检测寨卡病毒的试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及PCR检测
技术领域：
，特别是涉及用于检测寨卡病毒的靶序列、荧光定量PCR引物和探针，本发明还涉及利用该靶序列进行寨卡病毒检测的方法和试剂盒。
背景技术：
：寨卡病毒病(ZikaVirusDisease)是由寨卡病毒(ZikaVirus)引起并通过蚊媒传播的一种疾病，主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播。寨卡病毒属黄病毒科，黄病毒属，单股正链RNA病毒，直径20nm，是一种通过蚊虫进行传播的虫媒病毒，宿主主要为鸟类、啮齿类和哺乳动物。临床特征主要为发热、皮疹、关节痛或结膜炎，极少引起死亡。世界卫生组织(WHO)认为，新生儿小头畸形、格林-巴利综合征(吉兰-巴雷综合征)可能与寨卡病毒感染有关。带病毒的伊蚊叮咬是本病最主要的传播途径。亦可通过母婴传播，包括宫内感染和分娩时感染。乳汁中可检测到寨卡病毒核酸，但尚无通过哺乳感染。2015年5月，巴西出现寨卡疫情截至2016年7月，全球共有70多个国家有寨卡病毒传播的证据。寨卡疫情期间，巴西新生儿小头畸形病例数量显著增加，研究证明新生儿小头畸形与妊娠期感染寨卡病毒相关。由于寨卡病毒与登革热、西尼罗河病毒和黄热病等其他黄病毒会发生交叉反应，因此通过血清学方法做出诊断可能较为困难。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和血中病毒分离培养可以确诊。起病7天内，如果检测到外周血清中寨卡病毒RNA阳性可以诊断，但由于RT-PCR阳性窗比较短(3-7天)，也就是病毒血症期短，因此阳性窗之外阴性结果不能除外感染。荧光定量PCR法具有特异性强，灵敏度高，定量准确、重复性好，检测时间短等诸多优点，可以作为实验室诊断寨卡病毒感染与定量测定寨卡病毒培养物浓度的重要工具。技术实现要素：本发明的目的在于提供用于检测寨卡病毒的特异、灵敏、快速、简便的方法以及检测试剂盒。寨卡病毒包括E、M和C三种结构蛋白和7种非结构蛋白，分别为NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5。这些结构蛋白起到控制着病毒的复制，抑制免疫反应的作用。本发明提供的寨卡病毒荧光定量PCR试剂盒，能特异性地检测寨卡病毒NS4基因。为实现上述目的，本发明通过对NCBI数据库已报道的寨卡病毒基因序列比对，找到了寨卡病毒NS4基因的保守靶序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。此外，本领域技术人员应当理解，该序列的特异性片段也可以作为检测寨卡病毒的遗传标记物。本发明根据该保守序列，通过反复对比、筛选，设计了用于检测该遗传标志物的特异性引物对和探针。在本发明的一个实施方式中，优选的特异性引物对的序列为：上游引物序列为：5'-GGAGTCCCGCTGCTAATGAT-3'下游引物序列为：5'-TAGTGCGCCACGAGCAAA-3'荧光探针序列为：(FAM)5’-TTAACGCCCCTGACCCTAATAGTGGCCA-3’(TAMRA)。本发明提供了在制备检测寨卡病毒试剂盒中的应用。进一步地，本发明提供了含有上述特异性引物对的试剂盒。进一步地，本发明提供了含有上述特异性引物对和荧光探针的试剂盒。含有上述特异性引物对和荧光探针的试剂盒可通过Taqman法荧光定量PCR实现对寨卡病毒的特异、快速检测。具体地，该试剂盒基于实时荧光定量PCR方法，利用SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的特异性引物对和SEQIDNO.3所示的荧光探针进行实时荧光定量PCR，检测待测样本中的寨卡病毒。本发明中用于荧光定量PCR扩增的最佳反应温度和时间为：42℃反转录5min，93℃预变性30s；95℃变性5s，60℃荧光检测34s，40个循环。TaqManPCR反应体系中，最佳的引物浓度为0.30～0.34umol/L、探针浓度为0.20～0.25umol/L样品Ct值<30为寨卡病毒阳性，样品Ct值>30且无s型扩增曲线为寨卡病毒阴性，阳性样品根据标准曲线可计算出寨卡病毒拷贝数。本发明提供了上述两种试剂盒在生物制品质量检测中的应用。本发明提供了一种检测生物制品中寨卡病毒的方法，以待测生物制品样本为模板，利用SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的特异性引物对和SEQIDNO.3所示的荧光探针进行Taqman荧光定量PCR，检测待测生物制品样本中的寨卡病毒本发明提供的试剂盒，还包括RT-PCR反应液、荧光定量反应液，阴性模板和阳性模板，所述阴性模板为无菌水，所述阳性模板为寨卡病毒基因组DNA。本发明中的定量参考品为含有寨卡病毒NS4序列的Teasy载体，包括5个浓度梯度：1×106copies/ml、1×105copies/ml、1×104copies/ml、1×103copies/ml、1×102copies/ml。本发明提供的TaqManPCR检测试剂盒可以检测出寨卡病毒的最低拷贝数为1×102copies/ml，说明本试剂盒有非常好的灵敏度。同时本发明中是针对寨卡病毒基因保守区设计特异引物和探针，仅能够检测出寨卡病毒基因组核酸，但不能检测出非寨卡病毒基因组核酸，说明本试剂盒有良好的特异性。本发明可以检测检测血液、尿液等各类样品中的寨卡病毒，以及确定如疫苗生产中病毒培养过程的寨卡病毒含量，检测寨卡病毒不需进行核酸提取，整个检测过程只需60min，可以快速进行各种样品的寨卡病毒检测，为疾病的检测与疫苗生产及使用提供重要保障。附图说明图1为5个阳性参考品的检测结果图，5个阳性参考品的Ct值为13-30，扩增曲线有明显指数增长期，可以明确判定为阳性。图2为5个阳性参考品标准曲线图。图3为8种病毒样品检测结果图，其中寨卡病毒为阳性，有明显扩增曲线，其他样品为阴性。1.寨卡病毒样本；2.黄热病载体；3.登革热病毒1型载体；4.乙脑灭活病毒；5.手足口灭活病毒；6.水痘灭活病毒；7.风疹灭活病毒；8.Vero细胞。图4为各类寨卡病毒检测结果图，4种样品检测结果均为寨卡病毒阳性。1.血液；2.尿液；3.细胞培养物；4.纯化产物。图5为1×106copies/ml、1×104copies/ml、1×102copies/ml样品阳性标本10次重复性试验。图6为人员1检测1×106copies/ml、1×104copies/ml、1×102copies/ml样品3次结果图。图7为人员2检测1×106copies/ml、1×104copies/ml、1×102copies/ml样品3次结果图。具体实施方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1寨卡病毒保守序列的选择与特异性引物的设计本发明通过对NCBI数据库已报道的寨卡病毒基因序列比对，找到了寨卡病毒NS4基因的保守靶序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。本发明根据该保守序列，通过反复对比、筛选，设计了用于检测该遗传标志物的特异性引物对和探针。根据NS4基因序列进行引物探针设计，使用PrimerExpress进行引物探针设计，根据软件评分筛选出以下序列：引物探针组合1上游引物序列为：5'-GGAGTCCCGCTGCTAATGAT-3'下游引物序列为：5'-TAGTGCGCCACGAGCAAA-3'荧光探针序列为：(FAM)5’-TTAACGCCCCTGACCCTAATAGTGGCCA-3’(TAMRA)探针结合位置为NS4A基因。引物探针组合2上游引物序列为：5'-GGAGTCCCGCTGCTAATGAT-3'下游引物序列为：5'-GTAGTGCGCCACGAGCAAA-3'荧光探针序列为：(FAM)5’-TAACGCCCCTGACCCTAATAGTGGCCA-3’(TAMRA)探针结合位置为NS4A基因。引物探针组合3上游引物序列为：5'-AGGAGGAAGGATGTATGCAGATG-3'下游引物序列为：5'-TTAGAGCTTCATTCTCCAGATCAA-3'荧光探针序列为：(FAM)5’-TGGCTGGGACACCCGCATCA-3’(TAMRA)探针结合位置为NS4B基因。使用上述引物探针组合进行RealTimePCR预实验，考察引物探针组合的扩增效率，结果如下：表1预实验结果组别扩增效率引物探针组合1100.13％引物探针组合2118.25％引物探针组合3115.30％由表1结果可知，引物探针组合2与引物探针组合3扩增效率大于100％，表明扩增产物中有引物二聚体生成，影响扩增效率与实验准确性，故选择引物探针组合1作为检测该遗传标志物的特异性引物对和探针。特异性引物对的序列为：上游引物序列为：5'-GGAGTCCCGCTGCTAATGAT-3'(SEQIDNO.1)下游引物序列为：5'-TAGTGCGCCACGAGCAAA-3'(SEQIDNO.2)荧光探针序列为：(FAM)5’-TTAACGCCCCTGACCCTAATAGTGGCCA-3’(TAMRA)。(SEQIDNO.3)实施例2试剂盒建立与具体操作1、试剂盒组成试剂盒包括RT-PCR反应液，反转录酶，PCR酶，实施例1筛选得到的上下游引物，寡核苷酸探针，定量参考品，阳性参考品，阴性质控品。RT-PCR反应液由dATP、dUTP、dGTP、dCTP四种核苷酸、含有镁离子的缓冲液构成。定量参考品为插入寨卡病毒NS4基因的载体质粒(将NS4区域基因连接到T载体上，转染至大肠杆菌，培养，抽提质粒得到)，使用分光光度计测定浓度和纯度后使用无菌TE分别稀释至1×106copies/ml、1×105copies/ml、1×104copies/ml、1×103copies/ml、1×102copies/ml。阳性参考品为插入亚洲型寨卡病毒全基因组序列的载体质粒，用分光光度计测定浓度和纯度后使用无菌TE稀释至1×103copies/ml。阴性质控品为无菌TE缓冲液，使用DEPC水配制。本试剂盒保存于-20℃，避免反复冻融。2、检测步骤(1)PCR反应以待检测样品为模板，按照下表配制PCR反应体系表2PCR反应体系引物浓度为0.3umol/L、探针浓度为0.25umol/L。PCR扩增的反应温度和时间为：42℃反转录5min，93℃预变性30s；95℃变性5s，60℃荧光检测34s，40个循环。(2)结果分析分析条件设置：反应结束后保存检测数据文件。根据PCR扩增结果所得到的曲线图调节分析参数，使标准曲线(Stdcurve)窗口下的标准曲线达到最佳，即相关性数值绝对值＞0.99。质量控制：阳性对照参考品Ct值<30,阴性对照参考品Ct值>30且无s型扩增曲线，实验成立。结果判读：样品Ct值<30为寨卡病毒阳性，样品Ct值>30且无s型扩增曲线为寨卡病毒阴性，阳性样品根据标准曲线可计算出寨卡病毒拷贝数。实施例3线性与检出限实验将实施例2的阳性参考品稀释至6.3×106copies/ml、1×106copies/ml、1×105copies/ml、1×104copies/ml、1×103copies/ml、1×102copies/ml。1×101copies/ml、1copies/ml。根据实施例2进行线性实验，重复3次，实验结果如图1所示，标准曲线与模板浓度关系如图2所示。由图1图2可见，该试剂盒在1×106copies/ml-1×102copies/ml之间有良好的线性关系，相关系数R2为0.997，线性拟合方程为y＝-3.5387lgx+17.3894。其中线性最低点为实验检出限，检出限为1×102copies/ml。实施例4特异性实验选取寨卡病毒样本、含有黄热病毒特异基因序列的Teasy载体，含有登革热病毒特异基因序列的Teasy载体,乙脑灭活病毒，手足口灭活病毒，水痘灭活病毒，风疹灭活病毒，Vero细胞，根据实施例2的方法进行寨卡病毒检测，验证试剂盒特异性。实验结果如表3，扩增曲线如图3。表3PCR反应样品检测结果由表3可见，该试剂盒能够特异性检测寨卡病毒，不与黄热病毒属其它病毒产生交叉反应，不与其他类型病毒和细胞基质产生交叉反应，表现了良好的特异性。实施例5适用性实验选取寨卡病毒感染者血液样本，尿液样本，寨卡病毒细胞培养物，寨卡病毒纯化产物共4个样品，根据实施例2的方法进行寨卡病毒检测，验证试剂盒适用性，实验结果如表4，扩增曲线如图4：表4PCR反应样品检测结果由表4结果可见，本发明试剂盒能检测各类寨卡病毒样品，表明此试剂盒可以检测临床血样，也可以在对寨卡疫苗的生产过程进行质量监控，具有广泛的适用性。实施例6重复性与中间精密度检测1、重复性检测使用1×106copies/ml、1×104copies/ml、1×102copies/ml定量参考品作为重复性检测样品，重复检测3个样品各10次，计算10次检测的变异系数，结果如图5。3个样品10次检测的变异系数均小于5％，试剂盒具有良好的重复性。表5重复性检测结果2、中间精密度检测使用1×106copies/ml、1×104copies/ml、1×102copies/ml定量参考品(实施例2)作为中间精密度检测样品，使用不同实验人员在不同实验室进行各3次检测，计算每个样品6次检测的变异系数，结果如图6、图7。3个样品共6次检测的变异系数均小于10％，试剂盒中间精密度良好。表6中间精密度检测虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>北京科兴中维生物技术有限公司<120>检测寨卡病毒的试剂盒及其应用<130>KHP161118187.5Q<160>10<170>PatentInversion3.5<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1ggagtcccgctgctaatgat20<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>2tagtgcgccacgagcaaa18<210>3<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>3ttaacgcccctgaccctaatagtggcca28<210>4<211>1947<212>DNA<213>寨卡NS4<400>4tttggagtgatggaagccctgggaacactgccaggacacatgacagagagattccaggaa60gccattgacaacctcgctgtgctcatgcgggcagagactggaagcaggccttacaaagcc120gcggcggcccaattgccggagaccctagagaccattatgcttttggggttgctgggaaca180gtctcgctgggaatctttttcgtcttgatgaggaacaagggcatagggaagatgggcttt240ggaatggtgactcttggggccagcgcatggctcatgtggctctcggaaattgagccagcc300agaattgcatgtgtcctcattgttgtgttcctattgctggtggtgctcatacctgagcca360gaaaagcaaagatctccccaggacaaccaaatggcaatcatcatcatggtagcagtaggt420cttctgggcttgattaccgccaatgaactcggatggttggagagaacaaagagtgaccta480agccatctaatgggaaggagagaggagggggcaaccatgggattctcaatggacattgac540ctgcggccagcctcagcttgggccatctatgctgccttgacaactttcattaccccagcc600gtccaacatgcagtgaccacttcatacaacaactactccttaatggcgatggccacgcaa660gctggagtgttgtttggtatgggcaaagggatgccattctacgcatgggactttggagtc720ccgctgctaatgataggttgctactcacaattaacgcccctgaccctaatagtggccatc780attttgctcgtggcgcactacatgtacttgatcccagggctgcaggcagcagctgcgcgt840gctgcccagaagagaacggcagctggcatcatgaagaaccctgttgtggatggaatagtg900gtgactgacattgacacaatgacaattgacccccaagtggagaaaaagatgggacaggtg960ctactcatggcagtagccgtctccagcgccatactgtcgcggaccgcctgggggtggggg1020gaggctggggccctgatcacagccgcaacttccactttgtgggaaggctctccgaacaag1080tactggaactcctctacagccacttcactgtgtaacatttttaggggaagttacttggct1140ggagcttctctaatctacacagtaacaagaaacgctggcttggtcaagagacgtgggggt1200ggaacaggagagaccctgggagagaaatggaaggcccgcttgaaccagatgtcggccctg1260gagttctactcctacaaaaagtcaggcatcaccgaggtgtgcagagaagaggcccgccgc1320gccctcaaggacggtgtggcaacgggaggccatgctgtgtcccgaggaagtgcaaagctg1380agatggttggtggagcggggatacctgcagccctatggaaaggtcattgatcttggatgt1440ggcagagggggctggagttactacgccgccaccatccgcaaagttcaagaagtgaaagga1500tacacaaaaggaggccctggtcatgaagaacccgtgttggtgcaaagctatgggtggaac1560atagtccgtcttaagagtggggtggacgtctttcatatggcggctgagccgtgtgacacg1620ttgctgtgtgacataggtgagtcatcatctagtcctgaagtggaagaagcacggacgctc1680agagtcctctccatggtgggggattggcttgaaaaaagaccaggagccttttgtataaaa1740gtgttgtgcccatacaccagcactatgatggaaaccctggagcgactgcagcgtaggtat1800gggggaggactggtcagagtgccactctcccgcaactctacacatgagatgtactgggtc1860tctggagcgaaaagcaacaccataaaaagtgtgtccaccacgagccagctcctcttgggg1920cgcatggacgggcctaggaggccagtg1947<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>5ggagtcccgctgctaatgat20<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>6gtagtgcgccacgagcaaa19<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>7taacgcccctgaccctaatagtggcca27<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>8aggaggaaggatgtatgcagatg23<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>9ttagagcttcattctccagatcaa24<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>10tggctgggacacccgcatca20当前第1页1 2 3