应用于质粒DNA提取的快速沉淀缓冲液及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及一种应用于质粒DNA提取的快速沉淀缓冲液、纯化质粒DNA的方法、制备质粒DNA的方法、该缓冲液在制备、纯化质粒DNA中的用途和试剂盒。

背景技术：

质粒DNA的提取和纯化是分子生物学的基本步骤之一，涉及了基因克隆、基因序列分析、核酸疫苗、基因治疗和各种基因重组等领域。质粒一般有三种构象，即超螺旋，线形和开环质粒(开环质粒是指双链环状的质粒DNA有部分解链，因此电泳速度最慢)。三种构象的质粒在琼脂糖电泳的前后顺序是超螺旋>线形>开环，线形的质粒在中间，而开环的质粒在最后。判断质粒好坏的一个指标就是超螺旋质粒的含量多少。因为用质粒转染真核细胞时，超螺旋的质粒效率最高，所以要求质粒中超螺旋质粒的含量要在90％以上，这也是对作为核酸疫苗重组质粒的要求。从原核生物中提取和纯化质粒DNA的经典步骤为：菌体裂解、质粒分离和纯化。目前菌体裂解最常用的方法有：一步法质粒提取法和碱裂解法。一步法质粒提取法是由德国Eppendorf公司发明。它是一种基于溶菌酶裂解细菌的提取方法。该方法使用含有溶菌酶和去污剂的裂解液裂解细胞，裂解产物澄清无粘性，裂解后无需离心可直接与过滤膜进行结合，然后通过快速离心的清洗和洗脱得到超螺旋的质粒DNA。该提取方法虽然方便，快捷和重复性好，但不适合于低拷贝质粒的提取和丰富培养基培养大肠杆菌质粒的提取。碱裂解法质粒DNA纯化技术是1979年由Birnboim&Doly发明。该方法仍是分子克隆研究中最常用的方法之一，其操作包括三种溶液处理，一般需要20分钟左右的时间才能完成质粒的提取。该提取方法适用面较广，重复性好，但实验周期相对较长，超螺旋质粒含量低，影响了研究者的实验进程。

现有质粒DNA的提取和纯化方法仍然有待改进。

技术实现要素：

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

本发明是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

基于碱裂解法，采用一种创新的应用于质粒DNA提取的快速沉淀缓冲液，可以对整个质粒提取流程进行优化。快速沉淀缓冲液综合离液盐和表面活性剂的效果，可以促进质粒提取过程中的变性蛋白形成更紧密的团块，避免形成絮状的漂浮在溶液表面的蛋白物质。极大的缩短了离心的时间，可以使整个质粒提取由传统的20分钟缩短到6分钟左右，同时超螺旋质粒含量在90％以上，不仅能用于高拷贝和低拷贝质粒的提取，也适用于不同培养基培养大肠杆菌质粒的提取，大大节省了实验研究者的时间，提高了实验效率。

根据本发明的第一方面，本发明提出一种应用于质粒DNA提取的快速沉淀缓冲液，包含：碘化钠；十二烷基肌氨酸钠；脱氧胆酸钠；3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸；乙酸钾；乙酸；以及去离子水。

本发明中所述应用于质粒DNA提取的快速沉淀缓冲液相对于现有的缓冲液，添加了碘化钠、十二烷基肌氨酸钠、脱氧胆酸钠和3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸，其中，碘化钠是一种离液盐，可以起到裂解细胞、变性蛋白，提高溶液体系中的盐浓度，并使释放的蛋白和核酸吸附到硅胶吸附膜上的作用。而十二烷基肌氨酸钠、脱氧胆酸钠和3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸均属于表面活性剂类的化学试剂，对细胞起到辅助裂解作用，并且在离液盐存在的条件下，可以是质粒提取过程中形成的变性蛋白形成更紧密的团块，避免形成絮状的漂浮在溶液表面的蛋白物质，极大的缩短了离心的时间。同时，乙酸钾和乙酸使缓冲液处于酸性环境，起到中和作用，使碱裂解出的质粒起到复性的作用。从而，碱裂解后加入该应用于质粒DNA提取的快速沉淀缓冲液，使得大部分蛋白质、基因组DNA、非超螺旋质粒DNA和RNA都以不溶物状态存在，离心1min后即可将所有不溶物沉淀到管底，上清即可进行下一步操作。极大的缩短了离心的时间，可以使整个质粒提取由传统的20分钟缩短到6分钟左右，同时超螺旋质粒含量在90％以上，不仅能用于高拷贝和低拷贝质粒的提取，也适用于不同培养基培养大肠杆菌质粒的提取，大大节省了实验研究者的时间，提高了实验效率。

根据本发明的一些实施例，所述应用于质粒DNA提取的快速沉淀缓冲液，基于100ml所述缓冲液，所述缓冲液包含：碘化钠60～75克；十二烷基肌氨酸钠0.25-0.5克；脱氧胆酸钠0.25-0.5克；3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸0.5-1.5克；乙酸钾2～6克；乙酸1～5毫升；以及余量去离子水。利用所述应用于质粒DNA提取的快速沉淀缓冲液，整个优化的质粒提取流程可在6分钟内完成，同时超螺旋质粒含量在90％以上，大大节省了实验研究者的时间，进一步地提高了实验效率。

根据本发明的第二方面，本发明提供一种纯化质粒DNA的方法，包括：

(1)将含有质粒DNA的样品与前述应用于质粒DNA提取的快速沉淀缓冲液进行混合；

(2)将步骤(1)中所得到的混合液进行离心，并收集上清液；以及

(3)将步骤(2)中所获得的上清液进行亲和层析处理，以便获得经过纯化的质粒DNA。利用所述方法，质粒提取流程可在6分钟内完成，同时超螺旋质粒含量在90％以上，大大节省了实验研究者的时间，提高了实验效率。并且所述方法具有高效、快速、简洁，利用所述方法纯化获得的质粒DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接、转化、文库筛选、体外翻译、转染一些常规的传代细胞等。

根据本发明的一些实施例，所述含有质粒DNA的样品是通过对含有质粒DNA的微生物进行碱裂解而获得的。

根据本发明的一些实施例，所述碱裂解包括：

(a-1)将悬浮液加入所述含有质粒DNA的微生物中，以便获得第一溶液；

(a-2)将碱裂解液加入所述第一溶液中，以便获得所述含有质粒DNA的样品。由此，可以进一步地提高实验效率。

根据本发明的一些实施例，所述悬浮液、所述碱裂解液和所述应用于质粒DNA提取的快速沉淀缓冲液的体积比为5:5:14。由此，可以进一步地提高实验效率。

根据本发明的一些实施例，所述方法中将含有质粒DNA的样品与所述应用于质粒DNA提取的快速沉淀缓冲液进行混合1min后，将所得到的混合液进行离心，并收集上清液。由此，可以进一步地缩短实验时间，提高实验效率。

根据本发明的一些实施例，所述方法中采用硅膜吸附柱进行所述亲和层析处理。

根据本发明的第三方面，本发明提出一种制备质粒DNA的方法，包括：

(1)将1～3毫升含有质粒的大肠杆菌在培养基中进行培养后，于13000转/分钟，离心1min，以便获得沉淀物；

(2)将75微升悬浮液加入所述沉淀中，涡旋振荡至沉淀完全溶解，以便获得第一溶液；

(3)将75微升碱裂解液加入所述第一溶液中，温和地上下翻转至溶液澄清，以便获得第二溶液；

(4)将210微升权利要求1或2所述应用于质粒DNA提取的快速沉淀缓冲液加入至所述第二溶液中，以便获得第三溶液；

(5)将所述第三溶液于13000转/分钟离心1min，以便获得上清液；

(6)将所述上清液移入硅膜吸附柱中，于13000转/分钟离心1min除去废液，加入300微升漂洗液，于13000转/分钟离心30s除去废液，加入50～100微升洗脱缓冲液，进行洗脱离心，以便获得含有质粒DNA溶液。利用所述方法，质粒提取流程可在6分钟内完成，同时超螺旋质粒含量在90％以上，大大节省了实验研究者的时间，提高了实验效率。并且所述方法具有高效、快速、简洁，利用所述方法纯化获得的质粒DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接、转化、文库筛选、体外翻译、转染一些常规的传代细胞等。

根据本发明的第四方面，本发明提出前述缓冲液在制备、纯化质粒DNA中的用途。

根据本发明的第五方面，本发明提出一种试剂盒，包括：前述应用于质粒DNA提取的快速沉淀缓冲液。利用本发明所述试剂盒，质粒提取流程可在6分钟内完成，同时超螺旋质粒含量在90％以上，大大节省了实验研究者的时间，提高了实验效率；并且所述试剂盒操作简单，快速，制备获得的质粒DNA含量和质量高，并且纯化获得的质粒DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接、转化、文库筛选、体外翻译、转染一些常规的传代细胞等。

根据本发明的一些实施例，所述试剂盒，进一步包括：悬浮液；碱裂解液；漂洗液；洗脱液。由此，可以进一步地缩短实验时间、提高实验效率。

附图说明

图1是根据本发明的实施例1，纯化获得的高拷贝质粒pBS的琼脂糖凝胶电泳检测图。

图2是根据本发明的实施例2，纯化获得的低拷贝质粒pBR322的琼脂糖凝胶电泳检测图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例

实施例1：从大肠杆菌培养物中提取高拷贝质粒pBS。

(1)对1.5毫升过夜培养的大肠杆菌菌液进行离心分离，离心分离的转速为13000转/分钟，离心分离的时间为1min，取出离心分离的沉淀物；

(2)向上述沉淀物中加入75微升悬浮液(50mM葡萄糖、25mM三羟甲基氨基甲烷、10mM乙二胺四乙酸，pH 8.0)，涡旋振荡至沉淀完全溶解；

(3)向上述溶液中加入75微升碱裂解液(0.2N氢氧化钠、1％(质量百分比)十二烷基硫酸钠)，温和地上下翻转6～8次使菌体充分裂解；向上述溶液中加入210微升快速沉淀缓冲液，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀。然后对该混合物进行离心分离，离心分离的转速为13000转/分钟，离心分离时间为1分钟。其中的快速沉淀缓冲液，碘化钠65克；十二烷基肌氨酸钠0.3克；脱氧胆酸钠0.3克；3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸1.0克；乙酸钾4克；乙酸4毫升；以及去离子水补足至100ml。

(4)将步骤(4)中上清液转入硅膜吸附柱(天根生化科技(北京)有限公司产品，目录号RK132)中，进行吸附离心，离心吸附的转速为13000转/分钟，离心吸附时间为30秒，倒去废液；

(5)向步骤(5)的硅膜吸附柱中加入300微升漂洗液(80％体积百分比的乙醇)，进行脱盐离心，脱盐离心的转速为13000转/分钟，脱盐离心时间为30秒，倒去废液。

(6)在步骤(6)的硅膜吸附柱中加入50～100微升洗脱缓冲液(10mM三羟甲基氨基甲烷，pH 8.0)，进行洗脱离心，洗脱离心的转速为13000转/分钟，洗脱离心时间为30秒，得到含有质粒DNA溶液。

(7)将步骤(7)中获得的质粒DNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图1，其中，泳道1：脱氧核糖核酸分子量标准(MarkerⅣ)，泳道2：实施例1纯化获得的质粒DNA。

实施例2：从大肠杆菌培养物中提取低拷贝质粒pBR322。

(1)对3毫升过夜培养的大肠杆菌菌液进行离心分离，离心分离的转速为13000转/分钟，离心分离的时间为1min，取出离心分离的沉淀物；

(2)向上述沉淀物中加入75微升悬浮液(50mM葡萄糖、25mM三羟甲基氨基甲烷、10mM乙二胺四乙酸，pH 8.0)，涡旋振荡至沉淀完全溶解；

(3)向上述溶液中加入75微升碱裂解液(0.2N氢氧化钠、1％(质量百分比)十二烷基硫酸钠)，温和地上下翻转6～8次使菌体充分裂解；

(4)向上述溶液中加入210微升快速沉淀缓冲液，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀。然后对该混合物进行离心分离，离心分离的转速为13000转/分钟，离心分离时间为1分钟。其中的快速沉淀缓冲液，碘化钠65克；十二烷基肌氨酸钠0.3克；脱氧胆酸钠0.3克；3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸1.0克；乙酸钾4克；乙酸4毫升；以及去离子水补足至100ml。

(5)将步骤(4)中上清液转入硅膜吸附柱(天根生化科技(北京)有限公司产品，目录号RK132)中，进行吸附离心，离心吸附的转速为13000转/分钟，离心吸附时间为30秒，倒去废液；

(6)向步骤(5)的硅膜吸附柱中加入300微升漂洗液(80％体积百分比的乙醇)，进行脱盐离心，脱盐离心的转速为13000转/分钟，脱盐离心时间为30秒，倒去废液。在步骤(6)的硅膜吸附柱中加入50～100微升洗脱缓冲液(10mM三羟甲基氨基甲烷，pH 8.0)，进行洗脱离心，洗脱离心的转速为13000转/分钟，洗脱离心时间为30秒，得到含有质粒DNA溶液。

(7)将步骤(6)中获得的质粒DNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图2，其中，泳道1：脱氧核糖核酸分子量标准(MarkerⅣ)，泳道2：实施例2纯化获得的质粒DNA。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。