本发明涉及hla(humanleukocyteantigen，人类白细胞抗原)分型
技术领域：
，具体涉及一组用于hla分型的基因型序列。
背景技术：
：二十世纪70年代到80年代，hla分型技术主要是血清学和细胞学。90年代以来，分子生物学的发展，尤其是pcr技术的引入，使得分子技术在临床诊断方面得到广泛的应用，hla分型也不例外(woszczekg,etal.“comparisonofserologicalandmolecular(pcr-ssp)techniquesofhla-drtypinginclinicallaboratoryroutine”.anntransplant.1997；2(1):39-42)。1991年第11届国际hla专题讨论上提出了hla的dna分型方法，随着测序技术的突飞猛进，基于dna序列的分型方法已经取代了传统的血清学及细胞学分型方法。目前dna分型方法主要分为两种：基于核酸序列识别的方法和基于序列分子构型的方法。基于核酸序列识别的方法主要有：pcr-rflp、pcr-sso、pcr-ssp和pcr-sbt(anniaf,et.al.“overviewonhlaanddnatypingmethod”.biotecnologíaaplicada2005；22:91-101)。其中pcr-sbt测序方法是现世界卫生组织(who)推荐的hla分型方法的“金标准”。无论是以上哪种分型技术均依赖于hla数据库，即imgt/hla数据库。hla新基因型的发现就是一种直接丰富hla数据库的手段，这种发现有助于提高造血干细胞移植配型的成功率和精确度。imgt/hla数据库从1998年12月份第一个版本(v1.0)中的964个基因型已经被丰富到2016年10月第72个版本(v3.26)中的15819个基因型。目前hla新基因型的发现，主要依赖于实验技术，即pcr和sanger测序，3730峰图分型。现有技术需要对两条单体型分别进行检测，检测耗时长，效率低。技术实现要素：本申请提供一组用于hla分型的基因型序列，包括seqidno：1所示的核苷酸序列。进一步地，还包括seqidno：2-10所示的核苷酸序列中的至少一个。进一步地，还包括seqidno：2-10所示的核苷酸序列中的至少两个。进一步地，还包括seqidno：2-10所示的核苷酸序列中的至少三个。进一步地，还包括seqidno：2-10所示的核苷酸序列中的至少四个。进一步地，还包括seqidno：2-10所示的核苷酸序列中的至少五个。进一步地，还包括seqidno：2-10所示的核苷酸序列中的至少六个。进一步地，还包括seqidno：2-10所示的核苷酸序列中的至少七个。进一步地，还包括seqidno：2-10所示的核苷酸序列中的至少八个。进一步地，还包括seqidno：2-10所示的核苷酸序列中的全部。本发明的用于hla分型的基因型序列，丰富了hla数据库，可以有效提高分型精度，从而提高相关疾病的治疗效率，如地中海贫血治疗、急性白血病、骨髓移植等。附图说明图1为本发明实施例的hla新基因型验证方法流程图；图2为本发明实施例运用rchsbt方法进行hla分型分析的流程图；图3为本发明实施例中样本s01的测序峰图；图4为本发明实施例中样本s02的测序峰图；图5为本发明实施例中样本s03的测序峰图；图6为本发明实施例中样本s04的测序峰图；图7为本发明实施例中样本s05的测序峰图；图8为本发明实施例中样本s06的测序峰图；图9为本发明实施例中样本s07的测序峰图；图10为本发明实施例中样本s08的测序峰图；图11为本发明实施例中样本s09的测序峰图；图12为本发明实施例中样本s10的测序峰图。具体实施方式本发明实施例结合信息分析方法，首先确定其中一条单体型，然后再利用实验技术进行另外一条单体型序列的确定。这种方法较以往的方法可以节省一半的时间，效率提高了50％。基于本方法，发现了一些新基因序列，对目前数据库中hla-a、-b、-c、drb1、dqb1的贡献度分别为0.82％、0.67％、0.91％、1.52％和3.07％。本发明实施例展示10种新基因型序列。本发明实施例的方法流程图如图1所示，大体包括如下步骤：将样本来源为骨髓或脐带血样本的dna文库，置于测序仪进行测序；对测序数据运用rchsbt方法进行hla分型分析；根据分析结果提供一条已知单倍体的基因型和一条未知单倍体的最同源基因型；提取未知单倍体对应样本dna；进行pcr扩增以获取未知单倍体的dna模板序列；对扩增产物进行sanger测序；对测序峰图进行分析。本发明实施例的方法，不仅可以丰富imgt/hla数据库，还可以提高造血干细胞移植配型的成功率和精确度，为地中海贫血、急性白血病等疾病的治疗提供更多保障。下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件进行。本实施例从150个新基因型序列中选取10个新基因型序列进行新基因型序列挖掘过程的展示，其中每个基因两个新基因型序列。详细信息如下表1：表1样本编号位点所属基因验证范围s01hla-a外显子1-8s02hla-a外显子1-8s03hla-b外显子1-7s04hla-b外显子1-7s05hla-c外显子1-7s06hla-c外显子1-7s07dqb1外显子1-6s08dqb1外显子1-6s09drb1外显子2-6s10drb1外显子2-6参考图1，本实施例的步骤大致如下：1、将样本来源为骨髓或脐带血样本的dna文库，置于测序仪进行测序。具体地，采用hiseq2500进行pe测序，将准备好的hiseqrapidsbskitv2试剂放入hiseq2500测序仪，完成初始化，后将文库稀释至一定浓度，置于测序仪对应位置，设置测序循环数，进行测序。2、对测序数据运用rchsbt方法进行hla分型分析(参见hongzhicaoetal.ashort-readmultiplexsequencingmethodforreliable,cost-effectiveandhigh-throughputgenotypinginlarge-scalestudies.hummutat,2013:00:1–6)。详细分析步骤见图2。3、依据rchsbt方法确定其中一条已知单倍体的基因型和一条未知单倍体的最同源基因型，结果如下表2：表2样本编号位点所属基因未知单体型的接近型别s01hla-aa*11:01:01s02hla-aa*24:02:01s03hla-bb*13:02:01s04hla-bb*15:11:01s05hla-cc*04:01:01s06hla-cc*07:02:01s07dqb1dqb1*02:02:01s08dqb1dqb1*05:03:01s09drb1drb1*11:01:01s10drb1drb1*15:01:014、根据样本信息，提取未知单倍体对应样本dna，详细步骤如下：(1)加1000μl红细胞裂解液，充分振荡均匀直至混合液光亮，12000rpm离心1min；(2)吸取700μl混匀全血到已作标记的2mlep管中；(3)弃上清，ep管开口向下扣在吸水纸上，尽量排出剩余残液；(4)加1000μl红细胞裂解液，重复(2)；(5)弃上清，ep管开口向下放吸水纸上，尽量排出剩余液体；(6)加入200μlatl、20μl蛋白酶k与200μlal，振荡15s，短暂离心；(7)将其置于56℃孵育15min，期间对每隔2-3min对其轻摇一次；(8)观察液体变清亮后，孵育完毕，短暂离心；(9)加200μl无水乙醇，轻轻颠倒ep管15～20次；(10)短暂离心后，将其转至已作相应标记qiaampminielutecolumn中，室温放置1-2min；(11)8000rpm离心1min，丢弃收集管，将离心柱转至一新收集管中；(12)加入500μlaw1，8000rpm离心1min，将收集管管口液体吸干，继续使用；(13)加入500μlaw2，8000rpm离心1min，丢弃收集管，将离心柱转至一新收集管中；(14)14000rpm，离心3min；(15)将离心柱转至一新1.5mlep管中，打开盖子，晾干2-3min；(16)取出一支56℃预温的ddh2o，向离心柱中心加入50μlddh2o，然后室温静置1min；(17)8000rpm离心3min后，弃掉离心柱，盖上ep管保存；(18)在紫外分光仪下测定dna的相关信息，记录下od值和纯度等；(19)按照所测定的od值进行稀释，一般将dna原管稀释至约50ng/μl(只对浓度50ng/μl以上dna进行稀释保存，50ng/μl或以下则直接原管保存即可)。5、对提取的dna进行pcr扩增，对扩增结果进行电泳检测并将pcr产物纯化。具体步骤包括：(1)pcr扩增，详细步骤如下：制备pcr反应体系，内容包括模板编号、引物名称、退火温度等内容；配置mix(不包含引物和模板)，mix配制完成后充分振荡并短暂离心，置冰上待用；分装mix，往已加引物与dna的反应板(管)中加入22μlmix，盖上胶垫(管盖)，瞬时离心至2000rpm，待上机；pcr上机，按照pcr反应体系，设置退火温度，运行pcr程序。(2)电泳检测，详细步骤如下：pcr下机，pcr程序运行完后取出pcr板，瞬时离心至2000rpm，待电泳；上样电泳，取3μlpcr产物与2μl6×上样缓冲液充分混匀，在1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳检测；电泳胶染色，电泳结束后放于溴化乙锭(0.5μg/ml)槽泡15min或以上；凝胶成像，小心将染色后的电泳胶取出并迅速转移到成像台上，在成像软件上调整相关参数，当观察其条带清晰后拍照保存。(3)pcr产物纯化，详细步骤如下：制备纯化表，将需进行纯化的反应孔编入纯化表；过膜纯化，首先润膜，其次转板抽滤，最后第二次洗滤。6、对pcr产物进行sanger测序，详细步骤如下：(1)测序反应，详细步骤如下：编制反应表，内容包括测序板号、产物编号、位点及测序引物的信息；配置mix(不包含引物和模板)，mix配制完成后充分振荡并短暂离心，置冰上待用；分装mix，向96孔pcr板(进口)加入3μlmix(分装已加入引物的mix的体积为4μl)，并盖上胶垫，瞬时离心至3000rpm；加引物，向pcr板加入相应测序引物1.1μl，盖上胶垫，瞬时离心至3000rpm，待用；加模板(纯化产物)，将纯化产物3000rpm离心1min，用单(八)道移液器向测序反应板中加入1μl模板，盖上胶垫，瞬时离心至3000rpm；pcr上机，按照《测序反应体系及程序》运行pcr程序。(2)测序反应后纯化，详细步骤如下：测序产物下机，4000rpm离心1min；金属离子螯合，向孔内加入2μl的edta-na2，并轻微振荡，使液滴滑落孔底，与产物充分混合；首次酒精沉淀，向孔内加入33μl的85％乙醇溶液，盖上原胶垫。漩涡振荡3min，4℃，3000g离心30min；首次倒离心，准备相应厚度吸水纸并依次整齐垫入离心机吊篮中，取下胶垫后将反应板倒扣于吸水纸上，胶垫与反应板一一对应留置待用，瞬时离心至760rpm停止，取出反应板盖好胶垫；再次酒精沉淀，向首次倒离心完成的反应板中加入50μl的70％乙醇溶液，盖上原胶垫。漩涡振荡2min，4℃，3000g离心15min；再次倒离心，准备相应厚度吸水纸并依次整齐垫入离心机吊篮中，弃去胶垫后将反应板倒扣于吸水纸上，瞬时离心至760rpm，并取出；暗箱风干，将反应板置于暗箱风干15min，使其乙醇彻底挥发；产物溶解，向已风干反应板中每孔加入10μlhidi去离子甲酰胺溶解纯化后产物，盖上封口膜，振荡10sec，短暂离心；产物变性，将反应板置于pcr仪中96℃变性2min后即可安排3730xl上机。(3)3730xl上机，详细步骤如下：上机前检查；参数设置；载入样品板，调用上机程序；样品板回收，上机程序终止后，样品板自动送至样品栈，取出样品板并将橡胶垫换成封口膜密封。测序峰图依次如图3至图12所示。7、峰图分型，详细步骤如下：(1)下载测序峰图，并根据质控标准对峰图进行审核，对于满足质控标准的峰图继续进行分型。(2)利用smartrename软件，根据《测序改名表》将测序峰图改名，使峰图文件与实验样本编号相匹配。(3)峰图分析，具体步骤如下：使用最新数据库版本峰图分析软件，导入已完成改名和截图的峰图文件；核对峰图命名信息与软件识别信息是否一致(包括外显子、引物、正/反向)，同一样本相同位点正反测序峰图组合对比；初看峰图，结合软件提示，对识别错误的位置进行修改；蓝色提示代表正反向峰图不一致，红色提示代表峰图与数据库不一致，对不一致的地方进行如实判断，更改相应snp，确定样本位点峰图全部修正，得出最接近型别；将峰图中snp情况与样本信息表中突变位点注释或原始峰图比对复核，若snp位置一致则正确。(4)基因组序列拼接，具体步骤如下：若突变点在外显子边缘，则需确定该外显子边界，确保突变点在外显子内部；从imgt/hla数据库中，选择新基因位点基因组fasta文件，并查找新基因最接近型别，将其复制粘贴到命名为“ref.fas”的新文本文档中；用seqman软件打开待测样本所有合格峰图，并标记“ref.fas”为参考序列。将不合格部分峰图屏蔽，去除“-”，并用小写字母更改snp。更改并检查后进行组装、保存一致性序列和单体型文件三步操作，以“.fas”格式保存待测样本基因组序列，命名为“样本号-位点+低分型别_gen”。用seqman软件打开检测样本所有合格峰图，并标记待测样本基因组序列作为参考序列。将不合格部分峰图屏蔽，去除“-”，若无snp则表明待测样本基因组序列拼接正确，若仍存在snp则重新进行步骤c)。(5)cds转换，具体步骤如下：从imgt/hla数据库中，选择新基因位点cdna序列fasta文件，并查找新基因最接近型别；将上步骤中新基因最接近型别的cds序列与待测样本基因组序列进行比对，查看比对结果；使用bioedit软件打开待测样本基因组序列文件并编辑，编辑内容包括删除非编码序列和内含子用100个“n”替换，编辑完成后以“.fas”格式保存待测样本cds序列，命名为“样本号-位点+低分型别_nuc”；重复第二步，即待测样本cds序列和基因组序列进行比对，若snp所在外显子显示一致性为1时，表示cds转换正确，若小于1，则重新转换cds。(6)根据以上步骤，得到最终验证的新基因型cds序列，详见下表3：表3备注：突变位点用加粗、斜体和下划线表示。8、申请检索号(accessionnumber)。9、提交imgt/hla数据库。以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属
技术领域：
的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。sequencelisting<110>深圳华大基因股份有限公司<120>用于hla分型的基因型序列<130>17i24004<160>10<170>patentinversion3.3<210>1<211>1098<212>dna<213>基因型序列s01<400>1atggccgtcatggcgccccgaaccctcctcctgctactctcgggggccctggccctgacc60cagacctgggcgggctcccactccatgaggtatttctacacctccgtgtcccggcctggc120cgcggggagccccgcttcatcgccgtgggctacgtggacgacacgcagttcgtgcggttc180gacagcgacgccgcgagccagaggatggagccgcgggcgccgtggatagagcaggagggg240ccggagtattgggaccaggagacacggaatgtgaaggcccagtcacagactgaccgagtg300gacctggggaccctgcgcggctactacaaccagagcgaggacggttctcacaccatccag360ataatgtatggctgcgacgtggggccggacgggcgcttcctccgcgggtaccggcaggac420gcctacgacggcaaggattacatcgccctgaacgaggacctgcgctcttggaccgcggcg480gacatggcagctcagatcaccaagcgcaagtgggaggcggcccatgcggcggagcagcag540agagcctacctggagggccggtgcgtggagtggctccgcagatacctggaaaacgggaag600gagacgctgcagcgcacggacccccccaagacacatatgacccaccaccccatctctgac660catgaggccaccctgaggtgctgggccctgggcttctaccctgcggagatcacactgacc720tggcagcgggatggggaggaccagacccaggacacggagctcgtggagaccaggcctgca780ggggatggaaccttccagaagtgggcggctgtggtggtgccttctggagaggagcagaga840tacacctgccatgtgcagcatgagggtctgcccaagcccctcaccctgagatgggagctg900tcttcccagcccaccatccccatcgtgggcatcattgctggcctggttctccttggagct960gtgatcactggagctgtggtcgctgccgtgatgtggaggaggaagagctcagatagaaaa1020ggagggagttacactcaggctgcaagcagtgacagtgcccagggctctgatgtgtctctc1080acagcttgtaaagtgtga1098<210>2<211>1098<212>dna<213>基因型序列s02<400>2atggccgtcatggcgccccgaaccctcgtcctgctactctcgggggccctggccctgacc60cagacctgggcaggctcccactccatgaggtatttctccacatccgtgtcccggcccggc120cgcggggagccccgcttcatcgccgtgggctacgtggacgacacgcagttcgtgcggttc180gacagcgacgccgcgagccagaggatggagccgcgggcgccgtggatagagcaggagggg240ccggagtattgggacgaggagacagggaaagtgaaggcccactcacagactgaccgagag300aacctgcggatcgcgctccgctactacaaccagagcgaggccggttctcacaccctccag360atgatgtttggctgcgacgtggggtcggacgggcgcttcctccgcgggtaccaccagtac420gcctacgacggcaaggattacatcgccctgaaagaggacctgcgctcttggaccgcggcg480gacatggcggctcagatcaccaagcgcaagtgggaggcggcccatgtggcggagcagcag540agagcctacctggagggcacgtgcgtggacgggctccgcagatacctggagaacgggaag600gagacgctgcagcgcacggacccccccaagacacatatgacccaccaccccatctctgac660catgaggccactctgagatgctgggccctgggcttctaccctgcggagatcacactgacc720tggcagcgggatggggaggaccagacccaggacacggagcttgtggagaccaggcctgca780ggggatggaaccttccagaagtgggcagctgtggtggtaccttctggagaggagcagaga840tacacctgccatgtgtagcatgagggtctgcccaagcccctcaccctgagatgggagcca900tcttcccagcccaccgtccccatcgtgggcatcattgctggcctggttctccttggagct960gtgatcactggagctgtggtcgctgctgtgatgtggaggaggaacagctcagatagaaaa1020ggagggagctactctcaggctgcaagcagtgacagtgcccagggctctgatgtgtctctc1080acagcttgtaaagtgtga1098<210>3<211>1089<212>dna<213>基因型序列s03<400>3atgcgggtcacggcgccccgaaccctcctcctgctgctctggggggcagtggccctgacc60gagacctgggccggctcccactccatgaggtatttctacaccgccatgtcccggcccggc120cgcggggagccccgcttcatcaccgtgggctacgtggacgacacccagttcgtgaggttc180gacagcgacgccacgagtccgaggatggcgccccgggcgccatggatagagcaggagggg240ccggagtattgggaccgggagacacagatctccaagaccaacacacagacttaccgagag300aacctgcgcaccgcgctccgctactacaaccagagcgaggccgggtctcacacttggcag360acgatgtatggctgcgacctggggccggacgggcgcctcctccgcgggcataaccagtta420gcctacgacggcaaggattacatcgccctgaacgaggacctgagctcctggaccgcggcg480gacaccgcggctcagatcacccagctcaagtgggaggcggcccgtgtggcggagcagctg540agagcctacctggagggcgagtgcgtggagtggctccgcagatacctggagaacgggaag600gagacgctgcagcgcgcggaccccccaaagacacacgtgacccaccaccccatctctgac660catgaggccatcctgaggtgctgggccctgggcttctaccctgcggagatcacactgacc720tggcagcgggatggcgaggaccaaactcaggacactgagcttgtggagaccagaccagca780ggagatagaaccttccagaagtgggcagctgtggtggtgccttctggagaagagcagaga840tacacatgccatgtacagcatgaggggctgccgaagcccctcaccctgagatgggagcca900tcttcccagtccaccgtccccatcgtgggcattgttgctggcctggctgtcctagcagtt960gtggtcatcggagctgtggtcgctgctgtgatgtgtaggaggaagagctcaggtggaaaa1020ggagggagctactctcaggctgcgtgcagcgacagtgcccagggctctgatgtgtctctc1080acagcttga1089<210>4<211>1089<212>dna<213>基因型序列s04<400>4atgcgggtcacggcgccccgaaccgtcctcctgctgctctcgggagccctggccctgacc60gagacctgggccggctcccactccatgaggtatttctacaccgccatgtcccggcccggc120cgcggggagccccgcttcatcgcagtgggctacgtggacgacacccagttcgtgaggttc180gacagcgacgccgcgagtccgaggatggcgccccgggcgccatggatagagcaggagggg240ccggagtattgggaccggaacacacagatctacaagaccaacacacagacttaccgagag300agcctgcggaacctgcgcggctactacaaccagagcgaggccgggtctcacaccctccag360aggatgtacggctgcgacgtggggccggacgggcgcctcctccgcgggcatgaccagtcc420gcctacgacggcaaggattacatcgccctgaacgaggacctgagctcctggaccgcggcg480gacacggcggctcagatcacccagcgcaagtgggaggcggcccgtgaggcggagcagtgg540agagcctacctggagggcctgtgcgtggagtggctccgcagatacctggagaacgggaag600gagacgctgcagcgcgcggaccccccaaagacacatgtgacccaccaccccatctctgac660catgaggccaccctgaggtgctgggccctgggcttctaccctgcggagatcacactgacc720tggcagcgggatggcgaggaccaaactcaggacaccgagcttgtggagaccagaccagca780ggagatagaaccttccagaagtgggcagctgtggtggtgccttctgcagaagagcagaga840tacacatgccatgtacagcatgaggggctgccgaagcccctcaccctgagatgggagcca900tcttcccagtccaccatccccatcgtgggcattgttgctggcctggctgtcctagcagtt960gtggtcatcggagctgtggtcgctactgtgatgtgtaggaggaagagctcaggtggaaaa1020ggagggagctactctcaggctgcgtccagcgacagtgcccagggctctgatgtgtctctc1080acagcttga1089<210>5<211>1096<212>dna<213>基因型序列s05<400>5atgcgggtcatggcgccccgaaccctcatcctgctgctctcgggagccctggcc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