选育五指山小型猪近交系无PERV传染性新品系的方法与流程

本发明属于动物育种领域，涉及一种选育五指山小型猪近交系无PERV传染性新品系的方法。

背景技术：

五指山小型猪近交系是中国拥有完全自主的知识产权的新型实验动物。“近交系(Inbred Strain Animals)”是指经连续20代(或以上)的全同胞兄妹交配(或者亲代与子代交配)培育、近交系数大于99％的品系，所有个体都可追溯到起源于第20代或以后代数的一对共同祖先动物。五指山小型猪近交系体型小、性成熟早、产仔率较高、遗传稳定、无PERV-C型拷贝、PERV-A型及PERV-B型拷贝少、无应激反应基因、免疫代谢等基因与人类有较高同源性，异体皮肤移植鉴定试验未发生免疫排斥反应，全基因组序列测定60％基因纯合，证明该近交系猪培育成功，为研究医用疾病模型、新药鉴定、医用生物敷料产品研发与生产、以及异体器官移植等医用产业链发展及应用，创建、提供全新的科研平台与产业平台。

猪内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus，PERV)是一种以前病毒DNA形式整合入猪基因组中的逆转录病毒，是由PERV-gag、pol、env三基因组成，它可随细胞基因组的复制而复制。部分猪源细胞可释放PERV病毒颗粒，并能感染多种体外培养的人源细胞。由于猪器官大小和解剖生理与人体器官相似，被认为是异种器官移植的最佳供体。但猪基因组内的PERV存在跨物种间感染风险，以猪源器官作为器官供体移植人体后可能导致PERV感染人体。PERV感染是异种器官移植的一大障碍，从生物安全性考虑，需要去除或抑制猪基因组内PERV，以降低其物种间传播风险。根据PERV env基因编码的不同，可以将PERV分为三个亚型：PERV-A、PERV-B、PERV-C，其差异主要在于SU表面糖基化的VRA、VRB和PRO区，这种差异可能导致不同类型的PERV有着不同的宿主感染范围。PERV-A和PERV-B可感染多种人源细胞以及非人灵长类细胞，PERV-C仅感染特定猪来源的细胞。

因此，选育无PERV传染性的五指山小型猪近交系具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种选育无PERV传染性的五指山小型猪近交系的方法。

本发明首先提供了一种应用，具体为：HEK293细胞和记载有“鉴定待测猪是否为无PERV传染性的五指山小型猪近交系的方法”的可读性载体在制备用于选育无PERV传染性的五指山小型猪近交系的试剂盒中的应用。所述待测猪为五指山小型猪近交系。

本发明还提供了一种试剂盒，具体为：用于选育无PERV传染性的五指山小型猪近交系的试剂盒。所述试剂盒中含有HEK293细胞和记载有“鉴定待测猪是否为无PERV传染性的五指山小型猪近交系的方法”的可读性载体。

以上所述“鉴定待测猪是否为无PERV传染性的五指山小型猪近交系的方法”，具体可包括如下步骤：(A)将来源于待测猪的PBMC与HEK293细胞共培养4-7天(如4天)，去除所述PBMC，鉴定所述HEK293细胞中是否携带或表达PERV的结构基因，根据鉴定结果确定所述待测猪是否为无PERV传染性的五指山小型猪近交系：若所述HEK293细胞中不携带且不表达PERV的结构基因，则所述待测猪为候选无PERV传染性的五指山小型猪近交系；若所述HEK293细胞中携带或表达PERV的结构基因，则所述待测猪不为无PERV传染性的五指山小型猪近交系；所述待测猪为五指山小型猪近交系。

在步骤(A)之后，还可包括步骤(B)：

(B)将来源于经过所述步骤(A)获得的候选无PERV传染性的五指山小型猪近交系的PBMC与HEK293细胞共培养4-7天(如4天)，去除所述PBMC，继续培养所述HEK293细胞30-60天，期间在细胞汇合时即行传代，每次传代时一方面收集所述HEK293细胞鉴定是否携带或表达PERV的结构基因，另一方面收集细胞培养上清鉴定反转录酶活性，根据鉴定结果确定所述“经过所述步骤(A)获得的候选无PERV传染性的五指山小型猪近交系”是否确实为无PERV传染性的五指山小型猪近交系：若每次的鉴定结果均显示所述HEK293细胞中不携带且不表达PERV的结构基因，并且所述细胞培养上清无反转录酶活性，则所述“经过所述步骤(A)获得的候选无PERV传染性的五指山小型猪近交系”确实为无PERV传染性的五指山小型猪近交系；反之则所述“经过所述步骤(A)获得的候选无PERV传染性的五指山小型猪近交系”不为无PERV传染性的五指山小型猪近交系。

本发明所提供的筛选无PERV传染性的五指山小型猪近交系的方法，具体可包括如上所述步骤(A)。根据需要，在所述步骤(A)之后，还可包括如上所述步骤(B)。

所述方法中，采用PCR和/或RT-PCR的方法鉴定所述HEK293细胞中是否携带有PERV的结构基因。

所述PERV的结构基因为gag基因、pol基因和env基因。只要这三个基因的检测结果有阳性的就说明所述HEK293细胞携带或表达PERV的结构基因。

用于扩增所述gag基因的引物对由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成，用于扩增所述pol基因的引物对由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成，用于扩增所述env基因的引物对由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA分子组成。

所述方法中，使用细胞培养液对PBMC与HEK293细胞的共培养体系冲洗至少4遍以去除所述PBMC。

所述方法中，可以运用PCR扩增猪种属特异性基因验证所述PBMC的去除情况。其中，PCR扩增时采用的引物对为特异于猪源细胞α-1,3-半乳糖转移酶基因中种属特异性内含子序列的引物对，由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA分子组成。

所述方法中，PBMC与HEK293细胞共培养初始时，所述PBMC的量可为所述HEK293细胞的两倍。

所述方法中，PBMC与HEK293细胞共培养初始时，需向培养体系中加入工作浓度为2.5μg/ml的PHA，两天后以相同量补充一次PHA。

所述方法中，所述PBMC为离体PBMC，可分离自所述待测猪(或所述“经过所述步骤(A)获得的候选无PERV传染性的五指山小型猪近交系”)的股动脉血。

所述方法中，应用Cavidi公司的HS-Mn RT活性检测试剂盒检测所述细胞培养上清的反转录酶活性。

本发明还提供了一种选育五指山小型猪近交系无PERV传染性新品系的方法。

本发明所提供的选育五指山小型猪近交系无PERV传染性新品系的方法，具体可溶包括如下步骤：将经权利要求5或6所述方法筛选获得的无PERV传染性的五指山小型猪近交系个体记为F0代，F0代公、母猪交配，妊娠、繁育生产得到仔猪后代，再经权利要求5或6所述方法进行筛选，获得的无PERV传染性的五指山小型猪近交系个体记为F1代，以后依此类推，获得的无PERV传染性的五指山小型猪近交系分别记为F2、F3、F4、F5、……，采用这样的繁育方式所获得的近交系猪群体即为五指山小型猪近交系无PERV传染性新品系。

本发明中的所述方法为非疾病诊断治疗的方法。

实验证明，采用本发明方法能够准确鉴定待测猪是否为无PERV传染性的五指山小型猪近交系，可用于选育五指山小型猪近交系无PERV传染性新品系。

附图说明

图1为HEK293细胞和PBMC细胞共培养。

图2为PCR扩增猪种属特异性基因。M：DL1000DNA Marker；a～l：某次检测1～12号样品E3/4基因PCR产物；m：阴性对照PCR产物。

图3为某次检测样品的PERV-gag、pol、env基因RT-PCR检测结果。M：DL1000DNA Marker；a～l：1～12号样品RT-PCR产物；m：阴性对照RT-PCR产物。

图4为PCR扩增猪种属特异性基因。M：DL1000DNA Marker；a～l：某次检测1～12号样品E3/4基因PCR产物；m：阴性对照PCR产物。

图5为样品的PERV-gag、pol、env基因PCR检测结果。M：DL1000DNA Marker；a～l：1～12号样品PCR产物，其中10号为阳性对照；m：阴性对照PCR产物。

图6为样品的PERV-gag、pol、env基因RT-PCR检测结果。M：DL1000DNA Marker；a～l：1～12号样品RT-PCR产物，其中10号为阳性对照；m：阴性对照RT-PCR产物。

图7为绘制RT活性检测试验标准曲线。其中，x轴为反转录酶活性，单位μU/ml，y轴为OD405值。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

五指山小型猪近交系：北京盖兰德生物科技有限公司。

HEK293细胞：ATCC，CRL-1573^TM。

实施例1、无PERV传染性的五指山小型猪近交系的筛选及选育五指山小型猪近交系无PERV传染性新品系

一、无PERV传染性的五指山小型猪近交系的初步筛选

从新鲜无菌采集的五指山小型猪近交系的股动脉血中分离外周血单个核细胞(PBMC)与HEK293细胞共培养。共培养4天后，从共培养细胞中去除PBMC并使用PCR鉴定PBMC已完全去除，之后采用PCR、RT-PCR对共培养后的HEK293细胞进行PERV-gag、pol、env基因检测，结果均为阴性者为初筛获得的无PERV传染性的五指山小型猪近交系。

1、细胞共培养及PCR验证猪PBMC的去除情况

在细胞共培养前一天，用6孔板进行HEK293细胞铺板，每孔细胞量为3×10⁵个，37℃、5％CO₂、饱和湿度中培养24h，待细胞长成50％单层时即可用于共培养。从新鲜无菌采集的五指山小型猪近交系的股动脉血中分离外周血单个核细胞(PBMC)与HEK293细胞共培养(图1)，每孔加入的PBMC细胞量约为HEK293细胞量的2倍，同时加入PHA(工作浓度为2.5μg/ml)，两天后以相同量补充一次PHA。

共培养4天后，使用细胞培养液冲洗至少4遍以去除PBMC，并运用PCR方法扩增猪种属特异性基因验证猪PBMC的去除情况。根据猪源细胞的α-1,3-半乳糖转移酶基因中种属特异性内含子序列合成一对引物(表1)。

表1检测猪种属特异性基因的引物序列

使用Promega公司的基因组DNA纯化试剂盒提取细胞基因组DNA，以共培养后的HEK293细胞基因组为模板，用E3、E4引物进行PCR扩增，并以未经共培养的HEK293细胞基因组DNA为阴性对照。PCR反应在50μL体系中进行，取1μL细胞基因组DNA作模板，依次加入10×PCR buffer 5μL，10mmol/L dNTP混合物4μL，上、下游引物各50pmol，Taq DNA聚合酶3U，加无菌去离子水至50μL，于PCR仪上进行反应。检测猪α-1,3-半乳糖转移酶基因的扩增程序为：94℃预变性4min；94℃、30s，56℃、30s，72℃、45s，35个循环；72℃延伸5min。反应结束后，PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析。

预期片段位于500bp～750bp之间，结果表明共培养后细胞基因组DNA和阴性对照均没有扩增出预期大小片段(图2)。因此基本上可确认猪PBMC已被完全去除。

2、PCR及RT-PCR检测PERV结构基因

共培养后的HEK293细胞经PCR鉴定确认无猪PBMC存在后，取上述制备的细胞基因组DNA和同期使用Trizol制备的细胞总RNA，分别通过PCR和RT-PCR检测PERV结构基因gag、pol、env的存在和表达情况。

反转录反应在20μL体系中进行，以9μL细胞总RNA为模板，1μL Oligo(dt)₁₅为引物，70℃水浴5min后迅速转移到冰上，加入AMV 5×buffer 4μL，10mmol/L dNTP混合物4μL，Rnasin 20U，AMV反转录酶12U，室温放置10min后，于42℃水浴1h，在AMV反转录酶的作用下反转录合成cDNA第一链。

分别以细胞基因组DNA和反转录产物cDNA为模板进行PCR反应，检测gag、pol、env基因保守区(表2)。

表2检测PREV的引物序列

PCR反应在25μL体系中进行，取1μL细胞基因组DNA或2μL反转录产物作模板，依次加入Premix Ex Taq 12.5μL，上、下游引物各50pmol，加无菌去离子水至25μL，于PCR仪上进行反应。

检测gag基因保守区的扩增程序为：94℃预变性5min；94℃，30s，55℃，50s，72℃，45s，35个循环；72℃延伸5min。检测pol基因保守区的扩增程序为：94℃预变性5min；94℃，30s，57℃，50s，72℃，45s，35个循环；72℃延伸5min。检测env基因保守区的扩增程序为：94℃预变性5min；94℃，30s，58℃，50s，72℃，45s，35个循环；72℃延伸5min。反应结束后，PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分析。

PCR、RT-PCR检测PERV-gag、pol、env基因的结果均为阴性者为初筛获得的无PERV传染性的五指山小型猪近交系。图3为某次RT-PCR检测结果，结果显示4号为初筛无PERV传染性的五指山小型猪。

二、确证实验

初筛共获得11头候选的无PERV传染性的五指山小型猪近交系以及1头有PERV传染性的五指山小型猪近交系，将这12头猪进行编号，之后通过确证实验来最终确定初筛所得的候选无PERV传染性的五指山小型猪近交系是否确实为无PERV传染性的五指山小型猪近交系。

确证实验时，重新采血并分离PBMC，将PBMC与HEK293细胞共培养。共培养4天后，完全从共培养细胞中去除PBMC并使用PCR鉴定PBMC已完全去除。继续培养HEK293细胞30～60天，期间在细胞汇合时即行传代，每次传代时收集细胞进行PCR、RT-PCR检测PERV-gag、pol、env基因，并收集细胞培养上清用于反转录酶活性检测。若PCR、RT-PCR检测均为阴性结果，再通过反转录酶活性检测对其进行进一步确证，检测结果均为阴性时，可判定该样品确实为无PERV传染性的五指山小型猪近交系。

1、细胞共培养及PCR验证猪PBMC的去除情况

对初筛获得的11头无PERV传染性的五指山小型猪近交系和1头有PERV传染性的五指山小型猪近交系(阳性对照)重新采血并分离PBMC，将PBMC与HEK293细胞共培养。共培养4天后，使用细胞培养液冲洗4遍以除尽PBMC，如上所述，运用PCR方法扩增猪种属特异性基因以验证猪PBMC的去除情况。结果表明共培养后细胞基因组DNA和阴性对照均没有扩增出预期大小片段(图4)。因此基本上可确认猪PBMC已被完全去除。

2、PCR及RT-PCR检测PERV结构基因

继续培养HEK293细胞30～60天，期间在细胞汇合时即行传代，每次传代时收集细胞基因组DNA和总RNA，如上所述，分别进行PCR、RT-PCR检测PERV-gag、pol、env基因。结果显示，在确证实验中除8号样品在PCR、RT-PCR检测中出现了pol阳性结果外，其余待确证样品均为阴性结果。图5、图6分别显示第一次细胞传代后的PCR及RT-PCR检测结果。

3、反转录酶活性检测

每次细胞传代前收集细胞上清，将上清离心、过滤后除去细胞碎片等，然后应用Cavidi公司的HS-Mn RT活性检测试剂盒(产品目录号为#52030)进行反转录酶活性检测。参照试剂盒说明书步骤，首先绘制标准曲线，获得直线回归方程y＝(2E-3)x+0.204，R²＝0.996(图7)，其中x为反转录酶活性，单位μU/ml，y为OD405值。然后进行样品检测，结果显示，阳性对照样品自共培养后21天开始出现阳性结果，待测样品中有5个样品在各时间点的OD值均未超过空白对照孔平均值的2倍，为无效值，说明这5个样品无反转录酶活性，即无PERV感染性。

根据以上确证实验的检测结果，可知：初筛获得的11头候选五指山小型猪中有5头经确证为无PERV传染性的五指山小型猪近交系。

三、选育五指山小型猪近交系无PERV传染性新品系

利用步骤二获得的5头经确证为无PERV传染性的五指山小型猪近交系的3头母猪(体号为351、457、505)和2头公猪(体号为452、1)为系祖、记为F0。采用获得《一种获得近交系小型猪的方法》发明专利(ZL.02149030.9)方法，F0公、母猪交配，妊娠、繁育生产的仔猪后代，经以上步骤一和二的方法筛选的无PERV传染性的五指山小型猪近交系个体记为F1，以后依此类推获得的无PERV传染性的五指山小型猪近交系分别记为F2、F3、F4、F5、……。这样繁育方式获得的近交系猪群体为“五指山小型猪近交系无PERV传染性新品系”。

<110> 北京盖兰德生物科技有限公司

<120> 选育五指山小型猪近交系无PERV传染性新品系的方法

<130> GNCLN170447

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<170> PatentIn version 3.5

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