大豆突触结合蛋白基因Gmsyt4‑X16及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，具体大豆突触结合蛋白基因Gmsyt4-X16及其在培育抗寒植物品种方面的应用。

背景技术：

突触结合蛋白Synaptotagmin是一个广泛存在于神经和内分泌细胞内的分泌囊泡上的蛋白质家族，它不仅可以触发和调节靶膜跟囊泡的融合，同时参与调控激素和神经递质的释放，还能够调节细胞的蛋白质和膜的转运。目前在哺乳动物中己经发现了该家族16种以上的亚型，它们在细胞内的定位各有不同，并且所发挥的调节功能也有所不同。

植物细胞的Synaptotagmin结构与动物的类似，但功能研究尚不清楚。在2004年，Molly Craxton通过对基因组、公共序列数据库中的转录序列以及在cDNA文库中筛选和RT-PCR中获得的转录序列的比对分析，在拟南芥中发现了6种Syt基因，命名为SytA-SytF。2008年，Tomokazu Yamazaki等发现，sytl参与了拟南芥低温胁迫下的钙依赖的质膜修复。在冻融循环中，植物细胞受到了来自结冰诱发的脱水，融解诱发的水合以及冰晶的生长导致的机械应力(Levitt,1980)，但质膜是否在冻融中机械性的被刺破还不清楚。有趣的是，在质膜附近发现了大量的在冰冻环境下能能够参与囊泡融合的超微小泡。Kawamura等研究发现，在植物冷驯化获得抗冻性的同时，sytl作为一种质膜蛋白而快速增加。在悬浮液中加入Sytl的C2A结构域的特异抗体后，生理及免疫组织化学的结果显示，与冰晶生长产生的机械应力相关的抗性依赖外援的钙离子与膜修复有关。细胞水平上的Sytl相关的膜修复影响整个植株的抗冻性。Syt参与质膜的融合过程并且对质膜修复起到作用，因此其家族中其它成员可能也会对抵抗各种非生物肋迫产生作用。

技术实现要素：

本发明的目的是为提高植物的抗冻性，而提供一种大豆突触结合蛋白基因Gmsyt4-X16。

大豆突触结合蛋白基因Gmsyt4-X16，它的碱基序列如序列SEQ ID NO.1所示。

一种植物载体pCAMBIA3301- Gmsyt4-X16，它是在pCAMBIA3301中插入了碱基序列如序列SEQ ID NO.1所示的基因，并以Bar为筛选标记，启动子为CaMV35S。

大豆突触结合蛋白基因Gmsyt4-X16在培育抗寒植物品种方面的应用。

本发明提供了大豆突触结合蛋白基因Gmsyt4-X16，在大豆中分离克隆了突触结合蛋白基因Gmsyt4-X16，并构建了植物载体pCAMBIA3301- Gmsyt4-X16和转植物干扰表达Gmsyt4-X16载体，转化烟草植株，与对照植株NC89一起培养至幼苗期，在6℃条件下低温处理24小时，荧光定量PCR发现，Gmsyt4-X16基因在低温胁迫处理下相对表达量显著升高，说明该基因受冷胁迫诱导表达，观察发现与对照植株NC89相比，转植物过量表达Gmsyt4-X16载体的烟草植株叶片未明显受到低温的影响，茎部和叶片略有倾斜，经过12小时的适宜条件恢复培养，植株恢复健康状态，长势良好。相反的，转植物干扰表达Gmsyt4-X16载体的烟草植株在低温处理24h后叶片出现了明显的萎缩、萎蔫、打卷现象，经过12小时的适宜温度恢复，萎蔫现象改善不明显，植株受冷胁迫影响严重。

附图说明

图1 Gmsyt4-X16基因的 PCR 扩增电泳图；其中M: DNA 标准分子量； 1-2：PCR 产物；

图2 Gmsyt4-X16蛋白三维结构模拟；

图3 Gmsyt4-X16 蛋白系统进化树；

图4 植物过表达载体的构建；A.植物表达载体pCAMBIA3301的双酶切；B. 目标片段的PCR扩增；

图5 植物过表达载体的构建及验证；A.双酶切验证；B. PCR验证；

图6植物过表达载体pCAMBIA3301-Gmsyt4-X16的T-DNA区结构；

图7 植物干扰表达载体的构建A. 植物表达载体pCAMBIA3301的双酶切；B. 目标片段的PCR扩增；

图8 植物干扰表达载体的构建及验证；A. 双酶切验证；B. PCR验证；

图9 植物干扰表达载体pCAMBIA3301- Gmsyt4-X16 -RNAi的T-DNA区结构；

图 10 根癌农杆菌介导的烟草遗传转化；A：萌发阶段；B：浸染后共培养阶段；C：浸染后筛选培养阶段；D：分化筛选培养阶段；E：生根培养阶段；F：移栽培养阶段；

图11 转植物过量表达Gmsyt4-X16载体转化植株的PCR检测；A：目的基因Gmsyt4-X16； B：筛选标记基因Bar、M：DNA分子量标准；P:阳性对照;C:阴性对照(未经转化的大豆植株); 1-10：转基因阳性植株；

图12 转植物干扰表达Gmsyt4-X16载体转化植株的PCR检测；A：35S启动子； B：nos终止子M：DNA分子量标准；P:阳性对照;C:阴性对照(未经转化的大豆植株); 1-10：转基因阳性植株；

图13 不同转化植株在6℃冷处理下的表现；A：适宜条件；B：6℃处理24小时；C：适宜条件恢复12小时；

图14 Gmsyt4-X16基因在转植物过表达载体pCAMBIA3301-Gmsyt4-X16的植株中的相对表达量；

图15 Gmsyt4-X16基因在转植物干扰表达载体pCAMBIA3301-Gmsyt4-X16-RNAi的植株中的相对表达量；

图16 T2代Southern blot检测；M：DNA分子量标准；P:阳性对照;C:阴性对照(未经转化的大豆植株); 1：基因阳性植株OEA1；2：基因阳性植株OEA2；3：基因阳性植株OEA10；4：基因阳性植株IEA3；5：基因阳性植株IEA4；6：基因阳性植株IEA9。

具体实施方式

实施例1 Gmsyt4-X16基因的克隆

大豆（Glycine max）突变体材料M18，烟草（Nicotianatabacum L.）品种NC89，以上材料均由吉林农业大学植物生物技术中心提供。

基因Gmsyt4-X16的 cDNA 序列的克隆

使用TAKARA公司生产的RNAiso试剂盒从大豆M18苗期根系组织提取总RNA，以反转录的cDNA为模板，根据RNA-seq测序结果序列，设计特异引物syt，采用RT-PCR方法扩增目的片段并测序。

根据前期筛选得到的Gmsyt4-X16序列片段设计扩增长度为1062bp 的特异引物syt-s 和syt-as。经PCR 扩增后，得到一条约 1062bp的核酸条带（图1），将 PCR 产物克隆至 PMD18-T 载体后进行测序。测序结果与 NCBI中数据进行比对，未找到与目的基因相一致的已知序列，初步判断克隆得到的基因为未知的新基因。通过比对发现，目标基因与序列号为XR_001387984.1的序列相比同源性最高，在87%覆盖度水平上的一致性达到 98%，且与其他的Glycine max synaptotagmin-4-like基因序列比对相似性较高，说明目标基因与Glycine max synaptotagmin-4-like家族成员的同源性较高，因此为该目标基因命名为Gmsyt4-X16。

实施例2 Gmsyt4-X16基因的生物信息学分析及系统进化树的构建

将Gmsyt4-X16基因全序列连入克隆载体pMD18-T Vector，对重组载体进行测序后进行生物信息学分析，测序由北京三博远志生物技术有限公司完成。

利用在线分析程序ORF finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)对新基因序列进行可能的开放阅读框分析，通过 DNAMAN 软件将新基因ORF翻译成氨基酸序列；利用ProtParam软件(http//www. web. expasy. org / protparam/ ) 预测蛋白质序列理论参数；利用SWISS-MODEL在线软件构建Gmsyt4-X16基因的蛋白质立体结构；利用Protscale软件( http: / /web. expasy. org / /protscale /预测蛋白的亲疏水性。

在 NCBI 网站中下载所有已知syt基因序列，通过 DNAMAN 软件对蛋白质进行多重比对，分析同源性，构建系统进化树。

通过在线分析程序 ORF FINDER对新基因Gmsyt4-X16的核酸序列进行分析，并预测理论上的编码区的位置。分析结果表明，Gmsyt4-X16基因理论上的开放阅读框为687bp，可编码 228个氨基酸残基。

ProtParam软件分析其相对分子量为26075.68，理论等电点(PI) 为9.01，正电荷氨基酸残基总数(Arg+Lys) 为30，负电荷氨基酸残基总数(Asp+Glu)为25，分子式为C₁₁₈₃H₁₉₁₁N₃₀₃O₃₃₄S_11.。氨基酸组分析表明:亮氨酸、赖氨酸、异亮氨酸含量较高分别占12.3%、10.1%、9.6%。总平均疏水指数Grand average of hydropathicity (GRAVY)为-0.153。利用ProMod version 3.70 软件构建Gmsyt4-X16的 3D 立体结构图（图2），描述为Extended synaptotagmin-2，理论上说明了 Gmsyt4-X16 的立体结构功能与特征。

搜索NCBI网站上植物已知的全部豆科类syt基因的氨基酸序列，利用DNAMAN软件建立Gmsyt4-X16蛋白系统进化树。使用 Neighbor-Joining 统计法，根据各Gmsyt4-X16蛋白的序列同源性将进化分析结果分为三组，蛋白Gmsyt4-X16与大豆Gmsyt4-X8的同源性最高，与红豆、绿豆相比，大豆中Gmsyt4-X16蛋白的进化趋势与大豆Gmsyt4家族（Glycine max synaptotagmin-4-like）遗传距离最近。

实施例3植物表达载体的构建及遗传转化

利用限制性内切酶BglII和BstEII对植物表达载体pCAMBIA3301进行双酶切，利用Seamless Assembly Clonng Kit试剂盒，将克隆得到的Gmsyt4-X16全长基因替换3301上原有的GUS基因。构建以Bar为筛选标记，CaMV35S启动子启动目标基因Gmsyt4-X16的pCAMBIA3301- Gmsyt4-X16植物过表达载体。

利用BglII和BstEII限制性内切酶对植物表达载体pCAMBIA3301进行双酶切，得到大小为10kb的3301载体大片段和1841bp的GUS基因片段；利用引物Sytover对克隆载体Pmd18-T-Gmsyt4-X16进行PCR扩增，得到大小687bp的Gmsyt4-X16基因ORF全长片段（图4），利用T4连接酶将Gmsyt4-X16基因ORF全长片段连入植物表达载体pCAMBIA3301。

对构建成功的植物过表达载体pCAMBIA3301-Gmsyt4-X16进行PCR和双酶切鉴定，均得到与预期大小相符的Gmsyt4-X16基因ORF全长片段687bp（图5），对其进行测序，测序结果正确，说明植物过表达载体pCAMBIA3301- Gmsyt4-X16构建成功（图6）。

实施例4植物干扰表达载体pCAMBIA3301-Gmsyt4-X16-RNAi的构建

利用BglII和BstEII限制性内切酶对植物表达载体pCAMBIA3301进行双酶切，得到大小为10kb的3301载体大片段和1841bp的GUS基因片段；利用引物sytZ、SSR、sytF分别对克隆载体Pmd18-T-Gmsyt4-X16和Pmd18-T-SSR进行PCR扩增，得到大小为239bp的目的基因Gmsyt4-X16核心片段的正义片段、反义片段、和大小为205bp的SSR内含子片段（图7），利用无缝克隆连接酶将Gmsyt4-X16正义片段、内含子SSR和Gmsyt4-X16反义片段同时连入植物表达载体pCAMBIA3301，得到植物干扰表达载体pCAMBIA3301-Gmsyt4-X16-RNAi。

对构建成功的植物干扰表达载体pCAMBIA3301-Gmsyt4-X16-RNAi进行双酶切和PCR鉴定。用BglII和BstEII双酶切该质粒，得到一条大小约为683bp的sytZ-SSR-sytF干扰片段；分别对Gmsyt4-X16核心片段的正义片段、反义片段、SSR内含子、进行特异性扩增，得到的扩增条带都与预期大小相符，得到大小为239bp的Gmsyt4-X16核心片段的正义片段、205bp的SSR内含子片段、239bp的Gmsyt4-X16核心片段的反义片段（图8）。对其进行测序，测序结果正确，说明植物干扰表达载体pCAMBIA3301-Gmsyt4-X16-RNAi构建成功（图9）。

实施例5转化植株的PCR检测

烟草的遗传转化

采用改良的CTAB法，从烟草叶片中提取基因组DNA，将其作为模板，以载体质粒为阳性对照，以未转化植株为阴性对照，分别以Gmsyt4-X16基因、筛选标记基因bar和35S启动子的特异性引物（表1）进行PCR扩增。

采用农杆菌介导法对烟草NC89进行遗传转化研究，获得了具有卡那霉素抗性的转化植株53株，其中转植物过表达载体pCAMBIA3301-Gmsyt4-X16-over的转化植株24株，转植物干扰表达载体pCAMBIA3301-Gmsyt4-X16-RNAi的转化植株29株（见图10）。

从再生抗性植株中随机选取长势较好的过量表达Gmsyt4-X16基因和干扰表达Gmsyt4-X16基因的转化植株各10株，提取叶片基因组DNA，分别用目的基因Gmsyt4-X16和筛选标记基因bar的特异性引物对转植物过量表达Gmsyt4-X16载体的转化植株进行PCR检测（图11），结果得到过量表达Gmsyt4-X16基因的PCR阳性株7株。

以35s启动子和nos终止子为特异引物，对转干扰表达Gmsyt4-X16载体的转化植株进行PCR检测，结果得到干扰表达Gmsyt4-X16基因的PCR阳性株8株（图12）。

低温处理对不同转化植株Gmsyt4-X16基因相对表达量的影响

将转植物过量表达Gmsyt4-X16载体的烟草植株、转植物干扰表达Gmsyt4-X16载体的烟草植株，以及对照植株NC89在适宜条件下培养至幼苗期，待长出第5叶心叶时，移至6℃低温培养箱中进行冷胁迫处理，低温处理24小时后，移至25℃适宜条件下进行恢复培养。观察不同转化植株叶片的萎蔫程度，并测定目的基因Gmsyt4-X16在幼苗根系中的相对表达量。

将转植物过量表达Gmsyt4-X16载体的烟草植株、转植物干扰表达Gmsyt4-X16载体的烟草植株，以及对照植株NC89培养至幼苗期，在6℃条件下低温处理24小时，观察发现与对照植株NC89相比，转植物过量表达Gmsyt4-X16载体的烟草植株叶片未明显受到低温的影响，茎部和叶片略有倾斜，经过12小时的适宜条件恢复培养，植株恢复健康状态，长势良好。相反的，转植物干扰表达Gmsyt4-X16载体的烟草植株在低温处理24h后叶片出现了明显的萎缩、萎蔫、打卷现象，经过12小时的适宜温度恢复，萎蔫现象改善不明显，植株受冷胁迫影响严重（图13）。

提取PCR阳性植株的根系总RNA，以SYBR Green Ⅰ为染料，进行qRT-PCR检测。采用相对定量法，校正标准选取内参基因肌动蛋白，测定内参基因和目的基因Gmsyt4-X16的表达量，根据公式2-△△CT对各个植株间的相对表达量进行分析。

在烟草根部中，设定适宜条件下受体植株NC89的Gmsyt4-X16基因表达量为1，其他转基因阳性植株、其他处理条件下的表达水平都对比于这个设定值，如图14所示，适宜温度条件下，7株转植物过表达载体pCAMBIA3301-Gmsyt4-X16的植株Gmsyt4-X16基因的相对表达量都高于对照NC89，其中OEA10的相对表达量最高，为2.863，其次为OEA2（2.35）和OEA1（2.543）。低温处理24小时后，各植株的Gmsyt4-X16基因相对表达量有显著增加，说明Gmsyt4-X16基因受冷胁迫诱导表达。与受体NC89相比，转植物过表达载体pCAMBIA3301-Gmsyt4-X16的植株Gmsyt4-X16基因的相对表达量较高，OEA10的相对表达量最高，为4.67，其次为OEA1（4.013）和OEA2（3.81）。

在转植物干扰表达载体pCAMBIA3301-Gmsyt4-X16-RNAi的阳性植株中，Gmsyt4-X16基因的相对表达量都受到了明显的抑制，其中IEA9植株Gmsyt4-X16基因的抑制效果最明显，被干扰了58.6667%，其次是IEA4（58%）和IEA3（52.667%）。低温处理24小时后，各植株的Gmsyt4-X16基因相对表达量均有显著增加，进一步说明Gmsyt4-X16基因受冷胁迫诱导表达。

Gmsyt4-X16基因在烟草基因组的整合情况分析

对PCR检测为阳性的转基因植株，进行Southern杂交检测。以纯化的筛选标记基因bar为模板制备探针，采用随机引物标记法进行标记，杂交及检测的其他步骤均按照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitII试剂盒的说明书操作。

以未转化烟草植株NC89为对照，选取过表达、干扰表达效果明显的6株转基因阳性植株进行Southern杂交检测，结果表明，6株转基因阳性烟草均具有明显的杂交信号，而选取的未转基因对照植株无杂交信号产生(图16)，说明外源基因已经整合到烟草的基因组中，整合形式均为单拷贝形式，各杂交信号的位置互不相同，说明各转基因植株的整入位点均不相同。

<110> 吉林农业大学

<120> 大豆突触结合蛋白基因Gmsyt4-X16及其应用

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<212> DNA

<213> 人工

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ctaatgaagg gaattaactt atgccaatga tttctttaat tgccaattgt cataatgaca 60

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