本发明属于生物技术领域，尤其涉及用于催化n-乙酰-d-色氨酸水解生成d-色氨酸的新酶。
背景技术：
d-色氨酸作为一种非蛋白活性氨基酸，已经在一些小的肽循环和细菌的细胞壁多糖以及抗体蛋白中被发现，而且具有特殊的生理学性质。在食品饲料工业以及农业中可以作为非营养甜味剂、饲料添加剂和植物生长剂，在医药行业中，主要用于合成各种多肽，代替l-色氨酸延长肽类药物的半衰期并降低副作用，不致产生抗药性而成为酶抑制剂的重要合成前体。能提高机体的免疫能力，延缓过敏性反应的发生。大多数多肽类抗生素能抗革兰氏阳性菌，也有的对革兰氏阴性菌如绿脓杆菌、分枝杆菌、真菌、病菌和肿瘤细胞等有较好的抑制或杀灭作用。它还是一种治疗勃起不良反应药物的重要中间体。用d-色氨酸合成半合成抗生素，其侧链对于其药理功能起着重要的作用，肽键很难被β-内酰酶作用，从而有较高的稳定性，而且有抗菌谱广，毒性小，过敏性低，吸收快，血浓度高，药力持续时间长等。
目前，d-色氨酸的制备方法有四种方法：色氨酸消旋体化学合成法、不对称化学合成法、酶法合成以及拆分法。化学合成期间产生的副产物、无法回收的催化剂、废弃溶剂等都会造成严重的污染问题，因此，在d-色氨酸的工业生产中很少被应用。而酶法合成得率太低，工业化价值不大。因此，d-色氨酸的制备多为先合成n-乙酰-dl-色氨酸，然后经选择性水解酶得到纯度较高的d-色氨酸。已知的细菌、放线菌和霉菌等微生物中的n-乙酰-d-色氨酸水解酶，例如，氧化木糖无色杆菌(achromobacterxylosoxidans)，产碱菌(alcaligenesfaecalis)，好养反消化菌(defluvibactersp)，海洋链霉菌(streptomycesolivaceus)等，而且这些菌属的酶都受专利的保护。因此，开发一种新型的d-酰化色氨酸水解酶已成为必需。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供一种蛋白质。
本发明提供的蛋白质，其氨基酸序列为将d-酰化色氨酸水解酶氨基酸序列的第255位的甲硫氨酸突变为丙氨酸，其他氨基酸残基保持不变，得到的序列。
上述蛋白质中，所述d-酰化色氨酸水解酶来源于百日咳博德特氏菌(bordetellapetrii)，为如下a)或b)：
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白质。
编码上述的蛋白的dna分子也是本发明保护的范围。
上述dna分子的核苷酸序列为将序列3所示的dna分子的第763位-765位atg替换为gca。
含有上述dna分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。
所述重组载体指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、动物细胞病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于t7启动子的表达载体，如pet-22b等；在酵母中表达的载体，如yep系列载体等；在哺乳动物细胞中表达的msxnd表达载体等。总之，只要能在宿主细胞内稳定复制和存在，任何载体都可以用于构建重组表达载体。
优选地，所述重组载体为在pet-22b载体的多克隆位点，插入dna片段甲后，得到的重组质粒。可选的，克隆位点为bamhi酶切位点和xhoi酶切位点。
dna片段甲为序列3所示的dna分子的第763位-765位atg替换为gca得到的dna分子。
上述重组菌包含上述重组载体，且指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞如哺乳动物细胞。优选的为大肠杆菌、酵母。
上述蛋白、上述dna分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在催化n-乙酰-d-色氨酸水解生成d-色氨酸中的应用也是本发明保护的范围；
或上述蛋白、上述dna分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备催化n-乙酰-d-色氨酸水解生成d-色氨酸产品中的应用也是本发明保护的范围。
本发明另一个目的是提供一种制备d-色氨酸的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：以n-乙酰-d-色氨酸为底物，用上述蛋白催化n-乙酰-d-色氨酸水解生成d-色氨酸。
上述方法中，所述催化条件为30℃下反应10min；
或所述催化所在的体系包括n-乙酰-dl-色氨酸和所述蛋白。
本发明第3个目的是提供一种催化n-乙酰-d-色氨酸水解生成d-色氨酸的产品。
本发明提供的产品，包括上述蛋白或所述d-酰化色氨酸水解酶。
d-酰化色氨酸水解酶在催化n-乙酰-d-色氨酸水解生成d-色氨酸中的应用也是本发明保护的范围；
或d-酰化色氨酸水解酶在制备催化n-乙酰-d-色氨酸水解生成d-色氨酸产品中的应用也是本发明保护的范围；
所述d-酰化色氨酸水解酶为如下a)或b)：
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白质。
本发明经过研究发现d-酰化色氨酸水解酶可以催化生成d-色氨酸，并将该酶进行突变，得到酶突变体，提高酶的比活力。
附图说明
图1为重组质粒pet-22b-a9的质粒图谱示意图。
图2为实施例3和实施例7中提取蛋白的12％sds-page电泳图。
图3为野生型及突变体活性的检测图。
图4为重组质粒pet-22b-a9-cmr的结构示意图。
图5为重组质粒pet-22b-a9-cmr的表达和纯化结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、d-酰化色氨酸水解酶突变体的获得
一、d-酰化色氨酸水解酶基因的合成、载体构建
从百日咳博德特氏菌(bordetellapetrii)中克隆得到基因，序列如序列表序列2所示，该基因编码的蛋白的氨基酸序列为序列表序列1所示，命名为d-酰化色氨酸水解酶(也称为野生型酶)。在该基因不改变氨基酸序列的前提下，将上述野生型基因的密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子，经密码子优化后，基因序列具有大肠杆菌偏爱密码子，其基因序列如序列表序列3所示。
将序列表序列3所示的核苷酸构建到pet-22b载体(novagen，amp)的酶切位点bamhi和xhoi之间，得到重组质粒，该重组质粒命名为pet-22b-a9(a9inpet-22b(+)见图1)，该质粒表达序列表中序列1所示的d-酰化色氨酸水解酶，即为表达d-酰化色氨酸水解酶的质粒。
二、表达d-酰化色氨酸水解酶突变体的载体
对重组质粒pet-22b-a9进行定点突变，定点突变采用fastsite-directmutagenesissystemkit(购自transgene，fm111-02)试剂盒方法，得到表达d-酰化色氨酸水解酶突变体的载体。
1、表达突变体a154v的载体
突变体a154v为将序列1所示d-酰化色氨酸水解酶的氨基酸序列第154位的丙氨酸突变为缬氨酸，其他氨基酸残基不变，得到d-酰化色氨酸水解酶突变体a154v。
突变体a154v编码基因为将序列3所示的d-酰化色氨酸水解酶编码基因序列的第460位-462位碱基构成的密码子gct改造为gtt，得到d-酰化色氨酸水解酶突变体a154v的编码基因。
1)定点突变所需的突变引物设计如下：
上游引物：5’-ggtcactctaccctgcgtgttgctgttatgc-3’
下游引物：5’-aacacgcagggtagagtgaccaaccatgcaa-3’
引物包含5’端重叠区和3’端延伸区。
引物长度：除突变点之外，两条引物的长度大约在30个核苷酸，5’端重叠区包含15-20个碱基，3’端延伸区包含至少10个碱基。
突变引物：突变位点位于两条引物上，分别位于正向突变引物重叠区下游、紧邻重叠区；反向突变引物5’端。
退火温度的计算不包括突变碱基。
2)定点突变采用的pcr体系和pcr反应程序
以重组质粒pet-22b-a9为模板，用上述定点突变所需的上游引物和下游引物在如下pcr体系中进行pcr扩增，得到pcr扩增产物，实现定点突变。
上述pcr体系(50μl)：
上述pcr反应程序：
3)电泳检测
取10μl上述2)得到的pcr产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测。
4)pcr产物的消化
加1μldmt酶于pcr产物中，混匀，37℃孵育1h。
5)转化
a.加入3μldmt酶消化产物于50μldmt感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min。
b.42℃准确热激45s,立即置于冰上2min。
c.加入200μl平衡至室温的lb培养基，220rpm/min，37℃培养1h。
d.取200μl菌液涂lb，100mg/lamp平板，37℃培养箱过夜培养。
6)挑单克隆至5mllb液体培养基中(amp，100mg/l)，37℃、220r/min培养至od600为0.6。
7)提质粒，经过测序该质粒为a9-a154v，其含有突变体a154v编码基因，即为表达突变体a154v的载体。
表达突变体a154v的载体为将突变体a154v编码基因构建到pet-22b载体的酶切位点bamhi和xhoi之间得到重组质粒。
2、表达突变体t191a的载体
突变体t191a为将序列1所示d-酰化色氨酸水解酶的氨基酸序列第191位的苏氨酸突变为丙氨酸，其他氨基酸残基不变，得到d-酰化色氨酸水解酶突变体t191a。
突变体t191a编码基因为将序列3所示的d-酰化色氨酸水解酶编码基因序列的第570位-573位碱基构成的密码子act改造为gct，得到d-酰化色氨酸水解酶突变体t191a的编码基因。
按照上述1的方法，唯一的区别在于突变引物不同，具体如下：
上游引物：5’-gtatctctaccggtgctttctacccg-3’
下游引物：5’-cgggtagaaagcaccggtagagatacc-3’。
表达突变体t191a的载体为将突变体t191a编码基因构建到pet-22b载体的酶切位点bamhi和xhoi之间得到重组质粒。
3、表达突变体m255a的载体
突变体m255a为将序列1所示d-酰化色氨酸水解酶的氨基酸序列第255位的甲硫氨酸突变为丙氨酸，其他氨基酸残基不变，得到d-酰化色氨酸水解酶突变体m255a。
突变体m255a编码基因为将序列3所示的d-酰化色氨酸水解酶编码基因序列的第763位-765位核苷酸atg改造为gca，得到d-酰化色氨酸水解酶突变体m255a的编码基因。
按照上述1的方法，唯一区别的在于突变引物不同，具体如下：
上游引物：5’-tctcaccacaaagttgcaggtcagccg-3’
下游引物：5’-aactttgtggtgagagataacaaccgg-3’
表达突变体m255a的载体为将突变体m255a编码基因构建到pet-22b载体的酶切位点bamhi和xhoi之间得到重组质粒。
4、表达突变体k295q的载体
突变体k295q为将序列1所示d-酰化色氨酸水解酶的氨基酸序列第295位的赖氨酸突变为谷氨酰胺，其他氨基酸残基不变，得到d-酰化色氨酸水解酶突变体k295q。
突变体k295q编码基因为将序列3所示的d-酰化色氨酸水解酶编码基因序列的第882位-885位密码子aaa改造为caa，得到d-酰化色氨酸水解酶突变体k295q的编码基因。
按照上述1的方法，唯一的区别在于突变引物不同，具体如下：
上游引物：5’-tctaccatgctgaaacaagaccgtgt-3’
下游引物：5’-tttcagcatggtagaaccagcaac-3’
表达突变体k295q的载体为将突变体k295q编码基因构建到pet-22b载体的酶切位点bamhi和xhoi之间得到重组质粒。
三、d-酰化色氨酸水解酶及其突变体的表达
为了体外检测d-酰化色氨酸水解酶的活性，在大肠杆菌中对该酶及其突变体进行外源表达。
(1)将上述表达d-酰化色氨酸水解酶的质粒(pet-22b-a9)和各个表达d-酰化色氨酸水解酶突变体的载体分别转入bl21(de3)中，采用氨苄霉素抗性平板进行阳性克隆筛选(amp+，100mg/l)，37℃过夜培养；
(2)挑单克隆至5mllb液体培养基中(amp+，100mg/l)，37℃、220r/min培养至od600为0.6左右。将5mllb培养基中菌液转接至800ml2yt培养基中(amp+，100mg/l)，37℃、220rpm培养至od600为0.6左右时，加iptg至终浓度0.3mm，诱导表达16h；
(3)将上述培养菌液收集到收菌瓶中，3800rpm离心15min；
(4)弃上清，用40ml蛋白缓冲液(50mm磷酸盐，200mmnacl2，ph8.0)将所得菌体沉淀悬起，倒入50ml离心管中，-80℃冰箱保存，得到各个表达d-酰化色氨酸水解酶或其各个突变体的菌体沉淀。
四、d-酰化色氨酸水解酶及其突变体的纯化
(1)破菌：将上述三得到表达d-酰化色氨酸水解酶或其各个突变体的菌体沉淀的采用高压低温破碎仪(jn3000)，在压力1200bar，4℃条件下进行破菌2次。4℃、10000r/min离心45min，取离心后的沉淀、上清，制样；
(2)纯化：上清液经0.45μm微孔滤膜抽滤，进行镍亲和层析纯化，具体步骤如下：
a：柱平衡：挂上清前，先用ddh2o洗2个柱体积，再用蛋白缓冲液平衡ni亲和层析柱1个柱体积；
b：上样：将上清按0.5ml/min流速缓慢经过ni亲和层析柱，再重复一次；
c：洗脱杂蛋白：采用蛋白缓冲液冲洗1个柱体积，再用50ml20mm咪唑蛋白缓冲液去洗脱结合较强的杂蛋白，取前几滴流穿样品，制样；
d：洗脱目的蛋白：分别用30ml30mm，40mm，50mm咪唑蛋白缓冲液将目的蛋白洗脱下来，取前几滴流穿样品，制样，12％sds-page检测，结果如图2所示，可以看出，目的蛋白条带在48-63kda之间，约为56kda。
(3)浓缩换液：将收集到的目的蛋白用50mlamicon超滤管(30kda，millipore公司)离心浓缩(4℃、3400r/min)，浓缩至1ml。加10ml蛋白缓冲液，浓缩至1ml，重复该过程1次，得到d-酰化色氨酸水解酶及各种突变体，用液氮冷冻放入-80℃保存待用。
(4)用nondrop2000微量分光光度计检测浓缩后蛋白浓度，约为2mg/ml。
实施例2、d-酰化色氨酸水解酶和各种d-酰化色氨酸水解酶突变体酶活性检测
1、n-乙酰-dl-色氨酸拆分反应方程式如下：
2、检测方法
采用tnbs(2,4,6-三硝基苯磺酸)法测产物d-色氨酸
对照样品溶液的制备：对照样品反应体系(200μl)如下：100μl2％n-乙酰-dl-色氨酸，100μl100mm磷酸钾缓冲液(ph＝8.0)，30℃下反应10min后加100μltca(三氯乙酸)终止反应。
待测样品溶液的制备：待测样品反应体系(200μl)如下：100μl2％n-乙酰-dl-色氨酸60μl100mm磷酸钾缓冲液(ph＝8.0)，40μl上述四得到的d-酰化色氨酸水解酶或各种突变体，30℃下反应10min后加100μltca(三氯乙酸)终止反应。
取上述反应终止混合液5μl，加190μl1m硼酸钠(ph＝9.3)，最后加5μl的tnbs。30℃反应15min。
在420nm光吸收值下用96孔板检测对照样品溶液和待测样品溶液，通过检测产物d-色氨酸生成量，衡量酶活力大小。
说明：把该酶的反应底物换成n-乙酰-l-色氨酸，用tnbs法检测不到色氨酸生成，证明该酶的专一性很好，能特异的选择n-乙酰-d-色氨酸并把其催化生成d-色氨酸。
酶活力大小定义：一分钟催化生成1umol底物(d-色氨酸)所需要的酶量定义为1u，每毫克酶所具有活力单位定义为酶的比活力单位为：u/mg。
检测结果如下表1和图3所示，可以看出，实施例1制备的d-酰化色氨酸水解酶和各种突变体均能催化n-乙酰-d-色氨酸水解生成d-色氨酸，且d-酰化色氨酸水解酶突变体m255的酶活性最高。
表1为d-酰化色氨酸水解酶和各种d-酰化色氨酸水解酶突变体酶活性检测结果
实施例3、重组质粒(pet-22b-a9-cmr)构建以及蛋白活性检测
由于氨苄抗性可能会在感染噬菌体后成为细菌的裂解剂，氯霉素抗性同样也是比较常见的抗生素价格低廉而且不会作为裂解剂。在菌体感染温和噬菌体时不会把菌体裂解，因此将实施例1的重组质粒pet-22b-a9中的氨苄抗性用氯霉素抗性替换，看是否影响d-酰化色氨酸水解酶的表达。
1、重组质粒pet-22b-a9-cmr构建
将重组质粒pet-22b-a9中的氨苄抗性用氯霉素抗性替换。
引物设计：
s：tattgaaaaaggaagagttgatcggcacgtaagaggtt
as：gtaaacttggtctgacagttacgccccgccctgccact
用上述引物在pbr325质粒上扩增氯霉素抗性基因得到片段1。
s：ctgtcagaccaagtttactcatatatactttagattga
as：actcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagg
用上述引物以pet-22b-a9质粒为模板得到线性片段2。把这两条片段用onestepcloningkit(vazyme)一步连接起来得到pet-22b-a9-cmr重组质粒。
重组质粒pet-22b-a9-cmr(a9-ma-22b-cm)为将氯霉素抗性基因(序列4)替换重组质粒pet-22b-a9的氨苄抗性基因(如图4所示)，得到的载体。
再把重组质粒pet-22b-a9-cmr转入大肠杆菌bl21(de3)中，得到重组菌株bl21(de3)pet-22b-a9-cmr。
2、重组质粒的蛋白表达与纯化
将重组菌株bl21(de3)pet-22b-a9-cmr按照实施例1的三和四中进行表达和纯化。
12％sds-page检测，结果如图5所示，可以看出，替换成氯霉素抗性后d-乙酰化色氨酸水解酶仍然有表达，且表达量没有减少。
序列表
<110>中国科学院天津工业生物技术研究所
<120>用于催化n-乙酰-d-色氨酸水解生成d-色氨酸的新酶
<160>4
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>484
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
metserthrserserthraspprotyraspleuileleualaglygly
151015
thrleuileaspglyserasngluproargargargalaaspvalgly
202530
leuargglyaspargvalalaalathrglyaspleualaglyglngln
354045
alaargargargvalaspvalthrglymetilevalalaproglyphe
505560
ileaspserhisthrhisaspaspasntyrleuleugluhisproasp
65707580
metthrprolysileserglnglyvalthrthrvalvalthrglyasn
859095
cysglyileserleualaproleuarghisaspserproproalapro
100105110
leuaspleuleuaspalaglyglysertyrargpheglyargpheasn
115120125
asptyrleuaspalaleuargasphisproproalavalasnalaala
130135140
cysmetvalglyhisserthrleuargalaalavalmetproaspleu
145150155160
aspargthralathrproalagluileaspthrmetglnalaleuala
165170175
gluglualametalaalaglyalaileglyileserthrglythrphe
180185190
tyrproproalaalaargalaserthrglugluileilegluvalcys
195200205
argproleuserserargglnglyiletyralathrhismetargasp
210215220
gluglygluhisilevalalaalaleuglngluthrpheargilegly
225230235240
arggluleuaspvalprovalvalileserhishislysvalmetgly
245250255
glnproasnpheglyargserglugluthrleualaileilegluala
260265270
alametalaargglnaspilealaleuaspalatyrprotyrvalala
275280285
glyserthrmetleulyslysaspargvalleuleualaglyargthr
290295300
ileilethrtrpcyslysproargprogluleualaglyargaspleu
305310315320
aspgluvalalaalagluargglymetalalystyraspleuvalglu
325330335
gluleuglnproalaglyalailetyrphemetmetaspgluproasp
340345350
valargargileleualapheproprothrmetileglyseraspgly
355360365
leuprohisaspglnargprohisproargleutrpglythrphepro
370375380
argvalleuglyhistyralaargaspvalglyleupheserleuglu
385390395400
thralavaltrplysmetserglyleuthralaalaargpheglyleu
405410415
proaspargglyleuvalglnproglycysphealaaspleuvalval
420425430
pheaspproaspthrvalalaaspvalalaasppheaspasnprothr
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gluargalaalaglyilehisservaltyrvalasnglyalaproval
450455460
trpgluasnglnalaphethrglyglnleualaglyargvalleupro
465470475480
argserproarg
<210>2
<211>1455
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
atgtccacatcctctaccgacccctacgacctgattctggccggcggcacgctgatcgac60
ggcagcaacgagccgcgccggcgcgccgacgtcggcttgcggggcgaccgcgtggccgcg120
acgggcgacctggccggccagcaggcgcggcgccgcgtcgatgtcaccggcatgatcgtg180
gcgcccggcttcatcgattcgcacacgcacgacgacaactatttgctggaacaccccgac240
atgacgcccaagatatcgcagggggtcaccaccgtcgttaccggcaattgcggcatcagc300
ctggcgccgctcaggcatgactcgccgcccgctcccctggacctgctggacgcgggcggc360
tcgtaccgtttcgggcggttcaacgactacctggacgcgctacgcgaccacccgccggcc420
gtcaacgcggcgtgcatggttgggcactcgacgctgcgcgccgccgtgatgccggacctg480
gaccggacagctacgccggccgagatcgacaccatgcaggcgctggccgaagaggccatg540
gcggccggcgcgatcggcatttccaccggcaccttctacccgcccgccgcgcgcgccagt600
accgaagagatcatcgaagtctgccgcccactcagttcacgccagggcatctacgccacc660
cacatgcgcgacgaaggcgagcacatcgtcgcggccctgcaggaaaccttccggatcggc720
cgcgagctcgatgtgccggtggtcatttcgcatcataaagtgatgggccagccgaacttc780
ggacgctcggaagaaacgctggccatcatcgaggcggccatggcgcgccaggacatcgcg840
ctggatgcctacccatacgtggccggatccaccatgctgaagaaagaccgtgtcctgctg900
gccggccgcaccatcatcacgtggtgcaagccacgccccgaactggccggccgcgacctg960
gacgaggtggcggccgagcgcggcatggccaagtacgacctggtggaagaactgcagccg1020
gccggggccatttacttcatgatggacgagccggacgtgcggcgcattctggcgttcccg1080
cccaccatgatcggctcggacggactgccgcacgaccaacggccgcatccgcggctgtgg1140
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accgcggtctggaaaatgtcgggcctgaccgccgcccggttcggcctgccggaccggggg1260
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cgaagcccccgctga1455
<210>3
<211>1452
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
atgtctacctcttctaccgacccgtacgacctgatcctggctggtggtactctgatcgac60
ggttctaacgaaccgcgtcgtcgtgctgacgttggtctgcgtggtgaccgtgttgctgct120
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