耐除草剂大豆SHZD32‑1及其衍生品种的定性PCR检测方法与流程

本发明涉及耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种的定性PCR检测方法，属于耐除草剂大豆的定性检测领域。
背景技术：
：近年来，随着基因工程技术的飞速发展，转基因作物种植面积和转基因作物品种都大量增加，同时转基因植物及其产品安全性也引起全球范围内的关注和担忧。为了有效监管转基因植物及其产品，保障消费者的合法权益，目前，包括中国在内的全世界50多个国家颁布并实施了转基因生物安全标识制度和配套的管理规定。中国的基因工程育种技术发展迅速，近年来育成了一系列的转基因品种作物，因此制定相关的转基因生物安全评价方法显得尤其重要。在转基因作物及其产品安全检测方法中，PCR技术以其灵敏度高、稳定性好、准确性强、操作简便成为国际上转基因植物及其产品检测的主要方法，中国近年来颁布的转基因生物及其产品安全评价方法也是以PCR检测方法为主。根据检测目的基因的不同，PCR检测方法分为筛查、基因特异性、构建特异性和转化体特异性检测；其中，转化体特异性检测方法的特异性最高，筛查检测和转化体特异性检测方法是实际检测中应用最广泛的方法。筛查检测方法主要用于初步检测样品中是否含有转基因成分，转化体特异性检测方法可以准确确定转基因植物的身份。转基因耐草甘膦大豆SHZD32-1由上海交通大学研发，利用农杆菌介导法将密码子经优化的耐草甘膦基因G10-EPSPS导入了栽培大豆品种“中豆32”获得转G10-EPSPS基因的耐草甘膦大豆SHZD32-1。G10是一个新的5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因。温室试验和中间试验表明，转G10基因耐草甘膦大豆的耐草甘膦性能良好，能够达到耐除草剂的运用水平，已经获批进行环境试验。到目前为止，中国尚未发布专门针对耐草甘膦大豆SHZD32-1及其衍生品种检测的方法，迫切需要尽快制定相关检测方法，为中国转基因生物安全管理部门实施各项安全管理制度提供科学方法和技术支撑。技术实现要素：本发明所要解决的第一个技术问题是提供用于检测耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种的特异性PCR检测引物对；本发明所要解决的第二个技术问题是建立一种耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种的定性PCR检测方法。为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：本发明根据耐除草剂大豆SHZD32-1的RB(5′端)和LB(3′端)两端侧翼序列，在分析两侧翼序列的基础上，在左边界设计了8条正向引物和8条反向引物，右边界设计7条正向引物和8条反向引物，选择左右边界扩增片段长度均在150～400bp之间的40对引物用于测试。本发明分别以1％和0.1％两个浓度的大豆DNA为模板，使用常规体系和扩增条件进行PCR扩增，对上述40对引物进行初步筛选。根据引物的扩增特异性、稳定性及灵敏度，本发明筛选获得扩增效果较好的3对特异性检测引物，能够用于耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种的定性PCR检测，所述3对特异性PCR检测引物的序列如下：引物对1(RB6F/5R)：由SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示核苷酸序列组成；引物对2(RB5F/5R)：由SEQIDNo.3和SEQIDNo.2所示核苷酸序列组成；引物对3(LB3F/3R)：由SEQIDNo.4和SEQIDNo.5所示核苷酸序列组成。本发明进一步对所述3对引物进行PCR反应体系和条件的优化。以1％浓度的基因组DNA为模板，分别设置引物浓度为0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM，退火温度分别设置为54℃、56℃、58℃、60℃、62℃。结果表明，引物组合RB6F/5R(即引物对1)在多次PCR实验中稳定性突出，而且在引物浓度为0.2μM、退火温度58℃时扩增效率达到较高水平、无非特异性扩增、引物二聚体少。因此，本发明选择目的片段为234bp的引物对RB6F/5R作为耐除草剂大豆SHZD32-1转化体特异性定性检测引物。本发明将筛选到的引物组合RB6F/5R命名为SHZD32-1F、SHZD32-1R。本发明所述的特异性PCR检测引物对能够应用于检测耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种。本发明进一步公开了一种耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种的定性PCR检测方法，包括以下步骤：(1)提取待检测大豆样品的DNA；(2)以提取的DNA为模板，分别以引物对1-3为扩增上下游引物，建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；(3)如果从待检测样品中扩增出目的条带，则待检测的大豆样品是耐除草剂大豆SHZD32-1或其衍生品种；如果从待检测样品中未能扩增出目的条带，则待检测的大豆样品不是耐除草剂大豆SHZD32-1或其衍生品种。进一步优选的，一种耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种的定性PCR检测方法，包括以下步骤：(1)提取待检测大豆样品的DNA；(2)以提取的DNA为模板，以引物对1为扩增上下游引物，建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；(3)如果从待检测样品中扩增出234bp的条带，则待检测的大豆样品是耐除草剂大豆SHZD32-1或其衍生品种；如果从待检测样品中未能扩增出234bp的条带，则待检测的大豆样品不是耐除草剂大豆SHZD32-1或其衍生品种。本发明还提供了一种较优的耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种的定性PCR检测方法，包括以下步骤：(1)提取待检测大豆样品的DNA；(2)以提取的DNA为模板，以引物对2为扩增上下游引物，建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；(3)如果从待检测样品中扩增出252bp的条带，则待检测的大豆样品是耐除草剂大豆SHZD32-1或其衍生品种；如果从待检测样品中未能扩增出252bp的条带，则待检测的大豆样品不是耐除草剂大豆SHZD32-1或其衍生品种。本发明还提供了另一种较优的耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种的定性PCR检测方法，包括以下步骤：(1)提取待检测大豆样品的DNA；(2)以提取的DNA为模板，以引物对3为扩增上下游引物，建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；(3)如果从待检测样品中扩增出229bp的条带，则待检测的大豆样品是耐除草剂大豆SHZD32-1或其衍生品种；如果从待检测样品中未能扩增出229bp的条带，则待检测的大豆样品不是耐除草剂大豆SHZD32-1或其衍生品种。本发明所述的定性PCR检测方法中，所述PCR扩增体系包括：反应体系总体积为25.0μL；其中，10×PCR缓冲液2.5μL，25mmol/L氯化镁溶液1.5μL，dNTPs混合溶液2.0μL，10μmol/L上游引物0.5μL，10μmol/L下游引物0.5μL，终浓度为0.025U/μL的TaqDNA聚合酶，25mg/LDNA模板2μL，余量为双蒸水。所述PCR扩增的程序包括：95℃变性5min；95℃变性30s，54-62℃退火45s，72℃延伸45s，共进行35次循环；72℃延伸7min。优选的，所述PCR扩增的程序包括：95℃变性5min；95℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸45s，共进行35次循环；72℃延伸7min。本发明还公开了一种耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种的定性PCR检测试剂盒，包括：10×PCR缓冲液，氯化镁溶液，dNTPs混合溶液，检测上下游引物对，TaqDNA聚合酶和双蒸水；其中，所述检测上下游引物对为引物对1-3中的任意一对，优选为引物对1。特异性检测结果表明，本发明方法仅从耐除草剂大豆SHZD32-1样品中扩增到预期DNA片段，而在其他样品中均未扩增到预期大小的条带，表明本发明建立的耐除草剂大豆SHZD32-1的定性PCR检测方法具有高度特异性。灵敏度测试结果表明，在耐除草剂大豆SHZD32-1基因组DNA含量为0.1％以上(含0.1％)的样品中，均能稳定扩增到预期DNA片段，证明本发明方法的灵敏度能够达到0.1％。检出限测试结果表明，以质量分数为0.1％的耐除草剂大豆SHZD32-1基因组DNA为模板进行60次PCR扩增，60个反应均能稳定检测出预期DNA，表明本发明方法的检出限为0.1％。本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：本发明根据耐除草剂大豆SHZD32-1的两端侧翼序列，设计并筛选获得3对特异性检测引物，灵敏度高、特异性强、扩增效率高，能够用于耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种的定性PCR检测。本发明利用所述特异性检测引物建立的耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种的定性PCR检测方法，具有高度特异性，检测灵敏度度高，检出限低。附图说明图1为耐除草剂大豆SHZD32-1的载体图(A)与整合示意图(B)；图2为耐除草剂大豆SHZD32-1引物组合筛选；其中，A为LB引物筛选；B为RB引物筛选；图3为3对引物反应体系和条件的筛选；图4为扩增靶标序列；其中，单划线部分为SHZD32-1F和SHZD32-1R引物序列；1～108bp为外源插入片段部分序列，109～234bp为大豆基因组部分序列；图5为耐除草剂大豆SHZD32-1引物特异性检测；图6为耐除草剂大豆SHZD32-1引物灵敏度测试；图7为耐除草剂大豆SHZD32-1检测限确定。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。实施例1耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种的定性PCR方法的建立1、耐除草剂大豆SHZD32-1分子特征耐除草剂大豆SHZD32-1的表达载体为P1300(图1)，表达框内含有CaMV35S启动子、新型EPSPS基因及CaMV35S-polyA作为终止子，研发者Southern杂交表明，耐除草剂大豆SHZD32-1基因组中整合了单一拷贝的表达框。5′端分离到序列长度为517bp的侧翼序列，0-299bp比对到载体上，251-517bp比对到大豆基因组参考序列上，比对到参考序列上的坐标为Gm15:15989180-15989446bp；3′端分离到序列长度为456bp的侧翼序列，0-456bp比对到参考序列上，比对到参考序列上的坐标为Gm15:15990978-15991438bp，450-502bp比对到载体上。2、主要技术参数确定原则2.1引物筛选普通PCR方法，采用通用的PCR扩增程序，通用的PCR反应体系的条件下，比对靶标序列特异性情况，在特异性区域设计不同的引物，组合成不同引物组合，通过对相似样品的测试，根据引物扩增条带清晰度、非特异性扩增以及引物二聚体等，选择表现相对好的引物对作为候选引物对。2.2反应退火温度和引物浓度的宽容度测试普通PCR方法，根据目前中国检测标准中体系和反应条件情况，设置引物浓度0.1-0.5uM，退火温度54-62℃进行下次测试，根据扩增条带的亮度及扩增的特异性等表现，选择合适的引物浓度和扩增退火温度。2.3检测方法特异性测试选用不同作物及其主要的商业化转化体进行测试，验收标准是仅在阳性样品中获得预期的扩增。2.4检测方法的检出限转基因的检出限(Limitofdetection,LOD)一般是指不低于95％的检出情况下的转基因含量，严格的测试实验是在60次平行中至少检出59次阳性。3、主要技术参数确定过程3.1引物设计与筛选根据研发者提供的耐除草剂大豆SHZD32-1的RB(5′端)和LB(3′端)两端侧翼序列，在分析了两侧翼序列的基础上，使用primer5.0在左边界设计了8条正向引物和8条反向引物，右边界设计7条正向引物和8条反向引物(见表1)，根据农业部2259号公告-4-2015《转基因植物及其产品成分检测定性PCR方法制定指南》对普通PCR产物推荐的长度为120～300bp的建议，选择左右边界扩增片段长度均在150～400bp之间20对引物(见表2)用于测试。提取大豆基因组DNA，分别稀释到1％和0.1％，分别以两个浓度DNA为模板，使用本实验室常用的体系和扩增条件进行PCR扩增，分别对表2的40对引物进行初步的特异性、灵敏度和工作效率的筛选，选出灵敏度高、特异性强、扩增效率高的引物进行PCR体系和扩增条件的优化。表1所设计引物的序列信息RB引物引物序列(5′-3′)LB引物引物序列(5′-3′)RB-1FCGTTACCCAACTTAATCGCLB-1FTTCATTGCCTCAACCTATRB-2FCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGLB-2FCTCAAAGTCACTCATTATTGGAACCRB-3FGCGTAATAGCGAAGAGGCLB-3FGTCACTCATTATTGGAACCCTARB-4FCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACALB-4FCTCATTATTGGAACCCTARB-5FCCTGAATGGCGAATGCTALB-5FCATCCCCTTCCCCCTTCGCTGTTGCRB-6FGAGCAGCTTGAGCTTGGALB-6FCAACTCATTGCACAAAGACCCCCTARB-7FCTTGGAGCAGATTGTCGTLB-7FCCCTAACCGTCTATTTCARB-8FCGGTTCCGACCACCACGAGALB-1RTCTAATTCCTAAAACCAAAATCCAGRB-1RCTCCATCAACCAAGAGCAACALB-2RTTGTAAAATACTTCTATCAATAAAARB-2RCCTTCACCATCTCATCCCLB-3RGAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTRB-3RTGTTCTAAGCCCCTTCACCATLB-4RGTGAGTAGTTCCCAGATAARB-4RCCATCATGGGTGATGTTCTAAGCCCLB-5RTCTCCATAATAATGTGTGAGTAGTTRB-5RCGAATTTCACCAAAACACTAALB-6RAATACGCTGAGGCTACCGRB-6RACTTTCTTCAAAACTTGTGTTCTCTLB-7RCCTACCCTCAGTTCTTCGRB-7RTAGATAAGGCCATAAGGGTGTLB-8RATCAGAAAGTCCTACCCTRB-8RCCTCATTGAATAGATAAGGCCATAA表2左右两端的引物组合编号RB引物片段长度编号LB引物片段长度1RB3F/3R262bp1LB1F/2R361bp2RB3F/4R275bp2LB1F/3R385bp3RB3F/5R303bp3LB2F/3R235bp4RB3F/6R331bp4LB2F/4R301bp5RB3F/7R379bp5LB2F/5R316bp6RB5F/2R200bp6LB2F/7R400bp7RB5F/4R224bp7LB3F/2R205bp8RB5F/5R252bp8LB3F/3R229bp9RB7F/2R170bp9LB3F/4R295bp10RB5F/8R338bp10LB3F/5R310bp11RB6F/3R193bp11LB4F/3R225bp12RB6F/5R234bp12LB4F/4R291bp13RB7F/3R181bp13LB4F/5R306bp14RB7F/4R190bp14LB4F/6R342bp15RB7F/5R222bp15LB5F/1R154bp16RB7F/6R250bp16LB5F/2R181bp17RB7F/8R308bp17LB5F/3R205bp18RB6F/3R193bp18LB5F/4R286bp19RB6F/5R234bp19LB6F/6R298bp20RB6F/2R182bp20LB6F/4R217bp根据引物的扩增特异性、稳定性及灵敏度的结果发现，这40对引物中仅有RB5F/5R(8)、RB6F/5R(12)和LB3F/3R(8)这3对引物组合在灵敏度、特异性或扩增效率上初步能够符合检测要求，而其余的37对引物在灵敏度、特异性或扩增效率上均明显不能满足检测要求；因此，本发明进一步选择引物组合RB5F/5R(8)、RB6F/5R(12)、LB3F/3R(8)作为候选引物对组合，并对这3对引物组合进行PCR反应体系和条件的优化，右端和左端的引物组合的一次扩增结果见图2。3.2筛选到的3对引物的PCR反应体系和扩增条件的优化以1％浓度的基因组DNA为模板，分别设置引物浓度为0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM，配置PCR体系，退火温度分别设置为54℃、56℃、58℃、60℃、62℃。其中，引物组合RB6F/5R在多次PCR实验中稳定性突出，而且在引物浓度为0.2μM、退火温度58℃时扩增效率达到较高水平、无非特异性扩增、引物二聚体少；相比来说，引物组合RB5F/5R(8)以及LB3F/3R(8)在多次PCR实验中所表现出的稳定性结果明显劣于引物对RB6F/5R，不仅扩增效率较低，而且存在一定的非特异性扩增和引物二聚体等现象(图3)。因此本发明最终优选目的片段234bp引物对RB6F/5R作为耐除草剂大豆SHZD32-1转化体特异性定性检测引物；扩增靶标序列见图4。根据检测引物的Tm值以及扩增结果稳定性，确定了表3所述的引物对RB6F/5R的反应体系以及如下反应程序：95℃变性5min；95℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸45s，共进行35次循环；72℃延伸7min，10℃保存。表3中将筛选到的引物组合RB6F/5R的名称改为SHZD32-1F、SHZD32-1R。表3扩增体系3.3特异性检测检测结果表明，仅从耐除草剂大豆SHZD32-1样品中扩增到预期DNA片段，而在其他样品中均未扩增到预期大小的条带，表明本发明建立的耐除草剂大豆SHZD32-1检测方法具有高度特异性。特异性检测结果见图5。3.4灵敏度测试将耐除草剂大豆SHZD32-1基因组DNA分别稀释到10％、5％、1％、0.1％、0.05％的浓度，进行PCR扩增。结果显示，在含量为0.1％以上(含0.1％)的样品中均能稳定扩增到预期DNA片段(见图6)，表明方法的灵敏度可达到0.1％。3.5检出限测试为确定本方法的稳定检测下限，以质量分数为0.1％的耐除草剂大豆SHZD32-1基因组DNA为模板，进行60次PCR扩增。结果如图7所示，60个反应均能稳定检测出预期DNA，表明本标准方法的检出限为0.1％。SEQUENCELISTING<110>浙江省农业科学院<120>耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种的定性PCR检测方法<130>ZJ-2001-170101A<160>5<170>PatentInversion3.5<210>1<211>18<212>DNA<213>artificalsequence<400>1gagcagcttgagcttgga18<210>2<211>21<212>DNA<213>artificalsequence<400>2cgaatttcaccaaaacactaa21<210>3<211>18<212>DNA<213>artificalsequence<400>3cctgaatggcgaatgcta18<210>4<211>22<212>DNA<213>artificalsequence<400>4gtcactcattattggaacccta22<210>5<211>25<212>DNA<213>artificalsequence<400>5gaaacccttagtatgtatttgtatt25当前第1页1 2 3