本发明属于生物鉴别技术领域，涉及一种真菌的鉴别方法，特别是涉及一种用于鉴别柱孢菌的ITS特异性分子标记，以及用于所述鉴别方法的专用引物、探针和基因芯片。
背景技术：
柱孢菌，Cylindrocarpon，属半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科、柱孢霉属，是一种常见的土壤寄生菌，地理分布较广，从热带到寒带地区都有柱孢菌分布的报道。
柱孢菌的寄主主要为一些果树、林木、花卉和药用植物等，随着寄主的不同其危害程度各不相同。在农作物、蔬菜上危害程度较轻，而在果苗、花卉上的危害较大。尤其引致的人参、西洋参的绣腐病，在各参区都有分布，目前中国绣腐病年发病率在25%左右，在主要参区则高达70%，严重影响了人参的质量和产量。
柱孢菌是一种常见的植物致病菌，尤其引致的人参、西洋参绣腐病，在各参区都有分布，目前中国绣腐病年发病率25%左右，在主要参区则高达70%，严重影响了人参的质量和产量。同时，柱孢菌也是食用菌中常见的致病菌，可以导致食用菌出现病斑、菌柄衰弱等现象，持续感染还会导致子实体萎缩死亡。柱孢菌在食用菌的规模化养殖中会产生极为严重的群体感染效益，损害种植户的经济利益。因此，在食用菌新品种引进前进行柱孢菌的检测筛查尤为必要。
对于这种肉眼无法观察的致病菌，如果采用常规的培养方法，至少需要4～5天的检测周期，而且其菌落形态还不易明确辨识。
随着分子生物学技术的快速发展，特别是分于标记和基因标记技术的建立与成熟，为发展简便、快速、准确的真菌鉴定技术提供了有效手段。基因芯片是一种新型的DNA识别技术，利用芯片的高通量和特异性优势，可以在芯片上对真菌进行有效辨识，以提高检测的准确性。同时，基因芯片检测主要操作步骤依靠仪器设备完成，检测周期只需要6～8小时，不依赖传统检测中人的主观经验，可以在短时间内获得准确的检测鉴别结果。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种柱孢菌特异性ITS分子标记，以建立一种快速、灵敏、特异性好的柱孢菌鉴别方法。
提供用于所述柱孢菌鉴别方法的引物和核酸探针，是本发明的另一发明目的。
本发明采用基因克隆技术，并结合基因芯片技术，首先获得了柱孢菌ITS DNA片段中一段高度保守且特异性强的核酸序列，以作为特异性鉴别柱孢菌的分子标记；进而依据该分子标记设计并合成了一组特异性引物和核酸探针，建立了特异性鉴别柱孢菌的方法，并对所建立的方法进行了有效性评估试验。
为实现上述发明目的，本发明所提供的柱孢菌ITS特异性分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述ITS特异性分子标记是使用通用引物ITS1/ITS4对从柱孢菌中提取的总DNA进行PCR扩增，PCR产物进行毛细管测序，测序结果在NCBI中进行全核酸数据库比对分析，确定出的能够作为基因芯片检测靶序列的特征序列。
进而，本发明根据上述靶序列，依据引物与探针设计原则，设计了一对具有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所述核苷酸序列的、用于扩增所述ITS特异性分子标记的引物，以及一种具有SEQ ID NO.4所述核苷酸序列的、用于检测所述ITS特异性分子标记的核酸探针。
更具体地，本发明是在引物1的5'端标记有荧光报告基团Hex，并将所述核酸探针进行氨基化处理，即在核酸探针的5'端连接氨基，最终人工合成出具有下述核苷酸序列的引物和核酸探针。
引物1：5'Hex-TGTATTTTGCCCTGAAAACT-3'。
引物2：5'-GTTTTACGGCGTGGTTCGCAG-3'。
核酸探针：5'NH3-TTTTTTTTTTTTGACGGCGGGCGCGCGGCTCCCGGAGGTG-3'。
本发明还提供了一种用于检测柱孢菌的基因芯片。本发明所述的基因芯片采用本领域常规方法制备，并在所述基因芯片上固定有上述核酸探针。所述基因芯片采用的片基优选常规的醛基片基，以与所述氨基化的探针配合。
本发明也提供了一种用于鉴别柱孢菌的试剂盒，在所述试剂盒中至少包含有上述的柱孢菌检测用基因芯片或核酸探针，用于扩增本发明所述柱孢菌ITS特异性分子标记的专用引物和PCR扩增试剂，以及其他必要的相关试剂。
最后，本发明提供了一种鉴别柱孢菌的方法，本发明所述方法是利用上述柱孢菌ITS特异性分子标记对柱孢菌进行鉴定，利用PCR方法获得的柱孢菌扩增产物中应包含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
具体地，本发明所述鉴别柱孢菌的方法包括：
a) 提取待检测样本的基因组总DNA；
b) 以所述引物对所述提取的总DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
c) 将所述PCR扩增产物与所述核酸探针进行原位杂交，以特异性鉴定出所述待检测样本中是否含有柱孢菌。
本发明在PCR扩增产物与核酸探针原位杂交后，洗去未杂交的PCR扩增产物，对杂交结果进行检测。杂交结果为阳性，则所述待测样本中含有柱孢菌；杂交结果为阴性，则所述待测样本中不含有柱孢菌。
本发明优选采用激光共聚焦扫描仪对上述杂交结果进行荧光扫描检测。
本发明上述方法中，所述基因组总DNA提取、PCR扩增、原位杂交的方法也都是常规的。
本发明较佳的PCR扩增程序如下：95℃预热5min；36个循环：95℃ 20s，58℃ 20s，72℃ 40s；最后72℃延伸5min。
使用本发明提供的专用引物和核酸探针对柱孢菌和不含柱孢菌的食用菌进行鉴定，结果显示，只有柱孢菌的PCR扩增产物与本发明核酸探针杂交结合并呈现阳性结果(检测位点亮)，其他食用菌或食用菌内生菌的PCR扩增产物与本发明核酸探针没有杂交结合(检测位点不亮)，说明本发明设计的引物能将柱孢菌的特异性基因片段扩增出来，并与柱孢菌核酸探针进行有效结合。同时，采用不同的核酸探针与柱孢菌的PCR扩增产物进行杂交，也只有本发明的核酸探针具有阳性响应，其他核酸探针无响应，说明本发明柱孢菌核酸探针的特异性较好。以上结果证明本发明提供的检测方法特异性、准确性好。
因此，本发明提供的柱孢菌ITS特异分子标记以及专用引物和核酸探针能够应用于内生真菌柱孢菌的快速鉴定检测。本发明的特异性分子标记鉴别方法不仅具有比常规形态学判断更精确的鉴定结果，而且与其他检测方法比较检测时间短、准确性高，检测所需时间只需8个小时，而传统的培养联合化学显色反应鉴定耗时10～15天，拮抗试验则至少需要两周时间。
附图说明
图1是本发明核酸探针对不同真菌的鉴定结果。
图中：Cl为亚历山大杯伞检测位点，Hy为烟色垂膜菇检测位点，Le为木瑚菌属Lentaria patouillardii检测位点，Tr为鳞盖口蘑检测位点，Me为条柄铦囊蘑检测位点，Ly为荷叶离褶伞检测位点，Pe为青霉素检测位点，Cy为柱孢菌检测位点。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的说明，但应该理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员在本发明基础上对本发明作出的各种改动或修改，均应同样落于本发明的保护范围之内。
下述实施例所用方法如无特殊说明，均按照常规方法和条件进行，或按照商品说明书选择。所用引物、核酸探针和所用序列测定工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和完成。
实施例1：柱孢菌基因组DNA提取。
取500μl过夜培养的柱孢菌菌液(OD280值0.6)，置于-80℃冷冻30min使充分凝固；将凝固的菌块放于研磨中，液氮环境下充分研磨至粉末状，转移至500μl的CTAB中，65℃水浴约30min；冷却后加入600μl酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混匀，12000rpm离心15min；吸上清于EP管中，加入600μl氯仿∶异戊醇(24∶1)，12000rpm离心15min；吸上清，转入新的离心管中，加入1/3体积NaAc(3mol/l)，1ml -20℃预冷的无水乙醇，混匀后置于-20℃静置3～4h；12000rpm离心10min，弃上清，向离心管中加入75%乙醇洗涤2～3次，置于吸水纸上倒置晾干；加入ddH2O 20μl溶解DNA，-20℃保存。
实施例2：ITS特异性分子标记的确定。
以实施例1获取的柱孢菌总DNA为模板，使用通用引物ITS1/ITS4对DNA进行PCR扩增，PCR产物进行毛细管测序，得到详细的序列信息。
将测序结果在NCBI中进行全核酸数据库比对分析，筛选获得保守性高的片段，对选取的不同序列的结果进行比较和选择，最终确定了一段测序结果中的特征性序列，所述柱孢菌的特异性基因片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
经过同源性比对检索后，确定所选取的靶序列为一段特异性较高的DNA 序列，可以作为基因芯片检测的靶序列。
实施例3：引物与核酸探针的设计。
根据实施例2确定的靶序列作为分子标记，依据引物与核酸探针设计原则，设计SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的专用引物，以及SEQ ID NO.4所示的核酸探针。
引物1：5'Hex-TGTATTTTGCCCTGAAAACT-3'。
引物2：5'-GTTTTACGGCGTGGTTCGCAG-3'。
核酸探针：5'NH3-TTTTTTTTTTTTGACGGCGGGCGCGCGGCTCCCGGAGGTG-3'。
其中，在引物1的5'端标记有荧光报告基团Hex；在核酸探针的5'端连接氨基，将核酸探针进行氨基化处理。
实施例4：基因芯片的制备。
将实施例3中氨基化的核酸探针按一定浓度点在醛基片基上，室温放置过夜，先后用洗脱液I(5×SSC，1%SDS)、洗脱液II(0.25×SSC，1%SDS)各洗脱5min，将没有固定上的探针洗脱掉，然后离心甩干，制备成基因芯片备用。
实施例5：待测真菌的PCR扩增及荧光标记鉴定。
取待测真菌，以SIGMA真菌基因组提取试剂盒提取真菌的总DNA。以实施例3设计的带有荧光标记的专用引物对所提取的总DNA进行PCR扩增，PCR扩增体系如下。
PCR扩增程序如下：95℃预热5min；36个循环：95℃ 20s，58℃ 20s，72℃ 40s；最后72℃延伸5min。
将上述扩增得到的PCR产物与实施例4制备的基因芯片进行原位杂交，在42℃下保持40min，用洗脱液I(5×SSC，1%SDS)、洗脱液II(0.25×SSC，1%SDS)各洗脱5min，洗去未杂交的PCR扩增产物，用激光共聚焦扫描仪检测基因芯片杂交结果。核酸探针检测位点显绿色荧光，证明杂交结果为阳性，待测真菌中含有柱孢菌。核酸探针检测位点无荧光亮点则杂交结果为阴性，待测真菌中不含有柱孢菌。
实施例6：核酸探针对柱孢菌的特异性检测验证。
为证明本发明核酸探针对柱孢菌的特异性响应，选取6种没有感染柱孢菌的常见食用菌：亚历山大杯伞、烟色垂膜菇、微黄木瑚菌、条柄铦囊蘑、鳞盖口蘑、荷叶离褶伞，以及食用菌中另一种常见的内生菌青霉菌，与柱孢菌一同提取总DNA并进行PCR扩增，以本发明核酸探针进行原位杂交，检测结果如图1所示。
结果显示没有感染柱孢菌的食用菌以及柱孢菌均没有被检测，只有柱孢菌检测位点显色，证明本发明设计的靶序列及对应的核酸探针和专用引物可以特异性的检测出柱孢菌。
继而收集了多份不同的柱孢菌样本提取总DNA，以本发明专用引物进行PCR扩增，与核酸探针原位杂交，检测结果显示所有柱孢菌样本的杂交结果均呈阳性，证明具有专属性。
实施例7：核酸探针的检测特异性。
为进一步验证本发明核酸探针的可靠性和分辨率，选取另外7种不同的核酸探针，与本发明所述核酸探针共同对柱孢菌总DNA的PCR扩增产物进行原位杂交。其中核酸探针8为本发明采用的核酸探针。
核酸探针1：5'NH3-TTTTTTTTTTTTACACGGGTGGGGAGGTTGGACCCAGGA-3'。
核酸探针2：5'NH3-TTTTTTTTTTTTGAAAAGATAGACCAGAAATATAAGAGA-3'。
核酸探针3：5'NH3-TTTTTTTTTTTTACCTCGGAAAATAGAATCCAGGTCTA-3'。
核酸探针4：5'NH3-TTTTTTTTTTTTAAGTGTATATGGACAAAGGCGAGGGGCG-3'。
核酸探针5：5'NH3-TTTTTTTTTTTTAGGCGTGCACATACATGCTCCGAAGGAG-3'。
核酸探针6：5'NH3-TTTTTTTTTTTTCTCAAGGACTGAATTACATTCATTACA-3'。
核酸探针7：5'NH3-TTTTTTTTTTTTCAACCCCCACATCCAAACCTAACCAAAC-3'。
核酸探针8：5'NH3-TTTTTTTTTTTTGACGGCGGGCGCGCGGCTCCCGGAGGTG-3'。
鉴别试验过程同实施例5。检测结果显示，只有核酸探针8对柱孢菌呈阳性显示，其他核酸探针均为阴性显示，说明本发明核酸探针对柱孢菌具有非常高的特异性，能将柱孢菌与其他真菌区分开。
SEQUENCE LISTING
〈110〉 山西省农业科学院食用菌研究所
〈120〉 一种柱孢菌鉴别用分子标记及引物和探针
〈160〉 4
〈170〉 Patentin version 3.2
〈210〉 1
〈211〉 548
〈212〉 DNA
〈213〉 柱孢菌 Cylindrocarpon
〈400〉 1
CATTACCGAG TTTACAACTC CCAAACCCCT GTGAACATAC CATTACCGTT GCTTCGGCGG 60
ACCACCCCGA CCCCTACGGG GCGAAGGGCC CGCCAGAGGA CACCTAAAAT TCAAATGTAT 120
TTTGCCCTGA AAACTTTATT CTGAGTGGAA TTTTTAAATA AATCAAAACT TTCAACAACG 180
GATCTCTTGG CTCTGGCATC GATGAAGAAC GCAGCGAAAT GCGATAAGTA ATGTGAATTG 240
CAGAATTCAG TGAACCATCG AATCTTTGAA CGCACATTGC GCCCGCCAGT ATTCTGGCGG 300
GCATGCCTGT TCGAGCGTCA TTTCAACCCT CAAGCCCCCG GGCTTGGTGT TGGGGATCGG 360
CACAAGGCGC TGGCACCTCC GGGAGCCGCG CGCCCGCCGT CCCCCAAATC CAGTGGCGGT 420
TCGCGCCGTG TGTACCTCAG CGTAGTAGCA ACGACTCGCT CCGGGACCCT CCTGCGAACC 480
ACGCCGTAAA ACCCCCGACT TTTTTTCTGG TTGACCTCGA ATCAGGTAGG ACTACCCGCT 540
GAACTTAA 548
〈210〉 2
〈211〉 20
〈212〉 DNA
〈213〉 正向引物
〈400〉 2
TGTATTTTGC CCTGAAAACT 20
〈210〉 3
〈211〉 21
〈212〉 DNA
〈213〉 反向引物
〈400〉 3
GTTTTACGGC GTGGTTCGCA G 21
〈210〉 4
〈211〉 40
〈212〉 DNA
〈213〉 探针
〈400〉 4
TTTTTTTTTT TTGACGGCGG GCGCGCGGCT CCCGGAGGTG 40