本发明涉及一种l-氨基酸脱氨酶的突变体及其制备方法与应用，属于基因工程领域。
背景技术：
l-氨基酸脱氨酶是一种能够催化l-氨基酸生成α-酮酸的氧化还原酶。一直以来，有着大量对其研究与报道，大多数关于该酶的三维结构、底物特异性。近年来，有关利用该酶生物转化生产α-酮酸逐渐引起研究人员的注意，拥有着广泛的应用前景。由于该酶定位在细胞膜当中，酶与细胞膜上的电子传递链相关，在转化l-氨基酸生成α-酮酸的过程中，电子经过电子传递链传递给细胞色素氧化酶，使分子氧还原为水，过程不产生过氧化氢，有利于转化保持在一个温和的环境下持续进行，这为异源表达氨基酸脱氨酶转化l-亮氨酸生产α-酮异己酸提供了可能。
然而目前利用该酶转化生产α-酮异己酸的产量和转化率都较低，还不能够达到工业化生产的要求，因需要进一步提高α-酮异己酸的产量和转化率。先前有关研究团队开发的一种rbs优化提高α-酮异己酸产量的方法，虽然能够提高α-酮异己酸的产量，但转化率太低(刘龙，陈坚，堵国成，李江华，宋阳.一种rbs优化提高α-酮异己酸产量的方法.申请号201510575189.1)。因此，为提高α-酮异己酸的产量和转化率，增强其工业应用价值，急需提高l-氨基酸脱氨酶对l-亮氨酸的催化效率。
技术实现要素：
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种l-氨基酸脱氨酶的突变体，含有seqidno.1所示的氨基酸序列。
本发明的第二个目的是提供一种编码所述l-氨基酸脱氨酶的突变体的基因。
在本发明的一种实施方式中，所述基因含有seqidno.2所示的核苷酸序列。
本发明的第三个目的是提供一种提高l-氨基酸脱氨酶对l-亮氨酸的催化效率的方法，所述方法是将奇异变形杆菌(proteusmirabilis)来源的l-氨基酸脱氨酶的第436位的氨基酸苏氨酸thr突变成丙氨酸ala。
在本发明的一种实施方式中，所述奇异变形杆菌(proteusmirabilis)来源的l-氨基酸脱氨酶的genbank登录号为aaa8675，含有474个氨基酸。
本发明的第四个目的是提供一种构建所述突变体的方法，是在奇异变形杆菌(proteusmirabilis)l-氨基酸脱氨酶同源建模的基础上，通过结构分析确定突变位点；设计定点突变的突变引物，以携带l-氨基酸脱氨酶基因的pet20b载体为模板进行定点突变构建突变质粒t436a-pet20b，将突变后的质粒转化大肠杆菌bl21(de3)细胞，挑选验证后得到阳性单克隆t436a。
本发明的第五个目的是提供一种提高α-酮异己酸产量的方法，是利用所述的l-氨基酸脱氨酶突变体菌株作为全细胞催化剂，转化含l-亮氨酸的底物得到α-酮异己酸。
本发明的一种实施方式中，将含有20～25g/l全细胞、100～120g/l底物的体系在30～35℃反应18～22h生成α-酮异己酸。
在本发明的一种实施方式中，所述转化在20mm的tris缓冲液中进行。
本发明的一种实施方式中，所突变体菌株全细胞的按如下方式收集获得：将种子培养液按照2％的接种量接种到发酵培养基中，37℃培养至od600为0.6-0.8，添加终浓度为0.4mm的iptg，25℃诱导12h，收集细胞。
本发明的一种实施方式中，用于培养菌株的种子培养基每升含有：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水定容。
本发明的一种实施方式中，用于发酵的发酵培养基每升含有：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4ml，磷酸二氢钾2.31g，磷酸氢二钾16.42g。
本发明还要求保护所述突变体在发酵生产中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供了一种具有高效催化l-亮氨酸生产α-酮异己酸的l-氨基酸脱氨酶突变体及其制备办法与应用。突变体t436a对l-亮氨酸的催化效率比原l-氨基酸脱氨酶提高了72.7％，α-酮异己酸的产量达到106.2g/l，底物摩尔转化率为97.7％。本转化方法较化学法相比，具有反应条件温和，目标产物单一，易于分离，对环境友好等优势，且工艺简单，便于控制，易于推广应用。
附图说明
图1奇异变形杆菌(proteusmirabilis)l-氨基酸脱氨酶突变体纯化sds-page电泳图；泳道1：标准分子量蛋白；泳道2：空白对照；泳道3:t436a纯化制品。
图2奇异变形杆菌(proteusmirabilis)l-氨基酸脱氨酶突变体催化生成α-酮异己酸产量。□：出发酶wt；■：突变体t436a。
具体实施方式
lb培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水定容到1l。
发酵培养基：(tb培养基)：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4ml，磷酸二氢钾2.31g，磷酸氢二钾16.42g，蒸馏水定容到1l。
样品制备：取1ml转化后的转化溶液，在12,000rpm下离心5min，取上清液稀释后，经过0.45μm滤膜过滤，过滤液供液相色谱分析。
α-酮异己酸的含量测定：戴安高效液相色谱仪(配紫外可见检测器)，采用伯乐aminexhpx-87h(300×7.8mm，9μm)色谱柱，流动相为浓度2.5mmol/l的稀硫酸，流动相经0.22μm滤膜过滤，超声脱气，流速为0.6ml/min，柱温为40℃，在紫外检测波长205nm下检测。
实施例1奇异变形杆菌(proteusmirabilis)l-氨基酸脱氨酶突变体的制备方法
以连接有奇异变形杆菌l-氨基酸脱氨酶编码基因pma(基因序列seqidno.3所示)的pet20b质粒(简写为pma-pet20b)为模板，利用t436a的突变引物通过一次pcr得到大小为1422bp左右的产物，将pcr产物通过dpnⅰ处理后转化大肠杆菌jm109感受态细胞，挑选转化子测序验证。
突变引物如下所示(方框为突变位点)：t436a突变引物对：
上述pcr体系均为：
上述pcr条件均为：
95℃预变性3min，95℃变性3min然后进入以下循环：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸1min40s；34个循环；72℃延伸10min，4℃保温。
测序结果表明除了所需要的突变位点外，没有出现随机突变，因此突变质粒t436a-pet20b构建成功。
实施例2：奇异变形杆菌(proteusmirabilis)l-氨基酸脱氨酶突变体的表达纯化方法。
将突变体t436a-pet20b转化至大肠杆菌bl21(de3)细胞，挑选转化子进行测序验证。将验证后的阳性转化子在lb培养基中37℃培养过夜，后接入tb发酵培养基37℃培养至3h左右用终浓度为0.4mm的iptg诱导，降温至25℃培养12h。
收集发酵液，4℃，8000rpm离心20min收集菌体。将收集的细胞在洗涤液中超声，洗涤液组分：500mmnaci，20mmtrisph8.0，0.05％w/vtritonx-100，20mm咪唑。细胞裂解物16，000g离心30min，上清液过0.45μm膜后加到载到用洗涤液预平衡的镍螯合柱上，然后再用20倍柱体积的洗涤液洗涤柱子除去杂质，然后用30ml洗脱液洗脱目标蛋白，洗脱液组分：500mmnaci，20mmtrisph8.0，500mm咪唑。然后再将洗脱后的蛋白用脱盐柱进一步纯化，再用30kda的超滤管离心浓缩，得纯化的l-氨基酸脱氨酶突变体。纯化结果如图1所示，纯化后l-氨基酸突变体达到电泳纯，表观分子量52kda。
实施例3：奇异变形杆菌(proteusmirabilis)l-氨基酸脱氨酶突变体对l-亮氨酸的催化效率
催化反应体系为20ml，包括终浓度为20g/l的重组大肠杆菌全细胞、115g/l底物l-亮氨酸、20mm的tris缓冲液(ph8.0)，在200rpm30℃下保温20h后取样经hplc分析。催化效率通过生成产物的量来计算。其结果如图2所示。突变体t436a催化12h后可达到87.5g/l，催化20h后产量可以达到106.2g/l，转化率达到97.7％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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