一种基于3D打印技术的细胞图案化培养的装置及方法与流程

本发明属于3d打印技术和细胞培养技术领域，具体地，本发明涉及一种能够以3d打印为基础快速制备的细胞图案化共培养的装置及方法。

背景技术：

细胞的图案化主要目的是使细胞生长在预先设定的区域，形成特定图案。微图案化技术可以在微米尺度下控制细胞的空间分布，因此对组织工程、生物传感器技术，以及基础生物学问题的研究具有重要意义。微图案化技术可以对包括细胞群落大小、群落间的距离、同种或异种细胞间的相互作用进行直接调控，而对于这些空间参数的控制可以直接影响细胞的代谢和细胞功能。例如，人类脐静脉内皮细胞的大小和所占据的空间会直接影响其分化趋向，而巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞间的相互作用会促进内皮细胞的血管生成趋势。因此，细胞的微图案化技术显然是一种研究细胞行为和功能的强有力的生物医学工程工具。

在过去的十年中，细胞图案化技术已经被广泛应用于研究细胞间相互作用、细胞对所处环境的响应、细胞极化生长、细胞分化、以及细胞的其他功能。大致说来，细胞图案化的方法可被归为两大类：一类是使用不同的化学试剂，如自组装单分子层和人类纤维蛋白，对培养载体的表面进行修饰，使其排斥或促进细胞的贴附；另一类是使用物理方法把细胞固定在特定区域，典型的有微加工制成的管道、微坑、隔断及小钩。有一些报道将这两种方法巧妙地结合起来研究细胞间的相互作用。

但是，目前利用物理方法实现细胞图案化的加工过程普遍较为复杂，比如光刻技术和软光刻技术，其制备装置过程较复杂，需要特定的仪器设备，一般实验室很难实现。随着3d打印技术的逐渐发展和进步，其能实现多尺度下的制造。3d打印，又称增材制造，属于快速成形技术的一种，它是一种数字模型文件为基础制造几乎任何形状的三维实体的技术。3d打印运用粉末状金属或塑料等可粘合材料，通过逐层堆叠积累的方式来构造物体，即“层造形法”。3d打印与传统的机械加工技术不同，后者通常采用切削或钻孔技术（即减材工艺）实现。过去其常在模具制造、工业设计等领域被用于制造模型，现正逐渐用于一些产品的直接制造。特别是一些高价值应用已经有使用这种技术打印而成的零部件，意味着“3d打印”这项技术的普及。现在市面上的3d打印机已经实现微米尺度的制造，而且精度也逐年提高。值得注意的是3d打印技术在生物医学工程领域的应用还处于探索阶段，很多研究集中在对支架和骨质关节等的修复方面，而面对细胞生物学、组织工程等方面的应用并不多见。

利用3d打印制造微米级精度的装置并将之应用在细胞生物学特别是细胞微图案化上的发明还未见到报道。

技术实现要素：

针对上述问题，本申请提供了一种能够利用3d打印快速制备用于细胞培养和细胞图案化共培养的微器件技术，并且该器件能够方便地与现有细胞生物技术相互兼容，如显微成像，细胞免疫染色等。能够方便地实现对多种细胞的图案化，并能够对细胞进行显微成像分析和免疫组化分析，得到定量化的结果。为科研人员能够更快速方便地实现多种细胞的共培养提供了装置和方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种基于3d打印技术的多细胞图案化培养的装置，其特征在于，

所述装置包括多组同心设置的中空管体，每组中空管体包括一个外中空管体及至少一个内中空管体，内中空管体的底端与外中空管体的底端同心；所述装置采用3d打印技术制备，中空管体的底端均设置在细胞培养器具上，内中空管体的底端可移出细胞培养器具；内中空管体的外径小于外中空管体的内径。在内中空管体、外中空管体与内中空管体之间的空白区域分别添入不同种类的细胞，待细胞帖壁后移除内中空管体，使多种细胞图案化相邻，同时内中空管体的壁厚使得不同细胞区域保留一定间隙，此装置可以用来方便观察多细胞间的迁移及相互作用。

进一步地，所述装置包括上部分和下部分，下部分包括多个外中空管体和下支撑部；上部分包括多个内中空管体和上支撑部，内中空管体与上支撑部相连，上支撑部和下支撑部可拆卸的相互匹配，上支撑部与下支撑部配合时使得每个内中空管体分别与一个外中空管体底端同中心设置；上支撑部和下支撑部拆卸时可使得内中空管体的底端可抽离细胞培养器具。

进一步地，内中空管体的上端内径大于内中空管体的底端内径。

进一步地，中空管体的内径从微米级到厘米级。

进一步地，通过将上下两支撑部拼插组合，能实现可逆转的封接。

进一步地，3d打印的原材料具有良好的细胞相容性和环境友好性。

一种基于3d打印技术的多细胞图案化培养的方法，其特征在于，所述方法采用权利要求1所述装置，且所述方法包括以下步骤：装置制备：利用3d打印技术制备多细胞图案化培养装置，将装置放在细胞培养器具上；

添加细胞的悬浮溶液：将细胞的悬浮溶液分别注入内中空管体、内中空管体与外中空管体之间，将其放入细胞培养箱中培养；不同中空管体内注入的细胞悬浮溶液相同或不相同；

移除内中空管体：细胞贴壁后，垂直移除内中空管体，并换上新鲜的培养基继续培养，观察细胞的迁移及相互作用。

进一步地，使用前细胞培养器具上孵育一层促进细胞贴壁的物质。

进一步地，添加细胞的悬浮溶液步骤中，细胞的悬浮溶液为成纤维细胞的悬浮液和人成纤维肉瘤细胞的悬浮液，细胞浓度均10⁵个/ml，细胞培养箱的温度为37℃、二氧化碳体积浓度为5%，培养时间为4-6小时。

进一步地，细胞培养器具为细胞培养皿或培养板，细胞培养器具的基底为玻璃、硅片、金属或高分子材料。

本发明的有益技术效果：

3d打印技术的应用打破了传统装置芯片制备对于复杂技术如光刻技术的限制，在任何实验室都可以轻松实现，降低了对实验室洁净空间及复杂设备的要求。并且可以根据实验结果实时快速更改优化设计，不用再像光刻一样重新刻模板，避免了时间和金钱的浪费。更重要的是，其能根据自己的实验快速设计出大量不同的模型或结构，相对于光刻而言对实验人员的技术要求比较低，提高了工作效率的同时，也能到达实验目的，利用本发明能够直观的观察到多种细胞的相对运动过程及相互作用。

附图说明

图1是3d打印装置的示意图；

图2是在3d打印装置中不同位置灌入不同的细胞；

图3是移除上层结构后形成的细胞图案示意图；

图4是图3其中一个的放大图；

图5是不同药物对细胞迁移影响的延时图；

图6是3d打印装置的截面示意图;

图中：a.装置下部分、b.装置上部分、c.细胞培养器具基底、a.内中空管体底端内径、b.内中空管体管壁厚度、c.内中空管外壁与外中空管内壁间距离、d.外中空管体管壁厚度、e.内中空管体上端内径、h1.内中空管高度、h2.外中空管高度。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

相反，本发明涵盖任何由权利要求定义的在本发明的精髓和范围上做的替代、修改、等效方法以及方案。进一步，为了使公众对本发明有更好的了解，在下文对本发明的细节描述中，详尽描述了一些特定的细节部分。对本领域技术人员来说没有这些细节部分的描述也可以完全理解本发明。

实施例1

如图1所示，提供了一种多细胞共培养的装置，包括：3d打印的装置及细胞培养皿或培养板基底；通过三维设计软件设计出所需要的三维图经由3d打印机制造出相应的模型作为实验装置，本装置主要以管状结构为主，内径从微米级到厘米级均能实现；所述3d打印模型设置在所述细胞培养皿或培养板基底上；所述细胞培养皿或培养板基底的基底表面不做处理，或孵育一层鼠尾胶原等促进细胞贴壁的物质。其制作过程无需复杂的光刻技术，简单方便，易于操作。

图1是3d打印装置的示意图，其主要由两部分构成，包括上部分和下部分，下部分包括九个相连的直径为1cm，高为1mm的外中空管体和下支撑部；上部分包括多个内中空管体和上支撑部，内中空管体与上支撑部相连，上支撑部和下支撑部可拆卸的相互匹配，上支撑部与下支撑部配合时使得每个内中空管体分别与一个外中空管体底端同中心设置；上支撑部和下支撑部拆卸时可使得内中空管体的底端可抽离细胞培养器具。

本实施例中下部分包括九个相连的外中空管体，和位于九个外中空管体四周的一框体，框体的两边设置有凹槽，框体作为下支撑部。

上部分包括内中空管体和一“门”形框架，“门”形框架包括一个水平杆和两个竖直杆，竖直杆和水平杆垂直。内中空管体的上端设置在水平杆上，水平杆相应位置设置有孔，该孔和内中空管体的中空孔相通。“门”形框架作为上支撑部。

框体的凹槽和“门”形框架的水平杆相适应，将水平杆插入凹槽可实现对内中空管体的固定和支撑，此时一个内中空管体的底端和一个外中空管体的底端同心设置。

本是实力中每三个外中空管体一列，九个相连的外中空管体分为三行，每个下部分需有三个相同的上部分，但本申请不局限于该设置。

内中空管体的底端内径和上端内径不相同，上端内径大于底端内径，方便注入细胞液。

本实施例中中空管体的横界面为圆形，但本发明不限于圆形，界面也可以是方形、棱形或其他不规则形状。

图6是3d打印装置的纵截面示意图，标明了关键位置的尺寸。

其中，a为内圈细胞所占初始圆形区域的直径；b为内外两圈细胞间空白圆环区域的环宽，表现为内中空管状体的管壁厚度；c为外圈细胞所占初始圆环区域的环宽；d表现为外中空管状体的管壁厚度；e表现为内中空管状体连接的凹槽内宽，其影响内圈细胞悬液的体积；h1表现为内中空管状体的外高度，影响内外两圈细胞悬液的体积；h2表现为外中空管状体的高度，影响外圈细胞悬液的体积。具体尺寸如下：a为800μm，b为1000μm，c为3600μm，d为1000μm，e为4000μm，h1为2000μm，h2为1000μm。

细胞培养皿或培养板的基底为玻璃、硅片、金属或高分子材料例如聚苯乙烯，易于获取，造价低廉。

3d打印装置形状大小灵活可变，尺寸从微米级到厘米级均能实现。

3d打印装置通过将上下两支撑部拼插组合，能实现可逆转的封接。

3d打印的原材料为可降解的聚乳酸，abs工程塑料或其他可用于3d打印的高分子材料等具有良好的细胞相容性和环境友好性。

为实现上述目的，本发明还提供了一种多细胞共培养的方法，采用上述装置，具体包括以下步骤：

步骤一、准备所述细胞培养皿或培养板基底，制备所述3d打印装置，其主要由两部分构成，底部是九个相连的直径为1cm，高为1mm的管状体，如图1中结构a所示；与其同中心的是直径为800µm的管状体，如图1中结构b所示，具体尺寸参照图6；

步骤二、在水和冰醋酸溶剂中配成浓度为300µg/ml的鼠尾胶原，在4℃低温条件下操作，滴加所述鼠尾胶原于所述培养皿或者培养板基底中，将其放于培养箱中12h后用pbs（1x）溶液缓慢清洗3次，置于室温下自然晾干，将所述3d打印装置放置在已经孵育一层鼠尾胶原的所述细胞培养皿或培养板基底中，目的是使细胞在更接近生物体内真实情况下贴壁生长，通过将上下两支撑部拼插组合，可以形成可逆转的密封；

步骤三、如图2所示，制备细胞的悬浮溶液并注入孵育一层鼠尾胶原的所述细胞培养皿或培养板基底的装置中，将其放入细胞培养箱中培养细胞4-6小时。图2是在3d打印结构中不同位置灌入不同的细胞，底部暗色部分为成纤维细胞悬液，上部凹槽里浅色部分为人成纤维肉瘤细胞悬液，两者之间不会发生交叉污染。

步骤四、细胞贴壁后，垂直移除内中空管体，并换上新鲜的培养基继续培养。其打破了对传统光刻技术的限制，建立了一种以3d打印技术为基础的多细胞共培养的方法。图3是移除上层结构后形成的细胞图案示意图，正中间浅色部分为人成纤维肉瘤细胞，外面深色部分为成纤维细胞，两者之间空白区域即为细胞共同迁移的部分。

可根据实际研究需要向内中空管及外中空管间注入不同的细胞溶液，本实施例注入的是人成纤维肉瘤细胞及成纤维细胞，但不限于此。

其还可用于研究不同药物在细胞相互作用下的作用和功能，如图5所示，得到了不同条件下的共培养图，为后续生物学分析提供了基础。图5是不同药物对细胞迁移影响的延时图。中间浅色部分为人成纤维肉瘤细胞，外侧深色部分为成纤维细胞。第一行是对照组未加药物，第二行是含有cytochalsind的实验组，第三行是含有gm6001的实验组。从图中可以看出药物抑制细胞的迁移。

步骤三中的细胞的悬浮溶液为成纤维细胞的悬浮液和人成纤维肉瘤细胞的悬浮液，细胞浓度均10⁵个/ml，所述细胞培养箱的温度为37℃、二氧化碳体积浓度为5%，培养时间为4-6小时。

步骤三中分别用1ml注射器吸取细胞的悬液，如图2所示，成纤维细胞的细胞悬液注入到两种管状体之间空白位置，人成纤维肉瘤细胞的悬液注入到连接内中空管状体的凹槽中。

步骤四，如图4所示，即细胞贴壁后，移除内中空管状体，可观察到人成纤维肉瘤细胞仅长在图案中心直径为800µm左右的范围内，其外圈为1mm左右的空白圆环区域，最外层为成纤维细胞，用pbs清洗3次洗掉未贴壁细胞，换成新鲜培养基，再放入所述细胞培养箱中，观察两种细胞的迁移及相互作用，这样我们通过计算人成纤维肉瘤细胞所占面积变化可以得到癌细胞在成纤维细胞的作用下的迁移变化。

因使用3d打印技术，中空管体的内径大到厘米级小到微米级均可实现，不限于本实施例数字。

实施例2

本实施例与实施例1基本相同，区别在于，3d打印技术制备的装置包括2个内中空管。