一种siRNA及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及一种siRNA及其应用。

背景技术：

马立克氏病(Marek’s disease)是一种由疱疹病毒科高度细胞接触性马立克病毒(MDV)引起的肿瘤性疾病，该病能够引起免疫抑制和T细胞恶性淋巴瘤。马立克氏病与禽流感、传染性法氏囊和新城疫都是危害家禽产业发展的主要疫病。目前防治该病主要通过疫苗的方法，但是随着疫苗的广泛使用，MDV呈现毒力逐渐增强的趋势，所以寻找其他防治该病的方法，深入研究马立克氏病发病机制显得尤为重要。关于马立克氏病抗性、易感基因的研究越来越多，其中报道较多的是MHC(Bacon,et al.,2001；Lian,et al.,2010；Niikura,et al.,2007)、生长素基因、GZMA(Sarson,et al.,2008)和IRG1(Smith,et al.,2011)等基因。

人BCL11B基因能够促进T细胞的激活和增殖，促进Th细胞的分化。曾有报道在CD4⁺T淋巴细胞中，BCL11B能够控制白介素-2(IL-2)的产生，利用siRNA干扰BCL11B之后，IL-2的产生明显降低，在一定程度上影响细胞炎症反应(Cismasiu,et al.,2006)，抑制BCL11B的表达能够引起肿瘤T细胞凋亡，而对正常成熟T细胞不会产生影响(Grabarczyk,et al.,2007)。

对于基因功能验证的研究，常用的方法主要有过表达、RNA干扰和以ZFNs、TALEN和CRISPR/Cas9为主的基因敲除等。过表达由于不能充分反映基因产物的真实表达情况，在实验中使用日渐减少。以ZFNs、TALEN和CRISPR/Cas9为主的基因敲除虽然效果最为显著，但是方法系统的建立需要较长的周期，而长的载体在转染细胞，尤其是原代细胞时存在困难，技术水平要求较高。现如今普遍使用的方法就是RNA干扰(RNAi)，该技术主要是利用20-25nt短的siRNA序列与基因的某段序列能够完全互补配对，激活RNA干扰通路，从而抑制基因的表达。

BCL11B基因在鸡上尚未有报道，其在马立克氏病肿瘤转化过程中的作用机制也没有相关研究报道

技术实现要素：

本发明的目的是提出一种siRNA及其应用，具体技术方案如下：

一种siRNA为双链，其抑制鸡BCL11B基因表达，所述siRNA序列为：

正义链5'GGGACAGUCAAUGGAAGAA 3’

反义链5’UUCUUCCAUUGACUGUCCC 3’。

所述的siRNA在鸡马立克氏病作用机制研究中的应用。

所述的siRNA在制备预防或治疗鸡T细胞恶性淋巴瘤药物中的应用。

所述的siRNA在制备治疗鸡马立克氏病药物中的应用。

本发明的有益效果为：

1、利用本发明提供的siRNA干扰鸡BCL11B基因，转录水平上的干扰效率能达到91％，干扰效率极高、特异性好；与基因敲除技术相比灵敏度高、操作简便、实验周期短、价格低廉；为研究BCL11B基因在马立克氏病以及其他禽病中的作用机制提供直接有效的实验工具，对进一步揭示该基因在机体免疫机制中的作用具有一定的指导意义。

2、本发明的siRNA能够显著抑制MSB1肿瘤细胞迁移，对肿瘤细胞具有一定的治疗作用，同时抑制马立克氏病肿瘤转化状态的细胞发生迁移，抑制肿瘤细胞扩散，从而抑制肿瘤的发展，故本发明siRNA可以用来制备预防或治疗鸡T细胞恶性淋巴瘤药物及制备治疗鸡马立克氏病药物。

附图说明

图1为FAM标记的siRNA转染效率示意图，其中a)暗场观察到的视野，b)明场观察到的视野。

图2为实时荧光定量PCR方法确定siRNA干扰效率，干扰效率为91％(P<0.01)。

图3为MSB1细胞转染后增殖情况。

图4为MSB1细胞转染后细胞凋亡相关酶活性，a转染后caspase 3酶活性，b转染后caspase6酶活性。

图5为MSB1细胞转染后细胞周期图，a流式细胞仪分析细胞周期示意图，b处于不同时期的细胞分布直方图。

图6为MSB1细胞转染后细胞迁移图，a显微镜下观察到的迁移细胞，b迁移细胞数统计直方图。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，无特殊说明，均为常规生化试剂公司购买得到。

PowerGreen PCR Master Mix购自Thermo fisher。

实施例1：siRNA序列设计

在我们实验室前期关于感染MDV肿瘤化脾脏与肝脏中差异表达的miRNA研究中，发现其中一个miRNA的靶基因BCL11B，而该基因可以参与马立克氏病肿瘤转化过程。BCL11B(B-cell chronic lymphocytic leukemia/lymphoma 11B)，B细胞慢性淋巴白血病/淋巴瘤11B，编码Krüppel样C2H2锌指蛋白作为转录因子，促进T细胞的增殖和分化，参与淋巴造血，与造血系统恶性肿瘤的发生有极其重要的关系。

根据生物信息学方法在genebank获取BCL11B基因序列(XM_004941932.2)，如SEQ ID NO.1所示，根据siRNA序列设计原则，利用BLOCK-iT^TMRNAi Designer(https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/design.do)和siRNA Wizard v3.1(http://www.invivogen.com/sirnawizard/siRNA.php)等siRNA在线设计软件设计siRNA，对选择的靶序列进行同源分析，排除siRNA非特异性地抑制其他基因片段的可能，最终选取两个软件设计的siRNA重合或位置相近的siRNA序列。BCL11B基因位于鸡5号染色体，共有4个外显子，有4个不同的转录本，其中两个转录本缺失第3个外显子。前3个外显子较短，第4个外显子最长。本发明提供的siRNA序列的靶序列位于基因的第4个外显子区域。

本发明的siRNA序列为：

正义链5'GGGACAGUCAAUGGAAGAA 3’

反义链5’UUCUUCCAUUGACUGUCCC 3’。

实施例2：siRNA干扰后BCL11B mRNA表达量检测

1、将siRNA、siRNA阴性对照(NC)转染对数生长期、生长状态良好的马立克氏病成淋巴细胞样细胞系MDCC-MSB1，转染试剂为罗氏X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent，利用FAM标记的siRNA进行转染效率的评估，转染试剂与siRNA的转染比例为5:1(μL/μg)。

siRNA阴性对照(NC)：正义链为5'UUCUCCGAACGUGUCACGU3’，反义链为5'ACGUGACACGUUCGGAGAA3’。

根据罗氏公司X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent转染试剂的使用说明书进行转染，转染的步骤如下：

(1)转染当天，常规培养的MSB1细胞换液后，按照大约5×10⁵个细胞/孔(2mL)的浓度接种于6孔细胞培养板中；

(2)用无血清Opti-MEM培养基稀释10μL的X-tremeGENE siRNA转染试剂至100μL；

(3)用无血清Opti-MEM培养基稀释2μg siRNA或2μg siRNA NC至100μL；

(4)将步骤(2)中稀释的siRNA转染试剂和siRNA或siRNA NC混合在一起，室温孵育15-20min；

(5)将转染混合物加到步骤(1)细胞中，siRNA和siRNA NC各3个复孔，将细胞放在培养箱中，实验组和阴性对照组如表1。

在荧光显微镜下观察，通过荧光判断转染效率，转染效率可达到70％，结果见附图1。

表1实验组和阴性对照组

2、转染48h后收集不同转染组的细胞，用PBS洗涤一次，2000rpm离心后，弃上清。然后用Trizol方法提取细胞总RNA，并保存于-80℃，用于cDNA的合成。Trizol方法提取总RNA的步骤如下：

(1)将收集的细胞转移至装有Trizol的离心管中，剧烈振荡，使细胞尽可能溶于Trizol，至溶液澄清，室温15-30℃放置10min以上，以提高RNA得率；

(2)分相：在装有裂解物的离心管中加入0.2mL的氯仿，充分振荡混匀15s，于4℃，12000rmp离心10min；

(3)沉淀：将上清液转移到已加入等体积的异丙醇离心管中，轻轻颠倒离心管充分混匀，室温15-30℃放置10min，于4℃，12000rmp离心10min，RNA沉淀将在离心底的侧面形成；

(4)清洗：小心地弃去上清，在含RNA沉淀的离心管中加入1ml的75％乙醇，振荡清洗，于4℃8000rmp离心5min，弃上清液，用移液枪小心吸弃残留液，注意不要吸弃RNA沉淀，干燥5min；

(5)溶解：加入适量0.01％DEPC水使RNA沉淀溶解，测得RNA浓度大约为500ng/μL。

通过电泳验证提取RNA的完整性，确保RNA未发生降解。

3、利用2中提取的总RNA反转录cDNA，反转录的cDNA保存于-20℃备用。

cDNA合成体系(20μL)：

4、通过实时荧光定量PCR方法确定siRNA的干扰效率

以3中反转录的cDNA为模板，通过实时荧光定量PCR的方法确定siRNA的干扰效率。

实时荧光定量PCR反应体系(15μL)：

其中，

上游引物序列为：5’-CGTCGCAAGCAGGGAAAC-3’，

下游引物序列为：5’-CCCAGCGGGAAGTTCATC-3’。

实时荧光定量反应程序：

分析数据，计算siRNA干扰效率，通过t检验计算显著性。结果如附图2所示，干扰效率为91％(P<0.01)。

实施例3：siRNA干扰BCL11B的下游实验

一、细胞增殖检测

在96孔板中接种95μL MSB1细胞悬液(2-5×10⁴个/孔)，进行转染(步骤参照实施例2)；转染24h、36h、48h、60h和72h后，每孔加入10μLCCK-8溶液；用加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照；在细胞培养箱内继续孵育2h；在450nm测定吸光度。

检测结果如图3所示，在转染后24h、36h、48h、60h和72h，siRNA转染组与siRNA NC转染组相比细胞吸光度都有显著降低，说明该siRNA能够显著抑制MSB1肿瘤细胞的增殖。MSB1细胞是从人工感染I型马立克氏病病毒(MDV)的BC-1株患鸡的脾淋巴瘤建立起来的T细胞恶性淋巴瘤细胞系，细胞中含有MDV基因组，该细胞系同时可以作为体外研究马立克氏病肿瘤转化状态的一种细胞模型。本发明siRNA能够显著抑制MSB1肿瘤细胞的增殖，对肿瘤细胞有一定的治疗作用，对马立克氏病肿瘤转化状态的细胞具有抑制作用，从而抑制肿瘤的进一步发展。

二、细胞凋亡检测

1、测定pNA标准曲线

(1)标准品稀释液的配制：按照每0.9mL检测缓冲液加入0.1mL裂解液的比例配制适量的标准品稀释液；

(2)把试剂盒提供的pNA(10mM)用标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100和200μM，作为标准品；

(3)每个浓度取100μL用酶标仪进行检测，或取适当量用容量不超过100μL的分光光度检测杯进行检测，测定A405；

(4)每一个标准品的A405减去不含pNA的空白对照的A405计算出实际因pNA而导致的吸光度，并制作出pNA浓度相对于A405的标准曲线。

2、样品的收集

(1)转染当天，常规培养的MSB1细胞换液后，按照大约5×10⁵个细胞/孔(2mL)的浓度接种于6孔细胞培养板中，进行转染(步骤参照实施例2)；

(2)600g 4℃离心5min收集细胞，小心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤一次，同前吸尽上清后，按照每200万细胞加入100μL裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15min；

(3)4℃16,000-20,000g离心10-15min；

(4)把上清转移到冰浴预冷的离心管中。

3、Caspase酶活性的检测

(1)取出适量的Ac-DEVD-pNA(2mM)(检测caspase3)和Ac-VEID-pNA(2mM)(检测caspase6)，置于冰浴上备用；

(2)如表2设置反应体系：

表2反应体系

(3)加入Ac-VEID-pNA(2mM)后混匀，注意避免混匀时产生气泡，37℃孵育60-120min，发现颜色变化比较明显时即可测定A405；如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间，甚至可以孵育过夜；

(4)样品的A405扣除空白对照的A405，即为样品中caspase 6催化产生的pNA产生的吸光度；通过同步骤(1)中获得的标准曲线的对比就可以计算出样品中催化产生了多少量的pNA；

(5)用Bradford法检测待测样品中的蛋白浓度，计算出一个样品单位重量蛋白中所含的caspase 6的酶活力单位。

检测结果如图4所示，转染48h后，siRNA转染组caspase 3和caspase 6的活性与siRNA NC组相比有显著升高，而这两个酶能够加速细胞凋亡，所以该siRNA转染后能够显著增强MSB1肿瘤细胞凋亡。该siRNA能够显著加速MSB1肿瘤细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞进一步增殖，对肿瘤细胞具有一定的治疗作用，同时能够使马立克氏病肿瘤转化状态的细胞迅速凋亡，抑制肿瘤的发展。

三、细胞周期检测

转染当天，常规培养的MSB1细胞换液后，按照大约5×10⁵个细胞/孔(2mL)的浓度接种于6孔细胞培养板中，进行转染(步骤参照实施例2)；转染48h后收集细胞，加入70％乙醇4℃固定20min，2000-3000rpm离心5min；用PBS将细胞洗涤2-3遍，将细胞重悬于300μLPBS中，加入RNase A(20μg/ml)在37℃孵育30min；加入PI(50μg/mL)染色30min，直接用流式细胞仪分析。

检测结果如图5所示，转染48h后，siRNA转染组与siRNA NC转染组相比细胞周期没有明显变化，说明该siRNA转染不影响MSB1细胞周期，进一步说明该siRNA是通过介导肿瘤细胞凋亡实现抑制细胞增殖，而不是影响细胞周期。

四、细胞迁移检测

转染当天，常规培养的MSB-1细胞换液后，按照大约5×10⁵个细胞/孔(2mL)的浓度接种于6孔细胞培养板中，进行转染(步骤参照实施例2)；所有细胞培养试剂和Transwell chamber放在37℃温育；在转染48h后，细胞培养至对数生长期，离心收集细胞，用PBS和无血清培养基先后洗涤一次，用无血清培养基悬浮细胞，计数；在下室(即24孔板底部)加入600－800μL含20％血清的培养基，上室加入100－150μL细胞悬液，每孔5×10⁴个细胞，继续在孵箱培养24-36h；用镊子小心取出chamber，显微镜观察下层细胞培养液，统计下层细胞培养液中的细胞数量，计算结果。

检测结果如图6所示，siRNA转染组与siRNA NC转染组相比，MSB1细胞迁移数显著减少。该siRNA能够显著抑制MSB1肿瘤细胞迁移，对肿瘤细胞具有一定的治疗作用，同时抑制马立克氏病肿瘤转化状态的细胞发生迁移，抑制肿瘤细胞扩散，从而抑制肿瘤的发展。

MSB1细胞是从人工感染I型马立克氏病病毒(MDV)的BC-1株患鸡的脾淋巴瘤建立起来的T细胞恶性淋巴瘤细胞系，细胞中含有MDV基因组，该细胞系作为体外研究马立克氏病肿瘤转化状态的一种细胞模型。上述细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期及细胞迁移检测试验结果表明：本发明siRNA能够显著抑制MSB1肿瘤细胞的增殖，显著增强MSB1肿瘤细胞凋亡，显著抑制MSB1肿瘤细胞迁移，同时抑制马立克氏病肿瘤转化状态的细胞增殖和细胞迁移，使马立克氏病肿瘤转化状态的细胞迅速凋亡。本发明的siRNA可以用来制备预防或治疗鸡T细胞恶性淋巴瘤药物及制备治疗鸡马立克氏病药物。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 一种siRNA及其应用

<130> 2017

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 6223

<212> DNA

<213> 鸡（Gallus gallus）

<400> 1

aaatgctctt tgcttcgctc ccagcgctcc gcgtacccga gaaagcggca gcagcgcaca 60

aagcccggag ctgctcccga tccgtgcatg tgctttagtt tgtgtctgtg tgtgtgtgtg 120

tatgtgtgtg tgtgtgtgag tgagtgcggt gtgtgcgagt ggcgtttctt gttctcttgc 180

agggtacaat gttaaaaagc caccgctagt cgcccccagt gctcctactc tctgggtctt 240

tttgtctcta gtgcagatta aacgtcacgt ccgcacttga acttgaattt tatcccattg 300

tacagaggca gccccagcca tagagagaca gagcgctccc agagaaccag gactccgcca 360

tcttcacatt gcaatatata atagtaatag ccagcaccag cccagctgca ctgggggctt 420

ccttccttcc agtcccagcg ccaggcgagg ggggaagagt gcaaagtggt gcaggagcac 480

gggcaatcct aaagcaccag ggcagagcag tgccacttga actgggaaag aggagacaca 540

gttttggctg ccccttttca aacaaattct ctctagatat ctacccagca agggtcaatc 600

tctgagaaac agtttttggt gttttttttt tttttttttt ttttggcaat tttttgactg 660

tgtgggcaaa tcccaatttc agtacttttt tttttttaaa ttctttttta ttcctgtttt 720

ttttttttgc tttttatttt ttttttaatt tttatttttt aaccctcctg gtggaaaagc 780

gcacttgcca atttgccaag cactctggaa agaggggaaa gagaaaagtg tactggcggt 840

gcacatcctc ccaagttcaa gaagaggttt ggaagtccga gtgccagtgg agaagcagtg 900

gagaaaagac agagtgtgaa agagaaaaaa aaagagcgag agagcttttc ccgatgatga 960

tgatgatgat ttttaattga aaggagatcc catccggtgc accacagcag cagcaaaagg 1020

tgtttgtttg tttttttttt taattttctt tttatttttt tttaattttt tttttttgaa 1080

agaagaagaa ctcgatcaag aagaagaaga agaaaagacg caaaaaaagc agaggaggag 1140

gaccggcccc caacgcagcc cccagaccag tgcagctctc caggcgatgc cagtgtaaat 1200

gccagggcaa tgtcccgtcg caagcaggga aacccgcagc acttgtcaca aagagagatt 1260

atcacacagg ctgaccatgt ggaaccggca ctcgccgacg aggatgagag cctggcaata 1320

gcagagccgg gtggcatcag catcgctgca ggtgggacag accccgactt gttaacctgt 1380

ggacagtgtc agatgaactt cccgctggga gacatcttgg tttttataga gcacaagaga 1440

aaacagtgca atggcactgg tggtgtctgc tatgaaaaga gcatggataa gagcagccct 1500

cccccctcct cacgcgccga gctcaggaaa gtgtcagagc cagtggaaat cgggatccaa 1560

gtcacacccg atgaagaaga ccgtcttctc acgcctacaa aaggaatttg ccccaagcag 1620

gagaacattg cagggccgtc caggcctgca aacctgccgg gggctcccct agctgcctcc 1680

tcccaccctc acacatccgt catcacgtca cctctccgcg cactggcctc tctcccgccc 1740

tgccttagcc tgccctgctg tggtgcacgt gcagtctcag ttggcgggac tcagactgag 1800

attcagactg agacgtcagg tacatttgga tgtcattgtc agttgtcagg taaagatgag 1860

ccttcaagct atatttgcac aacatgcaag cagcctttta atagcgcttg gttcttgctt 1920

cagcatgccc agaacacaca tggattccgc atctacctgg aaacaagccc ttccaacagt 1980

tcccttactc cacgcatcac catccctcct cctctgggac cagagactgt tgcacagtcc 2040

ccgctgatga atttccttgg agacaacaac ccttttaatc ttctgcggat gacaggaccc 2100

attttgcgtg aacatcctgg ctttggtgag ggtcggctcc caaacacgcc tccactattc 2160

agcccaccac ctcgtcatca tctggatcca catcgcctta gtgccgaaga aatggggtta 2220

gttgcccagc atcccagtgc ctttgacaga gttatgcgtt taaaccccat ggcaattgag 2280

tccccagcga tggatttctc cagaaggctt cgagagctgg caggaaacag ttccacccct 2340

ccgccagtct cgcccagtcg caccaaccct atgcatcgcc tgttgaatcc tttccagccg 2400

agtcctaaat cacctttttt gagcacccca ccactgcccc ccatgccccc aagcagcact 2460

acgcctcccc agcctcaggc caagagtaag tcctgcgaat tctgtgggaa aaccttcaag 2520

ttccagagca accttatcgt ccaccggcgt agtcacacag gagaaaagcc ctacaaatgt 2580

cagctatgtg accatgcttg ctcccaggcc agcaagctaa agcgtcacat gaaaacgcat 2640

atgcataaag ctggctccat gacaggcagg tcagacgatg gactgtccac cacgagttct 2700

cctgagccag gcacgagcga gctcactgga gagggactga aatccagtga gacagacttc 2760

aggaatgaga gcgatccctc cctgggccat gacaatgaag aagaggaaga ggaggaggag 2820

gaagaagaag agttggaaaa tgagagcagg ccagagtcaa gctttagtat ggactcagag 2880

ctgagtcgta accgagaaaa cggctccaaa tcactgccag atgagaaatc ccttgtcctg 2940

ggaaaagtga tagagaatgt aagtctcggt gccatccagc aatacaatga catgctagct 3000

gagaaacaga agaggagtag cttcatgaaa aggtcttctg accaacgaga cctgtgtccc 3060

cgagacctgt gcccgagaga cacaggtgat gaagactcag tggtaggaga gctggaccgc 3120

accgaggagg ggacagtcaa tggaagaaac tttggcccag gcgagccctt cccaaacttg 3180

ttccctcgga agccaacacc tatcacaagc cccagcttaa ataactcatc taaacgaata 3240

aaagttgaga aagatttgga cttgccacca gcaacaataa taccttccga aaatgtttac 3300

tcccagtggc tggtagggta cgcggcatca aggcacttca tgaaggatcc gtttctagga 3360

ttcacagact cccgacaatc tcccttcgcc acctcttccg agcattcgtc ggagaatggg 3420

agcctgcgtt tctccacccc gccgggggac atgctggatg gggggctctc agggcgcagc 3480

ggcacggcct ccggaggcag caccccccac atcagcggcc caggccctgg gcgacccagc 3540

tcgaaggaag ggcgcaggag cgatacatgt gagtactgtg gcaaggtctt taagaactgc 3600

agcaatttga cggtgcaccg tcggagccac actggagagc ggccttacaa atgcgagctc 3660

tgcaactatg catgtgccca gagcagtaag ctgacgcgtc acatgaaaac gcatggccag 3720

atagggaagg aggtctaccg ctgcgacatt tgccagatgc ccttcagtgt ttacagcacc 3780

ctggagaaac acatgaaaaa gtggcatgga gaacatttgc tgacaaatga cgtcaaaatt 3840

gagcaggcag aaagaagcta aggcccccct cccctccccc gctaggttaa atttcagggg 3900

tctaggtaac attttatttg tacagtttta actattgcca actgagaaaa gatgacctaa 3960

cttgcctccg taaacattac ttagcataac catggtaggt gccagacttt ggcacttaaa 4020

tataacctgt gtctacaaag ttctattaaa cccgagggtt gattaaggca gtaaaaattg 4080

tggagccttt taactgtgca ataatttctg tatttattgg gtttttgtaa ttttttggca 4140

tgtgcaggta ctttttttta ttctttctgt ttaaatttct tttaaatttt gttgggtatc 4200

cctttttaat tttacccagt tgtagcctga gattacttgc attgtagggg agaaacatat 4260

ctttttaaat tataattttt gggccgctgc tttgttgaaa tttaagctaa gcatgtgtaa 4320

tttcttgtga agaagccagc attttaacag atctttcttt ctttcacccc tcctccccct 4380

tctttttcct ttcctctttt taaataaccc tgaagattag ggaaaacaaa attgtacagc 4440

ggataacaat ctttaaaatt agcactttct tttggaattg gatggaatat gtagcactga 4500

caatgtcgct aatgatagag gccttttcta gatggatttc aacattaaat tcacatcaac 4560

taaaaagtca taggtgcaaa aggcagctac attcaaaaga cagtaacatt cttaattgtg 4620

cattattact ggatagtttc ttcttgctat taaagctatg gcaacagaat agtgccacat 4680

tgtcactttt ggaggtcttt ccctccctct tcccttcctg ccactcttcc cagagacaat 4740

aaaagtacat ctcaagtatt gtaaccttct ttacaaacct cagaggagcc aattttttca 4800

ttttaaacct cataaacaca aagctgagtc taagatgtct gtgcgtgcct ctcctttagt 4860

ccaaatttgc tgtagttaaa agaatttcta gaggatgggc aagtggcaat ttctcaatga 4920

aaagacttga ctcatagtct tttggtttat gaatggaaat atcagaacta tcttatatga 4980

tgtacaatag tgctatgcta ttataaggaa ggaaaaaata aattctagtc catctacttg 5040

tcttggcaag attctgctcc tactgaagtc ggttagaatt ttcccattaa cttaattagg 5100

aacggaaatt aattgtattt tgaaaaaagc attacaacag aaaaaaagta aagaacagaa 5160

aaacgcacct gctctacttt caaatttcca atttttttca aagctcatta tgcctaatat 5220

taacaaacag tggacaatta tggttagaga ttttaattat gttgacccgc actttaaagc 5280

ttttgtttgt ggttaagaca aaaatggctt ctcaacaaga aattacgtca tattcttcta 5340

tttggcccaa aggtgggtta aactgtaagg gaacagctga gattaagtgt cagtgttgct 5400

aagcatggca ttcacaatac tggcactata aagaaaaata aataaaaata atttattgga 5460

cagtttttct actgccattc aatttgacgt gagtgccttg aaaactgatc ttcctatttg 5520

agtctcttga gacaaatgca aaatgttttt gtgaaatgaa aagactttaa aaaaaaaaaa 5580

gtaaaacaag aaaagtacat tctttagaaa aaaaagagcc acatttactt aaaaaaaaaa 5640

attactggtt gaagatagcg gacatgaaaa tgccataaga cccaatcaaa tgaagatgta 5700

tacccagcac aacttcggac atccattagc tgaattattc tcagcttttt ttttttttca 5760

ggacaacgct gcttaggaaa tggaatggaa atgatttact gctgaattaa aactcaaatg 5820

acacaaatta caagttgtta tcattgaatg agaaaaaaca attcaggaac aacggctaat 5880

tttttttaaa agttaaattt agtgcactct gtcttaaaat acgtttacag tattgaatac 5940

atacaagggt aaaaaaaaaa ttgtgtgtat gtgtgtttga gcaatctttt ttttttcaaa 6000

gtttgcttaa taggttatta aaaaaaaatg ccataatggc catgtgtata ttgttttctt 6060

ttggtgacgg ggttttagta tatattatat atattaaaat ttcttgatta ctgtaaaagt 6120

ggaccagtat ttgtaataat ggagaatgcc tgggcatttt acaaaaccag aaagaaaaaa 6180

aaaaaaaaaa aaaaaacctt ttcttttttc cttgaaaatg ttg 6223