本发明涉及微生物细菌培养基应用工艺，特别是兽医临床快速增菌与药敏试验培养基及其制备与应用方法。
背景技术：
：随着畜牧产业的不断发展，各种细菌性疾病给养殖业造成经济损失的问题日显突出，阻碍了养殖业的快速发展。使用抗生素防治细菌性疾病成为经常性工作，但由于养殖过程中不科学的、盲目的滥用抗生素，造成细菌产生耐药性问题正变得越来越突出，不少菌株可耐受多种抗生素。因此而造成的危害十分严重，它不仅使抗菌药的疗效降低，疗程延长，还使死亡率升高和治疗费用增加，给养殖业带来巨大经济损失。耐药菌株还可能将耐药性基因由动物转移给人类，对人类健康造成潜在威胁。因此，畜牧生产中应合理使用抗生素，来避免或减少耐药性的产生，而合理应用抗菌药控制畜禽疾病的一项重要内容就是通过药敏试验指导临床用药，以充分发挥抗菌药疗效，并尽可能减少其不良影响。抗菌药物敏感性试验，简称药敏试验，是指对敏感性不能预测的分离菌株进行试验，测试抗菌药在体外对病原微生物有无抑制作用，以指导选择治疗药物和了解区域内常见病原菌耐药性变迁，有助于经验性治疗选药。药敏试验是兽医临床工作中的一项基本技能，也是使用抗菌药物治疗前必不可少的一道环节。药敏试验具有重要的意义，一是可以相对快速有效地检测病原菌对各种抗菌药的敏感性，指导临床合理用药。因为实验是在体外对已经分离的细菌进行药敏，不需要生物载体，不需要实验动物，操作相对简单，成本相对降低。是一种既经济又有效的方法。二是可以对流行病学调查进行监控，控制和预防耐药菌株的流行。因为随着新型致病菌的不断出现，各种致病菌对不同的抗菌药的敏感性不同，同一细菌的不同菌株对不同抗菌药的敏感性也有差异。进行有效的药敏试验可以及时掌握各种新型菌种和菌株的耐药性，对流行病学调查建立监控，同时采取相应的措施也就可以控制和预防耐药菌株的流行。三是为临床用药提供参考依据。长期以来，由于各种致病菌耐药性的产生使各种常用抗菌药药效下降或消失。不能很好的掌握药物对细菌的敏感程度，不但造成药物浪费，而且还延误病情，给养殖户造成了很大的经济损失。所以在临床疾病防治工作中，要取得较好的治疗效果，应扩大常规抗菌药种类进行药敏试验，根据药敏试验结果，选择敏感药物，且应注意交替用药，按疗程投药，这样才能收到较好的治疗效果。传统的药敏试验一般需要3-7天才能报告药敏实验结果，所以无法及时为兽医临床用药提供指导，因此缩短药敏试验的时间成为一个迫切解决的问题。因此，在疫病的诊断和防治中，应在细菌分离鉴定的同时，优先进行药敏试验，及时指导养殖户进行有效防治。这种快速药敏试验方法能及早为防治提供依据，控制疫病，减少死亡，为控制疫病赢得时间。在生产中具有非常重要现实意义。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种兽医临床快速增菌与药敏试验培养基及其制备与应用方法，具有快速、准确、成本低的技术特点，在短时间内出具药敏试验结果，快速指导兽医临床合理用药。本发明的目的是这样实现的：一种兽医临床快速增菌与药敏试验培养基，增菌培养基的配方为：在每1l增菌培养基原料中含有5g蛋白胨、7-10g䏡胨、5g葡萄糖、5ml甘油、45g营养琼脂、250ml肝汤及wg去离子水，w=1l增菌培养基的总质量－[蛋白胨、䏡胨、葡萄糖、甘油、营养琼脂与肝汤加合起来的总质量]；药敏培养基的配方为：在每1l药敏培养基原料中含有16g琼脂、24gmh培养基、80ml肝汤。本发明的目的是这样实现的：一种制备增菌培养基的方法，①称取1k动物肝脏，去筋，绞碎，放入烧杯中，加入1l去离子水，边搅拌边加热，煮沸后冷却，依次经洁净纱布、滤纸过滤至洁净容器内，再加入去离子水定容至1l，形成肝汤，可直接使用，或分装在瓶内，在121℃密闭灭菌20min，将其放置在温度为4℃的环境中进行恒温保存备用；②称取蛋白胨、䏡胨、葡萄糖、甘油、营养琼脂及肝汤，加入去离子水直至去离子水使蛋白胨、䏡胨、葡萄糖、甘油、营养琼脂、肝汤与去离子水加合起来的总体定容至1l时形成生增菌培养基，混匀后依次煮沸、放凉后形成熟增菌培养基，调节熟增菌培养基ph值至7.2-7.4后对熟增菌培养基进行分装，在115℃密闭灭菌15min，接着将熟增菌培养基分装至无菌培养皿，待其完全凝固后将其放置在温度为4℃的环境中进行恒温保存。本发明的目的是这样实现的：一种制备药敏培养基的方法，①称取1k动物肝脏，去筋膜，绞碎，放入烧杯中，加入1l去离子水，边搅拌边加热，煮沸后冷却，依次经洁净纱布、滤纸过滤至洁净容器内，再加入去离子水定容至1l，形成肝汤，可直接使用，或分装在瓶内，在121℃密闭灭菌20min，将其放置在温度为4℃的环境中进行恒温保存备用；②称取琼脂、mh培养基及肝汤，加入去离子水直至去离子使琼脂、mh培养基、肝汤与去离子水加合起来的总体定容至1l时形成生药敏培养基，混匀后煮沸、放凉后形成熟药敏培养基，调节熟药敏培养基ph值至7.2-7.4后对熟药敏培养基进行分装，在115℃密闭灭菌15min，接着将熟药敏培养基分装至无菌培养皿，待其完全凝固后将其放置在温度为4℃的环境中进行恒温保存。本发明的目的是这样实现的：一种应用增菌与药敏培养基的方法，①无菌采集病死动物病料：对病死动物进行表面尸体消毒，用消毒过的手术剖解工具打开病死动物胸腔及腹腔，露出内脏器官，用点燃的酒精棉球在内脏器官上进行表面消毒，然后用无菌采样器具剪取小块内脏，重点采集内脏病变部位，快速放入无菌培养皿中；②在增菌培养基上增菌：在无菌超净工作台中，将病料组织断面均匀涂布在增菌培养基表面，翻过来放入37℃恒温培养箱培养15-18h；③在药敏培养基上药敏试验：在无菌超净工作台中，用接种环挑取增菌培养基上的菌落，均匀涂布在药敏培养基上，贴上成品药敏片或贴上用现有药物自做的药敏片，翻过来放入37℃恒温培养箱培养6-8h；④根据抑菌圈直径大小判断细菌对抗菌药物的敏感性，从中选出最佳药物。本发明的技术优点为：①基于本发明配制出的培养基营养更为均衡丰富，可以进行大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、葡萄球菌、链球菌等动物常见致病菌的培养及药敏试验。②本发明从接菌到出来药敏结果的时间一般在24h内，大大省去细菌培养及药敏试验的复杂的程序；利用传统药敏专用mh琼脂培养基进行药敏试验需要16-18h，而利用本发明药敏培养基进行药敏试验只需6-8h，两者所用时间差异显著。本发明可快速指导兽医临床用药，为减少死亡与控制动物疾病赢得宝贵的治疗时间；③发明成本较低，简单易行，特别适合兽医临床上快速指导用药。综上所述，本发明具有快速、准确、成本低的技术特点，在短时间内出具药敏试验结果，快速指导兽医临床合理用药。具体实施方式一种兽医临床快速增菌与药敏试验培养基：增菌培养基的配方为：在每1l增菌培养基原料中含有5g蛋白胨、7-10g䏡胨、5g葡萄糖、5ml甘油、45g营养琼脂、250ml肝汤及wg去离子水，w=1l增菌培养基的总质量－[蛋白胨、䏡胨、葡萄糖、甘油、营养琼脂与肝汤加合起来的总质量]；药敏培养基的配方为：在每1l药敏培养基原料中含有16g琼脂、24gmh培养基、80ml肝汤。一种制备增菌培养基的方法，①称取1kg动物肝脏，去筋膜，绞碎，放入烧杯中，加入1l去离子水，边搅拌边加热，煮沸后冷却，依次经洁净纱布、滤纸过滤至洁净容器内，再加入去离子水定容至1l，形成肝汤，可直接使用，或分装在瓶内，在121℃密闭灭菌20min，将其放置在温度为4℃的环境中进行恒温保存备用；②称取蛋白胨、䏡胨、葡萄糖、甘油、营养琼脂及肝汤，加入去离子水直至去离子水使蛋白胨、䏡胨、葡萄糖、甘油、营养琼脂、肝汤与去离子水加合起来的总体定容至1l时形成生增菌培养基，混匀后依次煮沸、放凉后形成熟增菌培养基，调节熟增菌培养基ph值至7.2-7.4后对熟增菌培养基进行分装，在115℃密闭灭菌15min，接着将熟增菌培养基分装至无菌培养皿，待其完全凝固后将其放置在温度为4℃的环境中进行恒温保存。一种制备药敏培养基的方法，①称取1kg动物肝脏，去筋膜，绞碎，放入烧杯中，加入1l去离子水，边搅拌边加热，煮沸后冷却，依次经洁净纱布、滤纸过滤至洁净容器内，再加入去离子水定容至1l，形成肝汤，可直接使用，或分装在瓶内，在121℃密闭灭菌20min，将其放置在温度为4℃的环境中进行恒温保存备用；②称取琼脂、mh培养基及肝汤，加入去离子水直至去离子使琼脂、mh培养基、肝汤与去离子水加合起来的总体定容至1l时形成生药敏培养基，混匀后煮沸、放凉后形成熟药敏培养基，调节熟药敏培养基ph值至7.2-7.4后对熟药敏培养基进行分装，在115℃密闭灭菌15min，接着将熟药敏培养基分装至无菌培养皿，待其完全凝固后将其放置在温度为4℃的环境中进行恒温保存。一种应用增菌与药敏培养基的方法，①无菌采集病死动物病料：对病死动物进行表面尸体消毒，用消毒过的手术剖切工具打开病死动物腹腔及胸腔，露出内脏组织，用点燃的酒精棉球在内脏器官上进行表面消毒，然后用无菌采样器具剪取小块内脏，快速放入无菌培养皿中；②在增菌培养基上增菌：在无菌超净工作台中，将病料组织断面均匀涂布在增菌培养基表面，翻过来放入37℃恒温培养箱培养15-18h；③在药敏培养基上药敏试验：在无菌超净工作台中，用接种环挑取增菌培养基上的菌落，均匀涂布在药敏培养基上，贴上成品药敏片或贴上用现有药物自做的药敏片，翻过来放入37℃恒温培养箱培养6-8h；④根据抑菌圈直径大小判断细菌对抗菌药物的敏感性，从中选出最佳药物。本发明的具有实施例为：[1]肝汤的配制：称取1kg羊、牛、猪等动物肝脏，去筋膜，绞碎，放入烧杯中，按照1：1的比例加入1l去离子水，边搅拌边加热，煮沸后冷却，先用洁净纱布过滤，再用滤纸过滤，加入去离子水定容至1l，形成肝汤，直接使用。剩余的肝汤分装在瓶内，121℃加压灭菌20min，，保存至4℃冰箱以备后用。[2]增菌培养基的配制：称量5g蛋白胨，8g䏡胨，5g葡萄糖，5ml甘油，45g营养琼脂，250ml肝汤，用去离子水定容至1l，混匀后煮沸，放凉，调节ph值至7.3，分装至洁净玻璃瓶子中，封口，115℃高压灭菌15min，在分装至直径为90mm无菌培养皿，待完全凝固，保存至4℃备用。作为对比，称取普通肉汤培养基30g，加热溶解于1l去离子水中，并不停搅拌，煮沸1min。分装三角瓶，121℃高压灭菌15min，备用。[2]药敏培养基的配制：称量16g琼脂，24gmh培养基，80ml肝汤，用去离子水定容至1l，混匀后煮沸，放凉，调节ph值至7.3，分装至洁净玻璃瓶子中，封口，115℃高压灭菌15min，在分装至直径为90mm无菌培养皿，待完全凝固，保存至4℃备用。作为对比，称取水解酪蛋白胨(mh)琼脂38g，加入蒸馏水或去离子水1l，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，121℃高压灭菌15min，备用。[3]养殖户送检病死鸡2只，临床上表现为精神不振，消瘦，排绿色或白色稀粪。首先对病死鸡进行表面尸体消毒，其次用消毒过的手术刀、手术剪等打开鸡的腹腔及胸腔，暴露内脏，用点燃的酒精棉球在肝脏、脾脏及肾脏上进行表面消毒，然后用无菌的手术剪、镊子等剪取小块肝脏、脾脏及肾脏，重点采集病变部位，一式两份，快速放入无菌培养皿中。[4]在无菌超净工作台中，将一份病料均匀涂布在增菌培养基表面，放入37℃恒温培养箱培养16h。作为对比，将另一份病料放入普通肉汤培养基进行前增菌，37℃恒温培养箱培养18h。[5]在无菌超净工作台中，用接种环挑取增菌培养基上的菌落；一方面，均匀涂布在药敏培养基上，贴上成品药敏片，做好标记，放入37℃恒温培养箱培养6h；另一方面，挑取增菌培养基上单个菌落进行纯培养，再进行生化鉴定，以确定细菌种类。作为对比，用接种环调取普通肉汤培养基内的菌液，均匀涂布在营养丰富的大豆酪蛋白琼脂培养基（tsa）上，翻过来放入37℃恒温培养箱培养16h。用接种环挑取tsa培养基上的菌落，一方面，均匀涂布在mh培养基上，贴上成品药敏片，做好标记，放入37℃恒温培养箱培养16h。另一方面挑取tsa培养基上单个菌落进行纯培养，再进行生化鉴定，以确定细菌种类。[6]本发明具有快速、准确、成本低的技术特点，被临床资料充分证明，用直尺测量每种药物的抑菌圈，抑菌圈的大小如表1所示。抑菌圈直径20mm以上为极敏，15~20mm为高敏，10~14mm为中敏，10mm以下为低敏，0mm为不敏。根据抑菌圈直径大小判断细菌对抗菌药物的敏感性，选出最佳药物。本发明试验从接菌到出来药敏结果共用22h，最敏感药物为头孢噻呋、其次为卡那霉素和阿米卡星，最终生化鉴定结果为沙门氏菌。传统对比试验从接菌到出来药敏结果共用50h，最敏感药物也为头孢噻呋、其次为卡那霉素和阿米卡星，最终生化鉴定结果为沙门氏菌。这说明本发明设计的药敏试验是快速、准确的，可为兽医临床用药提供及时的指导。表1（药敏试验结果）药物名称本发明试验方法抑菌圈大小（mm）对比试验抑菌圈大小（mm）新霉素18.219.1头孢噻呋27.126.5卡那霉素25.325.9庆大霉素16.517.8链霉素6.87.5氯霉素20.519.8环丙沙星8.58.0阿米卡星24.625.6克林霉素2.10诺氟沙星18.017.2四环素3.62.1当前第1页12