技术领域：
本发明属于致病菌检测领域，具体地，涉及一种快速检测沙门氏菌的方法。
背景技术：
：致病菌(Pathogenicbacteria)能引起疾病的微生物称为病原微生物或致病菌。病原微生物包括细菌、病毒、螺旋体、立克次氏体、衣原体、支原体、真菌及放线菌等。一般所说的致病菌指的是病原微生物中的细菌。细菌的致病性与其毒力、侵入数量及侵入门户有关。虽然绝大多数细菌是无害甚至有益的，但是相当大一部分可以致病。条件致病菌只在特定条件下致病，如有伤口可以允许细菌进入血液，或者免疫力降低时。例如，金黄色葡萄球菌和链球菌也是正常菌群，常可以存在于体表皮肤，鼻腔而不引起疾病，但可以潜在引起皮肤感染，如肺炎(pneumonia)、脑膜炎(meningitis)和败血症(sepsis)等。沙门氏菌是一种革兰氏阴性短杆菌，不形成芽胞，临床上可表现为胃肠炎、肠热病、菌血症综合征或局灶性疾病。受此菌威胁最大的是婴幼儿、老人及免疫缺陷个体。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。当前，各国政府和学术研究机构都在致力于食品安全问题的研究，食品安全问题受到了空前的关注。沙门氏菌检测的常规方法是目前国内绝大多数检测机构都在使用的方法，主要步骤为前增菌(8-18h)、增菌(18-24h)、平板培养分离(18-24h)、生化试验和血清学鉴定，由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。技术实现要素：本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能够快速检测沙门氏菌的方法。为了实现上述目的，本发明的发明人进行了大量的研究，结果发现配合使用免疫磁分离技术与PCR扩增的方法特别有利于实现沙门氏菌的快速特异性检测。因此，本发明提供了一种快速检测沙门氏菌的方法，该方法包括以下步骤：(1)将免疫磁珠与液体形式的待测样品进行混合，以捕获待测样品中可能存在的沙门氏菌，所述免疫磁珠由抗体与磁球偶联得到；(2)将步骤(1)中可能捕获了沙门氏菌的免疫磁珠与液体培养基混合，并将所得混合物置于能够使沙门氏菌增殖的条件下进行培养；(3)采用针对沙门氏菌的特异性引物对步骤(2)经培养获得的菌体进行PCR扩增，根据PCR扩增产物判断待测样品中沙门氏菌的存在；其中，所述磁球为粒径是150-200nm的表面修饰有氨基或羧基的超顺磁性Fe3O4聚苯乙烯复合微球；PCR扩增所用的特异性引物由序列如SEQIDNO:3所示的正向引物和序列如SEQIDNO:4所示的反向引物组成。本发明的方法操作简单快捷，所需时间短，具有较高的灵敏度和准确度，适用性强，特别有利于大范围的应用推广，对食品安全监测监管具有重大意义。本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：图1是实施例1中部分琼脂糖凝胶电泳结果图，其中，M为Marker，1-3为实验组1-3的电泳结果，4为死菌组4的电泳结果，5为阳性对照组5的电泳结果，6为阴性对照组6的电泳结果；图2是实施例1中另一部分琼脂糖凝胶电泳结果图，其中，M为Marker，1为阴性对照组7的电泳结果，2为阴性对照组8的电泳结果，3为阴性对照组9的电泳结果，4为阳性对照组5的电泳结果；图3是实施例2中琼脂糖凝胶电泳结果图，其中，M为Marker，1和2为阴性对照组5和6的电泳结果，3和4为阳性对照组3和4的电泳结果，5和6为实验组1和2的电泳结果。具体实施方式以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“免疫磁珠”是指通过偶联反应将抗体结合到磁性微球(或磁球)的表面上，形成的免疫磁性微球；术语“PCR”是指聚合酶链式反应；术语“引物”包括至少一个上游引物和至少一个下游引物；本发明中使用的液体体积均为20℃下的数值。本发明提供的快速检测沙门氏菌的方法包括以下步骤：(1)将免疫磁珠与液体形式的待测样品进行混合，以捕获待测样品中可能存在的沙门氏菌，所述免疫磁珠由抗体与磁球偶联得到；(2)将步骤(1)中可能捕获了沙门氏菌的免疫磁珠与液体培养基混合，并将所得混合物置于能够使沙门氏菌增殖的条件下进行培养；(3)采用针对沙门氏菌的特异性引物对步骤(2)经培养获得的菌体进行PCR扩增，根据PCR扩增产物判断待测样品中沙门氏菌的存在。根据本发明，抗体与磁球偶联获得所述免疫磁珠的方法可以为常规方法，例如，可以按照文献(刘辉荣等，简便高效分离细胞新型免疫磁珠制备，中国公共卫生，2008,11:1349-1351)中的方法进行。为了捕获待测样品中的沙门氏菌，所述抗体为能够与沙门氏菌特异性结合的抗体，优选地，所述抗体为编号为LS-C103073的LSBIO单克隆抗体(该抗体可以从LSBIO公司商购得到，商品号(Cat.#)为LS-C103073)和/或编号为01-91-99的KPL多克隆抗体(该抗体可以从美国KPL公司商购得到，商品号(Cat.#)为01-91-99)。采用该优选的抗体(特别是所述多克隆抗体)能够实现沙门氏菌的活菌体检测，进一步提高了本发明的检测方法的实际使用价值。优选情况下，每毫克的磁球上偶联的抗体的量为0.05-2mg。优选情况下，相对于每毫升的液体形式的待测样品，以磁球的重量计，所述免疫磁珠的用量为10-25μg。所述磁球可以为各种常规用于免疫磁分离的磁球，例如，可以为表面修饰有氨基或羧基的超顺磁性Fe3O4聚苯乙烯复合微球。优选情况下，所述磁球的粒径为150-200nm。根据本发明，利用免疫磁珠捕获沙门氏菌可以借助免疫磁分离系统(例如MatrixPathatrix免疫磁分离系统)或磁力架进行，对所述捕获的条件没有特别的限定，优选地，步骤(1)中，捕获的条件包括：温度为35-38℃，时间为25-35min。根据本发明，为了准确地检测待测样品中沙门氏菌的存在，需要在免疫磁分离之后对待测样品进行细菌扩增处理，从而扩增待测样品中可能存在的沙门氏菌。所述液体培养基可以为本领域常规用于沙门氏菌培养的培养基，如缓冲蛋白胨水或营养肉汤培养基。培养的温度可以为35-38℃。培养的时间优选为4-8h(更优选为4-6h)。可以利用摇床进行所述培养，而摇床的转速通常可以设置为100-200rpm。本发明中，经培养步骤获得的培养物即可直接作为PCR扩增的模板。本发明采用先进行免疫磁分离，再增殖培养，在很大程度上减少了检测所需的时间，提高了检测效率。根据本发明，PCR扩增所用的特异性引物为能够特异地扩增沙门氏菌的invA(侵袭蛋白A，invasionproteinA)基因(例如GenBankAccessionNumber：M90846.1)和/或FimY(菌毛Y蛋白，fimbriaeYprotein)基因(例如GenBankAccessionNumber：JQ665438.1)的引物。其中，作为本发明特别优选的一种实施方式，PCR扩增所用的特异性引物由序列如SEQIDNO:1(5’-TCCTCCGCTCTGTCTACTTA-3’)所示的正向引物和序列如SEQIDNO:2(5’-ACCGAAATATTCATTGACGTT-3’)所示的反向引物组成，或者由序列如SEQIDNO:3(5’-GCCGGTAAACTACACGATGA-3’)所示的正向引物和序列如SEQIDNO:4(5’-GAGTTACTGAACCAACAGCT-3’)所示的反向引物组成。本发明中，如果PCR扩增产物中存在特异性引物能够扩增的目的DNA片段，那么说明样品中存在沙门氏菌。可以采用常规的电泳检测方法分析PCR扩增产物中可能存在的DNA片段，从而判断待测样品中是否存在沙门氏菌，例如，琼脂糖凝胶电泳(AGE)，电泳的具体条件可以包括：电压为3-15V/cm，时间为20-40min，PCR扩增产物的上样量为8-20μL。根据本发明的方法，其中，待测样品可以为食品、环境用水(包括城市废水、工业废水、农业用水、城市用水、特种用水等)和药品中的至少一种。具体地，可以按照国家标准GB4789.1-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验总则》中的方法取得待测样品。以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，缓冲蛋白胨水购自北京路桥技术有限责任公司；使用的菌株均通过商购获得，且分别购自ATCC(美国典型菌种保藏中心)、CGMCC(中国普通微生物菌种保藏管理中心)和CMCC(中国医学微生物菌种保藏管理中心)；1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)购自Sigma公司；使用的特异性引物委托上海英骏生物技术有限公司合成；磁分离在磁力架上进行；将从LSBIO公司商购得到，商品号(Cat.#)为LS-C103073的抗体作为特异性抗体。制备实施例1本制备实施例1使用抗体1制备本发明的方法所用的免疫磁珠。将通过1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化的表面修饰有羧基的超顺磁性Fe3O4聚苯乙烯复合微球(购自上海奥润微纳新材料科技有限公司，PM3-020型聚合物磁球，浓度为10mg/mL，粒径为180nm，表面修饰有羧基官能团)作为磁球使用，取2mg磁球，分散磷酸缓冲溶液中，分散液中磁球的浓度为2mg/mL。取0.2mg特异性抗体(溶于1mL的磷酸缓冲液中)与2mg磁球混合，室温下在摇床(200r/min)中保持3h，然后通过磁分离进行清洗，去除未偶联到磁球表面的特异性抗体，采用BioSpec-nano仪(SHIMADZU，日本)检测未偶联的微量抗体，且测得未偶联到磁球表面的特异性抗体的量为300ng。接着用浓度为1％(w/v)的牛血清白蛋白溶液(溶于磷酸缓冲液)，在37℃下封闭30min，然后通过磁分离进行清洗，洗去多余的牛血清白蛋白溶液，即得到免疫磁珠。实施例1本实施例用来说明本发明方法的灵敏度、特异性和准确度。将不同的菌株(见表1)与2mL的PBS混合得到不同浓度的菌悬液(即待测样品)，并按照以下方式进行免疫磁珠捕获、细菌培养、PCR扩增和电泳检测，其中，死菌组的待测样品通过将菌悬液置于121℃、0.103MPa的条件下30min进行灭活而获得。表1注：“图1-1”表示图1中的1泳道，依此类推。(1)免疫磁珠捕获将菌悬液加入到制备实施例1获得的免疫磁珠离心管中，在涡旋混合器上轻轻振荡混匀，放在混匀器或摇床中，室温(25℃)旋转(或振荡)孵育30min；放在MatrixPathatrix免疫磁分离系统上，室温(25℃)下静置30min，小心吸走管中的液体，获得免疫磁珠富集体。(2)细菌培养将免疫磁珠富集体转移到10mL缓冲蛋白胨水中，涡旋混匀，放置到恒温培养箱，于36±1℃下培养5.5h；收集培养液5mL于Eppendorf管中，12000g离心10min，所得沉淀用1mL无菌水打散，并在12000g下离心10min，弃上清，沉淀用100μL无菌水打散，得到菌体待用(作为PCR扩增模板)。(3)PCR扩增使用针对所述沙门氏菌的特异性引物对培养获得的菌体进行PCR扩增。特异性引物(能够扩增283bp的invA基因)的序列如下所示：正向引物(invAF)：5’-TCCTCCGCTCTGTCTACTTA-3’(SEQIDNO：1)反向引物(invAR)：5’-ACCGAAATATTCATTGACGTT-3’(SEQIDNO：2)PCR反应体系见表2：表2试剂贮备液浓度25μL反应体系中加样体积10×PCR缓冲液(不含MgCl2)—7.8μLdNTP2.5mmol/L2μLMgCl225mmol/L1.5μL上游引物20μmol/L0.3μL下游引物20μmol/L0.3μLTaq酶5U/μL0.2μLDNA模板50ng/μL10μL双蒸水—2.9μLPCR扩增程序见表3：表3194℃3min294℃30s355℃30s472℃40s5返回第2步30个循环672℃10min74℃永久(4)PCR扩增产物的电泳检测用电泳缓冲液(1×TAE)制备2％的琼脂糖凝胶，58℃时加入溴化乙锭至终浓度为0.5μmol/mL；取10μL的PCR扩增产物，分别和2μL的上样缓冲液混合进行点样，用DNA分子量标记物做参照，在10V/cm恒压下电泳30min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。如果AGE电泳结果显示PCR扩增得到了283bp的片段(可观察到明显的条带，阳性)，那么说明样品中存在沙门氏菌，结果如图1和图2所示：实验组1-3和阳性对照组5均呈现明显的283bp的条带，而死菌组4和阴性对照组6-9没有明显的条带。从图1和图2可以看出，本发明的优选实施方式能够特异地检测沙门氏菌活菌体。实施例2按照实施例1的方法进行沙门氏菌的检测，不同的是，使用的样品如表4所示，且PCR扩增使用的特异性引物(能够扩增526bp的FimY基因)的序列如下所示：正向引物(FimYF)：5’-GCCGGTAAACTACACGATGA-3’(SEQIDNO：3)反向引物(FimYR)：5’-GAGTTACTGAACCAACAGCT-3’(SEQIDNO：4)表4注：“图3-1”表示图3中的1泳道，依此类推。电泳结果如图3所示：实验组1-2和阳性对照组3-4呈现明显的526bp的条带，而阴性对照组5和6没有明显的条带。从图3也可以看出，本发明的方法能够用于特异地、准确地检测沙门氏菌。实施例3本实施例用来说明本发明的方法在检测猪肉样品的实际应用。取经国标方法(GB/T4789.4-2010(食品安全国家标准-食品微生物学检验-沙门氏菌检验)检验证实为三种菌株均为阴性的20份鲜猪肉样品25g，分别按照实施例1中记载的方法进行免疫磁珠捕获、细菌培养、PCR扩增和电泳检测，结果表明，20份沙门氏菌阴性猪肉样品用该发明方法检测结果全部为阴性，与传统培养方法检测结果一致。用鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)(100cfu)污染上述20份鲜猪肉样品，采用实施例1中记载的方法再进行免疫磁珠捕获、细菌培养、PCR扩增和电泳检测，结果全部为阳性。实施例4按照实施例1中记载的方法进行沙门氏菌的检测，不同的是，将实施例1中使用的待测样品替换为购自北京市各大超市的50份鲜猪肉样品，并采用GB/T4789.4-2010(食品安全国家标准-食品微生物学检验-沙门氏菌检验)的方法分别进行验证。结果显示，GB方法检出沙门氏菌阳性20例，本发明的方法对此20份样品的检测结果也为阳性，两种方法对其余样品中沙门氏菌的检测结果均为阴性。对从北京地区各大超市购买的50份鲜猪肉样品的检测结果显示，相比GB方法，本发明方法针对沙门氏菌的检测具有很高的灵敏度、特异性和准确性。实施例5按照实施例1中记载的方法进行沙门氏菌的检测，不同的是，将实施例1中使用的待测样品替换为购自北京市各大超市的50份鲜鸡肉样品，并将实施例1中使用的单克隆抗体替换为01-91-99多克隆抗体(购自KPL公司，商品号(Cat.#)为01-91-99)。采用GB/T4789.4-2010(食品安全国家标准-食品微生物学检验-沙门氏菌检验)的方法分别进行验证。结果显示，GB方法检出沙门氏菌阳性23例，本发明的方法对此23份样品的检测结果也为阳性，两种方法对其余样品中沙门氏菌的检测结果均为阴性。对从北京地区各大超市购买的50份鲜鸡肉样品的检测结果也显示，相比GB方法，本发明方法针对沙门氏菌的检测具有很高的灵敏度、特异性和准确性。由以上实施例可以看出，本发明的方法能够实现沙门氏菌的快速检测，灵敏度和准确度均较高。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。SEQUENCELISTING<110>北京市理化分析测试中心<120>一种快速检测沙门氏菌的方法<130>I43901PCA<160>4<170>PatentInversion3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>Artificial<220><223>Thesequenceissynthesized<400>1tcctccgctctgtctactta20<210>2<211>21<212>DNA<213>Artificial<220><223>Thesequenceissynthesized<400>2accgaaatattcattgacgtt21<210>3<211>20<212>DNA<213>Artificial<220><223>Thesequenceissynthesized<400>3gccggtaaactacacgatga20<210>4<211>20<212>DNA<213>Artificial<220><223>Thesequenceissynthesized<400>4gagttactgaaccaacagct20当前第1页1 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