本发明为关于一种使用保藏号为bcrc11697的乳酸菌(lactobacillusplantarum)将芒果皮提取液中的果糖基化芒果苷含量增加的一种方法，以及一种以保藏号为bcrc11697的乳酸菌(lactobacillusplantarum)进行芒果苷和糖基供体的生物转化反应生成果糖基化芒果苷的用途。
背景技术：
：芒果苷是一种四羟基吡酮的碳酮苷，属双苯吡酮类黄酮类化合物，在多种植物中存在，如芒果树、扁桃树、东北龙胆及知母等。芒果苷分子式：c19h18o11，分子量：422.3。芒果苷具有多种生物活性和药理作用，如抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、抗糖尿、抗炎等(邓家刚，蕈骊兰.长春中医药大学学报，2008，24(4):463-464.)。芒果苷虽具有广泛药理活性，但其溶解度很差，严重限制了其制剂的开发，为方便应用，需要改善芒果苷溶解性和生物利用度。对于复杂结构的天然活性成分来说，利用化学合成来进行结构修饰存在着产率低、反应专一性差、副产物多等缺点，特别是有些反应目前利用化学手段较难实现，生物转化技术却可弥补化学合成的不足。cantagrel等(公开号：fr2882762a1)以来源于两株肠膜状明串珠菌的葡萄糖基转移酶，对芒果苷进行糖基化修饰，在芒果苷为糖基受体，蔗糖为糖基供体时，得到葡萄糖基-β-(1,6)-芒果苷(casrn：908570-23-0)。当leuconostocmesenteroidesnrrlb-1299菌株作为生物催化剂，在0.4g/l芒果苷，40g/l蔗糖条件下，糖基化反应收率为25％；当leuconostocmesenteroidesnrrl521-f菌株作为生物催化剂，在0.4g/l芒果苷，40g/l蔗糖条件下，糖基化反应收率为28％。中国专利申请案公开号cn102863484a揭示了一种果糖基化芒果苷的制备方法，该方法包括将具有果糖基化酶活性的物质加入含有芒果苷的转化液中，进行生物转化反应，使芒果苷转化为果糖基化芒果苷，所述转化液中含有芒果苷和糖基供体，该具有果糖基化酶活性的物质为来源自烟草节杆菌，其保藏号为cctccm2010164，的发酵液。在前述法国公开号fr2882762a1及中国公开号cn102863484a的专利申请案中均使用了纯化的芒果苷来进行芒果苷的果糖基化。技术实现要素：本发明的一主要目的是提供一种直接以含有芒果苷的植物提取液作为基质进行生物转化反应，使该芒果苷转化为果糖基化芒果苷的方法。本发明的另一目的是提供一种合适的微生物，来进行直接以含有芒果苷的植物提取液作为基质的生物转化反应，使该芒果苷转化为果糖基化芒果苷。本发明的又一目的是提供一种合适的微生物及方法，将芒果皮提取液中的果糖基化芒果苷的含量提升。本发明的一种增加植物提取液中的果糖基化芒果苷含量的方法，包含下列步骤：提供一含有芒果苷的植物提取液；及将一糖基供体加入该植物提取液中，于一具有果糖基化酶活性的物质的存在下进行生物转化反应，使该芒果苷转化为果糖基化芒果苷，其中该具有果糖基化酶活性的物质系通过保藏号为bcrc11697的乳酸菌(lactobacillusplantarum)的发酵而产生。优选地，该植物提取液为芒果皮提取液。优选地，该糖基供体为蔗糖或葡萄糖。更优选地，该糖基供体为蔗糖。优选地，该保藏号为bcrc11697的乳酸菌(lactobacillusplantarum)被加入于该植物提取液中。优选地，该保藏号为bcrc11697的乳酸菌(lactobacillusplantarum)的一发酵液被加入于该植物提取液中。优选地，该保藏号为bcrc11697的乳酸菌(lactobacillusplantarum)的一发酵上清液被加入于该植物提取液中。优选地，纯化自该保藏号为bcrc11697的乳酸菌(lactobacillusplantarum)的一发酵上清液的果糖基化酶被加入于该植物提取液中。优选地，该生物转化反应为于一乳酸菌培养基中、20-40℃及不搅拌或搅拌速度不大于400rpm下进行0.5至96小时，且以100ml的该培养基为基准，该糖基供体的用量为1-20克，该植物提取液的用量为1-60ml，及该乳酸菌的用量为105～107cfu/ml。本发明提供一种使用保藏号为bcrc11697的乳酸菌(lactobacillusplantarum)进行芒果苷和糖基供体的生物转化反应生成果糖基化芒果苷的用途。本发明提供一种使用保藏号为bcrc11697的乳酸菌(lactobacillusplantarum)的一发酵液进行芒果苷和糖基供体的生物转化反应生成果糖基化芒果苷的用途。本发明提供一种使用保藏号为bcrc11697的乳酸菌(lactobacillusplantarum)的一发酵上清液进行芒果苷和糖基供体的生物转化反应生成果糖基化芒果苷的用途。本发明提供一种使用纯化自该保藏号为bcrc11697的乳酸菌(lactobacillusplantarum)的一发酵上清液的果糖基化酶进行芒果苷和糖基供体的生物转化反应生成果糖基化芒果苷的用途。附图说明图1为果糖基化芒果苷标准品在不同波长下的紫外光吸收光谱。图2为依本发明方法以lactobacillusplantarum乳酸菌转化后离心去除菌体后的上清液在不同波长下的紫外吸收光谱。图3为果糖基化芒果苷标准品的液相色谱质谱(lc-ms)图谱。图4为依本发明方法以lactobacillusplantarum乳酸菌转化后离心去除菌体后的上清液lc-ms图谱。图5显示不同糖基供体对本发明菌株将芒果苷转化成果糖基化芒果苷的影响。图6显示不同用量(比例)的蔗糖糖基对本发明菌株将芒果苷转化成果糖基化芒果苷的效率的比较结果。具体实施方式依本
发明内容所完成的一优选具体实施态样包括一种将芒果皮提取液中的果糖基化芒果苷含量增加的方法，主要包含将一糖基供体加入该芒果皮提取液中，于一具有果糖基转化酶活性的物质的存在下进行生物转化反应，使该芒果皮提取液中所含有的芒果苷转化为果糖基化芒果苷，其中该具有果糖基转化酶活性的物质系通过保藏号为bcrc11697的乳酸菌(lactobacillusplantarum)的发酵而产生。透过上述方法可以使芒果皮更有效率的被制备成果糖基化芒果苷，不仅解决芒果盛产时将芒果制成果汁或芒果干或芒果果肉罐头时，芒果皮的出处，有利于减少环境污染，也达到全果利用、提升芒果的经济价值的目标。一适合制备用于本发明的芒果皮提取液的方法包括(但不限于)下列步骤：将芒果皮清洗及搅碎；接着以纤维酵素(cellulase)于室温至50℃进行均质处理60～180分钟；于60℃烘干去除水分，再粉碎成粉末；将该粉末以1:5～1:20g/ml的比例与一极性溶剂混合，且于室温至50℃及优选地于超声波振荡例如125～500w/l功率下，于50℃提取60分钟，移除该极性溶剂，可得到含芒果苷的果皮提取液。合适的极性溶剂例如水、c1-c3的醇及其等之混合液，优选地为乙醇与水的混合，例如50％(v/v)乙醇。前述芒果皮提取液为本发明应用微生物转化芒果苷的基质材料来源，本发明应用纤维酵素(cellulase)或其它类似能分解植物细胞璧之酵素来促进细胞内物质的提取效益。另外，提取时辅以超声波振荡，能进一步提升芒果皮中类黄酮物质的提取效果。本发明经过探讨溶剂比例、超声波功率与提取时间等参数，得到以50％(v/v)乙醇水溶液，超声波功率500w/l，于50℃提取60分钟，可得到较高含量的芒果多酚及富含芒果苷的芒果皮提取液。于一优选具体实施例中，经hplc定量分析芒果皮提取液中的果糖基化芒果苷含量为18μg/ml。一适合用于本发明的糖基供体包括(但不限于)蔗糖、葡萄糖及果糖，以蔗糖或葡萄糖为优选，而以蔗糖为最优选。优选地，于本发明方法的生物转化反应中该保藏号为bcrc11697的乳酸菌(lactobacillusplantarum)的一发酵上清液被加入于该芒果皮提取液。一适合用于该bcrc11697的乳酸菌的培养基配方包含：葡萄糖2～80g/l，蛋白胨5～50g/l，kh2po40.4～4g/l，mgso4·7h2o0.05～1.0g/l，mnso4·h2o0.01～0.1g/l，ph6～8的乳酸菌培养基。本发明方法优选地进一步包含将该生物转化反应得到的果糖基化芒果苷含量增加的产物纯化，例如借由树脂纯化的手段得到其中的水相部分。该水相部分可以直接或浓缩后被使用作为抗氧化剂，添加于防晒乳等保养品或化妆品。选择性地，也可通过已知纯化方法将果糖基化芒果苷从该液体部分分离出来而得到纯化的果糖基化芒果苷。实施例材料与方法一、材料与方法1.培养基配方及菌株培养(1)乳酸菌培养基(mrs培养基)mrs培养基配方：依序加入1g月示蛋白胨(proteosepeptone)no.3、1g的牛肉汁(beefextract)、0.5g的酵母菌提取物(yeastextract)、2g的葡萄糖(dextrose)、0.1gtween80表面活性剂、0.2g柠檬酸铵(ammoniumcitrate)、0.5g的ch3coona、10mg的mgso4·7h2o、5mgmnso4·h2o、0.2gk2hpo4，随后补水使其体积达到100ml，调ph至6.5后进行高压灭菌。菌株于培养基活化后，菌株接种量为培养基体积的10％。生长温度为37℃、ph6.5、静置培养(0rpm)培养，菌液之od600达到10时离心去除菌体，得到上清液。(2)细菌培养基(nutrient培养基)依序加入0.3g牛肉汁(beefextract)、0.5g蛋白胨(peptone)，随后补水使其体积达到100ml，调ph至7.0后进行高压灭菌。菌株于培养基活化后，菌株接种量为培养基体积的10％。生长温度为26℃、ph7.0、100rpm培养，菌液之od600达到10时离心去除菌体，得到上清液。(3)酵母菌培养基(ypd培养基)依序加入2g蛋白胨(peptone)、2g葡萄糖(dextrose)和1g酵母菌提取物(yeastextract)，随后补水使其体积达到100ml后进行高压灭菌。菌株于培养基活化后，菌株接种量为培养基体积的10％。生长温度为25℃、ph7.0、100rpm培养，菌液之od600达到10时离心去除菌体，得到上清液。(4)丝状真菌培养基(麦芽提取物)依序加入2.0g葡萄糖(glucose)、1.0g蛋白胨(peptone)和2.0g麦芽汁(maltextract)，随后补水使其体积达到100ml后进行高压灭菌。菌株于培养基活化后，菌株接种量为培养基体积的10％。生长温度为24-30℃、ph7.0、100rpm培养，菌液之od600达到10时离心去除菌体，得到上清液。2.芒果皮提取液的制备将芒果皮洗净搅碎，以2％(w/w)比例加入纤维酵素(cellulase)于50℃进行水解反应180分钟，后于60℃烘箱内烘干去除水分，均质粉碎成芒果皮粉末后，进行超声波辅助提取制程，提取条件为50％(v/v)乙醇、料液比1:5、超声波功率500w/l、超声波频率40hz、提取温度50℃，提取60分钟后，于60℃真空烘箱去除乙醇，得到含芒果苷之果皮提取液。3.果糖基化芒果生物转化反应：将上述菌液、上述芒果皮提取液、及一糖基供体的水溶液添加于水或磷酸盐缓冲盐水(pbs)中，于37℃进行生物转化反应，使芒果苷转化成为果糖基化芒果苷，反应时间为96小时。该菌液的添加为全部转化反应液体积的10％，该芒果皮提取液的添加量为全部转化反应液体积的10％，而糖基供体的水溶液的添加量为每100ml的转化反应液含0～20克的糖基(0～20w/v％)。以高效液相色谱法来分析果糖基化芒果苷含量。除了不添加前述菌液外重覆上述生物转化反应的步骤，而得到作为对照之用的一控制组的数据。4.果糖基化芒果苷之高效液相色谱法(hplc)定量精密称取1mg果糖基化芒果苷(fructosylatedmangiferin)标准品，用50％乙醇溶解，制成1ml中含0.01～1mg的对照品溶液。测试样品为转化反应完成后的液体，以8000rpm离心5分钟，取上清液，将1ml的样品溶液，利用hplcatlantist3管柱(c18,4.6mm内径×250mm,5μm粒径)，流动相溶液为乙腈:l％冰醋酸溶液(15:85)，反应温度25℃，流速设定为1.0ml/min，检测器波长设定为254nm，注射样品体积为20μl。用针筒吸取出样品，再以0.22umpvdf过滤后，做hplc定量分析(郭伶伶、张讳、刘二伟、韩立峰、王涛,2013,芒果叶中芒果苷含量的测定,天津中医药大学学报,32(1)：43-45)。5.果糖基化芒果苷的液相色谱质谱(lc-ms)鉴定使用zorbaxeclipsexdb-c18narrowborerr管柱(2.1x150mm,3.5μm)。流动相分别为0.02％甲酸水溶液及0.02％甲酸甲醇溶液，流速设定为0.2ml/min。洗脱(溶离)过程如下：时间(min.)0.02％甲酸水溶液(％)0.02％甲酸甲醇溶液(％)09552.5955500100700100使用micromasszq质谱仪以电洒游离质谱仪(eletrosprayionozation,esi-ms)得到图谱，其中cone电压为10v、15v、20v、35v、50v。结果与讨论1.具有将芒果苷转化为果糖基化芒果苷的潜力菌株的筛选从财团法人食品工业发展研究所(中国台湾，新竹市)的生物资源保存及研究中心(bcrc)生物资源线上目录中的乳酸菌、细菌、酵母菌与丝状真菌中初步筛选出具有果糖基化酵素活性(β-fructofuranosidase、fructosyltransferase)或是具有酪氨酸酶(tyrosinase)抑制活性的潜力菌株，分别有2株细菌、1株酵母菌、10株乳酸菌以及6株丝状真菌共19株潜力菌。依前述方法将各菌株活化，进行生物转化反应，及以高效液相色谱法来分析果糖基化芒果苷含量，列果被列于表一。由表一结果可看出其中四株具有潜力，分别是2株细菌arthrobacternicotiandebcrc11219、arthrobacterglobiformsbcrc10598、1株酵母菌saccharomycescerevisiaebcrc20855、以及1株乳酸菌lactobacillusplantarumbcrc11697。基于产业的应用性，以gras菌株以及果糖基化芒果苷含量高者作为标的，因此筛选乳酸菌lactobacillusplantarum作为用于本发明的潜力菌株。表一、芒果苷转化生成果糖基化芒果苷的潜力菌株的筛选注：n.d*＝未测得2.不同的lactobacillusplantarum菌株转化生成果糖基化芒果苷的能力分析收集不同的l.plantarum菌株，分别是l.plantarumbcrc11697、bcrc12327、bcrc14059、bcrc15478、bcrc17178、bcrc17638，依前述方法将各菌株活化，进行生物转化反应，及以高效液相色谱法来分析果糖基化芒果苷含量，列果被列于表二。如表二所示，lactobacillusplantarumbcrc11697转化生成果糖基化芒果苷的能力最好。表二、不同lactobacillusplantarum使用芒果皮提取液为基质，转化生成果糖基化芒果苷的结果3.紫外光吸收光谱分析结果图1及图2分别是50μg/ml果糖基化芒果苷标准品溶液以及以lactobacillusplantarumbcrc11697进行生物转化反应后得到的液体产品在200.0～400.0nm的紫外光吸收光谱图。由图1及图2可知，果糖基化芒果苷标准品与以lactobacillusplantarumbcrc11697进行生物转化反应后得到的液体产品的吸收曲线峰形一致，且分别在238、254、317和367nm波长处均有吸收峰，其中以254nm处的吸收峰最强。因此，在本发明中以254nm为果糖基化芒果苷标准品和进行生物转化反应后得到的液体产品的果糖基化芒果苷含量的测定波长。4.lc-ms分析结果图3及图4分别是果糖基化芒果苷标准品及以lactobacillusplantarumbcrc11697进行生物转化反应后离心菌体得到的上清液的lc-ms图谱。比较图3及图4的lc-ms图谱，可以看出以本发明方法进行生物转化反应后得到的转化物中确实含有果糖基化芒果苷。5.比较不同糖基供体对菌株转化生成果糖基化芒果苷的影响于前述方法中使用lactobacillusplantarumbcrc11697及不同糖基供体(蔗糖、葡萄糖、果糖)进行生物转化反应的结果被示于图5，从其中可以看出蔗糖具有最高的果糖基化芒果苷转化效率，当转化时间在24小时内，果糖基化芒果苷含量可达相对高点35μg/ml。6.探讨不同比例蔗糖糖基对果糖基化芒果苷转化效率的比较图6是比较在添加0.5％～20％(w/v)的蔗糖糖基下，对果糖基化芒果苷转化效率的影响。控制组是不加lactobacillusplantarumbcrc11697菌液，只添加0.5％糖基进行转化的结果。果糖基化芒果苷含量在0小时为25μg/ml。由图6结果可得知，在蔗糖糖基高浓度(20％)与低浓度(0.5％)之间，进行生物转化反应的时间在6小时时，果糖基化芒果苷的含量可以达到相对高值。另外在0.5％蔗糖糖基这组其平均转化效率优于其他高浓度组。图6中0.5％糖基及6小时转化的条件具有最高的果糖基化芒果苷含量，可达57μg/ml比控制组25μg/ml提升1倍以上。在本发明中的提到的任何数值，如果在任何最低值和任何最高值之间只是有两个单位的间隔，则包括从最低值到最高值的每次增加一个单位的所有值。例如，如果声明一种组分的量，或诸如温度、压力、时间等工艺变量的值为50-90，在本说明书中它的意思是具体列举了51-89、52-88……以及69-71以及70-71等数值。对于非整数的值，可以适当考虑以0.1、0.01、0.001或0.0001为一单位。这仅是一些特殊指明的例子。在本申请中，以相似方式，所列举的最低值和最高值之间的数值的所有可能组合都被认为已经公开。应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。当前第1页12