公司，产品名分别为：鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF90纯化单抗，酶标ORF90多抗。公司地址：山东省青岛市海尔路63号青岛数码科技中心B-715，电话：0532-80999085。鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF90纯化单抗和酶标ORF90多抗是通过原核表达鲤疱疹病毒2型ORF90蛋白后免疫动物制备的，其中单抗为IgG1型，多抗为IgG2a型。与现有技术相比，本发明提供了一种新的鲤疱疹病毒Ⅱ型夹心ELISA检测试剂盒，可以用来检测鲤疱疹病毒Ⅱ型。本发明还建立了夹心ELISA检测方法，确定了夹心ELISA方法的最佳包被浓度、标记抗体的最佳工作浓度、最佳封闭时间和抗原抗体的最佳反应时间，为该病毒的检测提供了有效的方法。本发明方法可用于无临床症状的潜伏感染鱼病毒检测，并可进一步应用于鲤疱疹病毒Ⅱ型在鱼体内变化规律的研究，从而为该病毒的防控提供依据。本发明方法与鲫鱼、金鱼的其它常见病毒无非特异性反应，可以用于国内养殖场的疫病诊断和出入境鱼类检疫。具体实施方式以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。实施例1，一种鲤疱疹病毒Ⅱ型夹心ELISA检测试剂盒，该试剂盒的主要组成为：鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF90纯化单抗溶液，1支100μL，为鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF90纯化单抗溶于水制成的溶液，浓度为10-20mg/mL；酶标ORF90多抗溶液，1支100μL，为酶标ORF90多抗溶于水制成的溶液，浓度为10-20mg/mL；稀释液，2瓶，每瓶50mL，溶液为质量体积浓度为10g/L的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；TMB底物溶液，1支，250μL；为TMB的DMSO溶液，其质量体积浓度为6mg/mL；终止液，浓度为2M的硫酸溶液1瓶，20mL；鲤疱疹病毒2型阳性对照1支，500μL，为金鱼阳性组织匀浆；阴性对照1支，500μL，为阴性金鱼组织匀浆；包被液，1瓶，20mL，为含有0.015M碳酸钠和0.035M碳酸氢钠的水溶液；96孔酶标板，1块。实施例2，实施例1所述的一种鲤疱疹病毒Ⅱ型夹心ELISA检测试剂盒中：所述的磷酸盐缓冲液的重量体积比组成为：氯化钠8.0g磷酸二氢钾0.2g十二水合磷酸氢二钠2.9g氯化钾0.2g吐温-800.5mL双蒸水1000mL。实施例3，实施例1或2所述的一种鲤疱疹病毒Ⅱ型夹心ELISA检测试剂盒中：该试剂盒中还包括：磷酸盐缓冲液PBST，1瓶50mL，其质量体积比组成为：氯化钠8.0g磷酸二氢钾0.2g十二水合磷酸氢二钠2.9g氯化钾0.2g吐温-800.5mL双蒸水1000mL。实施例4，实施例1或2或3所述的一种鲤疱疹病毒Ⅱ型夹心ELISA检测试剂盒中：该试剂盒还包括：过氧化脲溶液，1瓶100mL，由过氧化脲与乙酸钠-柠檬酸缓冲液混合制成；其中，乙酸钠-柠檬酸缓冲溶液的制法是：将17mL质量体积浓度为94g/L的柠檬酸溶液加入到500mL质量体积浓度为81g/L的乙酸钠溶液中，混合均匀制得；过氧化脲溶液的制法如下：称取140mg过氧化脲，并将其加入到100mL乙酸钠-柠檬酸缓冲溶液中，混合均匀制得。实施例5．一种鲤疱疹病毒Ⅱ型夹心ELISA检测方法，该方法使用实施例1或2或3或4所述的试剂盒进行检测，其步骤如下：（1）将试剂盒中的鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF90纯化单抗溶液用稀释液稀释到10μg/mL，100μL/孔包被酶标板，4℃过夜；（2）用磷酸盐缓冲液PBST洗板，250μL/孔，洗涤三遍；（3）加入稀释液封闭酶标板，200μL/孔，37℃反应2h；（4）用磷酸盐缓冲液PBST洗板，250μL/孔，洗涤三遍；（5）将待检测样品、阳性和阴性对照用稀释液按照1:10稀释，100μL/孔加入酶标板中，25℃反应0.5h；（6）用磷酸盐缓冲液PBST洗板，250μL/孔，洗涤三遍；（7）将酶标ORF90多抗溶液用稀释液按1:1000稀释，100μL/孔，加入酶标板中，25℃反应0.5h；（8）取TMB底物溶液1支，加入18mL双蒸水和2mL过氧化脲溶液配制成工作溶液，100μL/孔加入酶标板，25℃反应15min；（9）加50μL/孔终止液，在450nm测定光密度（OD）值；（10）结果判定：P/N≥2.1，表明对照成立，其中：P为阳性对照OD值，N为阴性对照OD值；当样品OD值/阴性对照OD值≥2.1时，判为鲤疱疹病毒Ⅱ型阳性；样品OD值/阴性对照OD值＜2.1时，判为鲤疱疹病毒Ⅱ型阴性。实施例6．一种鲤疱疹病毒Ⅱ型夹心ELISA检测方法实验：1.1单抗-多抗夹心ELISA方法最佳包被浓度鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF90纯化单抗（下称单抗或ORF90单抗）溶液分别以5μg/mL，10μg/mL包被酶标板，4oC过夜。加入稀释液封闭，200μL/孔，37oC2h，PBST洗三遍。将酶标ORF90多抗（下称多抗或ORF90多抗）从1:250开始倍比稀释，100μL/孔加入酶标板中，室温反应1h。加酶标抗体：将酶标ORF90多抗溶液分别按照1:5000和1:10000稀释，100μL/孔，加入酶标板中，25℃反应1h。加TMB底物，25℃作用10min。加50μL/孔终止液，在450nm测定OD值。根据表1，选择10μg/mL包被浓度最好。表13.2单抗-多抗夹心ELISA方法标记抗体工作浓度的确定在10μg/mL单抗包被的情况下，将标记抗体稀释1000倍和2500倍进行了实验，检测结果(表2)显示标记抗体选择1000倍稀释进行实验。表23.3单抗-多抗夹心ELISA方法检测ORF90蛋白最大稀释度用核酸蛋白检测仪检测ORF90的浓度为1.63mg/mL。将纯化的单抗10μg/mL包被板，ORF90蛋白从1:250开始倍比稀释，检测的最低稀释度为1:8000(表3)。表3ORF90检测蛋白的最大稀释度3.4单抗-多抗夹心ELISA方法最佳封闭时间和抗原抗体最佳反应时间将纯化的ORF90单抗10μg/mL包被板，4℃过夜，用含1%BSA的PBST封闭板，150μL/孔，37℃放置0.5、1、2h，结果显示2h为最佳封闭时间（表4）。包被抗体和抗原、检测抗体和抗原分别于室温（25℃）反应0.5、1和1.5h，结果显示0.5h为抗原抗体的最佳反应时间（表5）。表4ORF90单抗-多抗夹心ELISA最佳封闭时间封闭时间阳性匀浆阴性对照P/N37℃0.5h0.2640.1811.46137℃1h0.3370.1222.76937℃2h0.4520.1293.517表5ORF90单抗-多抗夹心ELISA抗原抗体最佳反应时间反应时间阳性匀浆阴性对照P/N0.5h1.0050.2923.4411h0.8480.6511.3031.5h1.1400.5542.0583.5单抗-多抗夹心ELISA方法特异性试验用建立的ORF90单抗-多抗夹心ELISA同时检测鲤疱疹病毒2型组织匀浆和其它几种鱼病毒的病毒细胞悬液，包括：鲤春病毒血症病毒(SVCV)、流行性造血器官坏死(EHNV)、传染性造血器官坏死(IHNV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、传染性胰脏坏死病毒（IPNV）、传染性鲑鱼贫血病(ISAV)、草鱼出血病病毒（GCHV），结果显示该方法检测鲤疱疹病毒2型为阳性，其它病毒都为阴性(表6)，说明特异性较好。表6.CyHV-2ORF90单抗-多抗夹心ELISA的特异性试验病毒OD值P/NSVC0.0920.865EHNV0.0990.924IHNV0.0860.801KHV0.1161.086IPNV0.1030.961ISAV0.0900.854GCHV0.1111.041肾10.3062.868肾20.3343.126阴性对照0.107空白对照0.0603.6样品检测取40份无临床症状的金鱼组织匀浆用本研究建立的ORF90单抗-多抗夹心ELISA方法检测，同时提取核酸进行PCR检测，结果显示本方法能够检出阳性样品18份，而PCR方法检出阳性样品15份，表明对于无临床症状的携带病毒的鱼，本研究建立的夹心ELISA方法检测优于PCR方法，适用于出入境鱼类检疫和养殖场的日常疫病监控。表7.ORF90单抗-多抗夹心ELISA检测金鱼组织匀浆检测结果样品编号OD值样品编号OD值样品编号OD值样品编号OD值样品编号OD值12.60998.079171.164251.897331.19321.751101.461181.496262.935343.28933.077112.953193.446271.123352.27643.012121.279201.735281.575361.54152.903132.093212.990292.356371.03562.366144.224221.238301.173381.40171.271152.279231.625312.175392.78481.578161.847241.900321.290401.161表8PCR检测金鱼组织匀浆结果样品编号结果样品编号CT值样品编号CT值样品编号CT值样品编号CT值1阳性9阳性17阴性25阴性33阴性2阴性10阴性18阴性26阳性34阴性3阳性11阳性19阳性27阴性35阴性4阳性12阴性20阴性28阴性36阴性5阳性13阳性21阳性29阳性37阴性6阳性14阳性22阴性30阴性38阴性7阴性15阳性23阴性31阳性39阴性8阴性16阴性24阴性32阴性40阴性3.7试剂稳定性试验将制备的抗体放−20oC保存，在6个月后取出进行夹心ELISA试验检测纯化蛋白，结果显示OD值没有明显变化(表9)，说明试剂稳定性较好。表9单抗包被-多抗检测夹心ELISA检测当前第1页1 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