本发明涉及一种产菊粉酶、酶解菊芋和酿酒酵母发酵三耦合制备乙醇的方法，属于生物质水解、发酵领域。
背景技术：
目前生物质燃料存在的问题主要为生产成本高导致的市场竞争力不强[1]，仅靠政府的扶持是不能使我国的能源重心从价格较低的石化和煤炭能源上移至目前生产成本较高的生物制乙醇上来的，在生物质乙醇的生产中，糖源成本和乙醇的分离成本是关键。
近年来对于菊芋水解的研究仍主要集中在新菌株的筛选和水解条件的优化上，二者的目的都是为了减少水解过程的酶耗成本，因为商业菊粉酶价格高昂，并不适用于工业生产[2]。但即使获得了高产酶活力的菌株，其培养产酶周期仍然很长，至少在72h以上，若要获得更高的酶活，酵母需要在培养液里培养100h以上。粗酶液需要在4℃的低温下才能长期保持活力，大量的液体培养基占用可观的制冷空间，也是能耗。如果对菊粉酶进行提取和纯化，其步骤复杂，又耗时耗力。水解条件的优化可以提高菊粉的水解效率，但是价格高昂的菊粉酶仍然不能够回收再利用，酶耗成本的下降空间并不大。虽然已有学者进行了菊粉酶固载的探讨，但仍处在初期研究阶段。
通过将产酶和水解过程进行耦合后仍然存在由于产物糖抑制导致的菊芋水解后期速率减缓和水解不彻底的问题。通常产物抑制的解决方法有二：一是将产物及时分离出来，打破反应平衡，推动反应继续进行，但对于本研究体系此方法极难实现，体系中同时存在着还原糖、低聚果糖、菊粉及其他菊芋组分，包括大量的植物纤维，这使得单纯的分离出水解产生的还原糖极其困难；另一种方法是将产物通过后续反应消耗掉，降低体系中产物浓度，减少产物抑制强度，促使反应继续进行。
已有部分研究者采用同步糖化发酵法(ssf)，将多聚糖水解产生的还原糖进行实时发酵消耗。具体的实施方法可大致分为两类：一类是在体系中同时加入水解酶和酿酒酵母，使得水解产生的还原糖即刻发酵产醇。但是此方法需要克服水解和发酵所需的不同条件，酶解的最佳温度往往要高于酿酒酵母适宜的发酵温度，若迁就水解的条件则酿酒酵母会由于高温导致失活；若是迁就发酵的温度，则会导致水解速率低，使得没有足够的还原糖生产出来供给产醇。再有，发酵所产生的乙醇对菊粉酶有一定的毒害作用，会导致菊粉酶失活，这就要求在反应初期添加足够量的菊粉酶，增加了酶耗成本。另一类是对酿酒酵母进行基因重组，植入可分泌菊粉酶的基因。因为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，所以在发酵工程中酿酒酵母(s.cerevisiae)作为模式真核生物而被用作表达外源蛋白的优良“工程菌”。然而，酵母的代谢产酶过程是好氧过程，体系中有足够含量的氧存在是酵母产酶的必须条件，恰恰相反，发酵产醇是一个厌氧过程，氧气的存在不利于糖向醇的转化。现有技术常采用改变曝气强度的方式来进行对两种反应最适条件的协调，但是曝气程度并不好控制，且往往此种重组菌株的产酶能力较弱，或产醇能力不高。
综上所述，虽然已有不少研究者采用同步糖化发酵工艺对菊芋的产醇工艺进行了优化，但在生产过程中会出现由于乙醇浓度升高导致的菊粉酶失活现象或由于非适宜培养条件导致的微生物代谢能力减弱问题。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决现有技术存在由于酶水解产物糖浓度升高抑制菊粉酶活性下降现象以及分步产酶、酶水解和发酵产乙醇的周期长问题，提供一种产菊粉酶、酶解菊芋和酿酒酵母发酵三耦合制备乙醇的方法。
本发明的目的是通过下述技术方案实现的。
一种实现快速菊芋酶解的方法，将酵母直接接种至菊芋料液中，得到混合溶液，本方法将产酶和水解环节耦合，能够实现快速菊芋酶解。
所述混合溶液中的水解液或料渣作为种子植入新一批次的菊芋料液中进行第二批次产酶水解耦合；重复此过程，即再取第二批次的水解液/料渣做为种子植入下一批次的菊芋料液中进行第三批次的耦合过程，实现连续接种的多批次产酶水解耦合工艺。
所述酵母为该酵母发酵后产生的酶能够对菊芋进行水解的酵母；
所述酵母包括克鲁维酵母；
所述菊芋料液的制备方法为将菊芋粉末溶解在水中。
当酵母处于对数成长期的，取混合溶液中的固态物质(料渣)直接接种至新的待水解的菊芋料液中，即可继续对菊芋进行水解。
所述对数成长期为酵母接种至菊芋料液中12-28h时。
固态物质的最佳接种量为1％-10％(v/v)。
菊芋料液中菊芋粉的质量浓度为5％～40％。
一种产菊粉酶、酶解菊芋和酿酒酵母发酵三耦合制备乙醇的方法，产酶、酶解、发酵三耦合工艺(ssf)：将酵母直接接种至菊芋料液中，实现产酶水解耦合，得到料液；在产酶水解耦合工艺进行一段时间后，将料液移入发酵罐，再向发酵罐中加入复水活化后的酿酒酵母。
耦合发酵开启时间为8-20h。
有益效果
菊芋酶解耦合酿酒酵母发酵制备乙醇的方法，采用分步糖化发酵法(shf)和产酶-水解-发酵“三耦合工艺”以菊芋为原料制得了生物质乙醇。对于10wt％、15wt％、20wt％的菊芋料液，当采用shf工艺生产乙醇时，菊芋的水解率分别为92％、89.5％、89.2％，而三耦合体系中菊芋的水解率分别提高至92.3％、91.6％、94.1％；shf体系中乙醇的质量分数分别达到了3.6wt％、5.3wt％、6.8wt％，为理论值的84％、81％、78％，在采用了三耦合工艺后，乙醇产量分别提高至理论值的87％、85％、81.6％。shf生产周期为60h，而三耦合工艺的生产周期缩短至50h。结果表明，包含产酶过程的三耦合工艺不断有新酶产生，可以改善因发酵产物乙醇对菊粉酶抑制作用引起的水解率下降，缩短乙醇的生产周期。
附图说明
图1为菊芋酶解的cbp过程；
图2为不同浓度菊芋水解液的发酵曲线，菊芋浓度：10wt％(a)，15wt％(b)，20wt％(c)；
图3为菊芋浓度对三耦合工艺产醇的影响，开启时间：10h(a)，14h(b)，18h(c)；
图4为不同浓度菊芋的耦合发酵开启时间对产醇的影响；菊芋浓度分别为10wt％(a)，15wt％(b)，20wt％(c)。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
酿酒酵母的复水活化：将干酵母置于10倍以上的2wt％葡萄糖水溶液中(此葡萄糖水溶液需进行高温高压灭菌并冷却，即置于高温蒸汽灭菌锅中在121℃下灭菌20min，然后冷却至室温)在36～38℃下复水15～20分钟，再置于34℃以下活化1h，然后以5‰(w/w)的比例添加到发酵体系中进行发酵。
分步糖化发酵(shf)：将产酶水解耦合工艺的水解料液灭菌后移入自制发酵罐中，再加入5‰(w/w)的酿酒酵母，在40℃下进行发酵，每隔一定时间取样，离心后测定上清液的还原糖，总糖及乙醇浓度，离心条件为8000rpm，5min。
同步糖化发酵，即酶解耦合发酵工艺(ssf)：将克鲁维酵母直接接种至菊芋料液中，实现产酶水解耦合，得到料液；在产酶水解耦合工艺进行到10h、14h以及18h后，将料液移入发酵罐，以5‰(w/w)的比例加入复水活化后的酿酒酵母，在40℃下进行发酵，每隔一定时间取样，离心后测定上清液的还原糖，总糖及乙醇浓度，离心条件为8000rpm，5min。
在酿酒酵母加入菊芋水解液后，水解液中的糖分被酵母吸附并渗入细胞内，经过酵母细胞内各种酶的作用快速发酵，产生乙醇、co2和能量，能量的一部分被酿酒酵母用作细胞新陈代谢的能源，余下的部分和乙醇及co2一起通过细胞膜排出细胞外。生成的乙醇和co2会快速渗透到周围介质中，当co2在发酵液中的溶解达到饱和时，就会附着在酿酒酵母细胞的表面，直至超过细胞的吸附力。当气泡逐渐增大，产生的浮力克服了细胞重力时，气泡就带着细胞上浮，直至气泡破裂，co2被释放到发酵罐的上层气相空间，随着排气管排出发酵罐，而酿酒酵母细胞则留在发酵液中慢慢下沉。由于co2的上升，带动了发酵液中酵母细胞的移动，增加了酵母细胞与糖的接触，有助于加速糖的发酵。
三种浓度(10wt％，15wt％，20wt％)菊芋水解液的发酵曲线如图2所示。菊芋水解液发酵产醇的过程可以分为三个阶段：(1)前发酵期，当酿酒酵母刚加入菊芋水解液的时候，体系中酵母细胞的浓度不大，在经过短暂的停滞期后，酿酒酵母开始繁殖，此时发酵液中含有一定的溶解氧，营养成本也比较充分，所以酿酒细胞开始迅速繁殖，发酵作用不强。这时发酵液的表面很平静，观察不到明显的气泡产生。(2)主发酵期，经过前发酵期酿酒酵母细胞的大量繁殖，细胞密度已经较高，发酵作用增强，大量生成乙醇，co2的释放带动发酵料液上下翻动，还原糖浓度快速下降。(3)后发酵期，此时菊芋水解液中的大部分糖已经被酿酒酵母用来发酵产醇，发酵速率减慢，观察到的气泡逸出速度也很慢，产生的热量也大为减少。各浓度发酵液最终的乙醇收率及残糖见表2。
不同浓度菊芋水解液在第36h的残糖量和乙醇收率列于表2中。可以看出，体系中的残糖量随着菊芋浓度的增高而升高，但乙醇的“实际产醇/理论产醇”值随着菊芋浓度的增高而下降。这是因为虽然发酵时乙醇从酵母细胞排出后以非常快的速度渗透到周围介质中，但是随着发酵的进行，料液主体中乙醇浓度逐渐升高，最终会达到产生抑制的程度。体系中乙醇浓度越高，对发酵反应的抑制作用越强，乙醇收率越低。
表2第36h发酵体系残糖和乙醇收率
可知，shf的发酵终点选为36h，而ssf工艺的发酵终点选为50h。在这里，shf的36h只含有发酵一个步骤，而ssf的50h却包括了酵母产酶、菊芋水解、糖的发酵三个步骤。
表3shf与ssf工艺的发酵终点各项指标比较
从表3所列实验结果可以看出，通过将产酶过程耦合入发酵工艺，成功改善了产物抑制导致的水解率下降。
分别对10wt％、15wt％、20wt％的菊芋料液进行产酶水解发酵耦合操作，选取了三个时间点做为发酵的开始时间。从图3中可以看出，菊芋浓度不同，耦合开启后，还原糖变化趋势的改变有所不同，当开启时间为10h时，10wt％和15wt％料液中还原糖的增加趋势所受影响不大，而20wt％菊芋料液的还原糖浓度升高明显放缓，这是因为，浓度越高所需菊粉酶活力越高，而10h时体系中所产生的菊粉酶只能够将20wt％菊芋料液的一小部分水解，且发酵时初始还原糖浓度越高，发酵速率越快，所以20wt％的菊芋料液受耦合时间的影响最大。当开启发酵时间为14h时，由于体系中菊粉酶增加，20wt％菊芋料液在发酵同时仍然能够快速水解，而此时，10wt％菊芋料液的水解速度已经小于发酵速度，所以还原糖在开始发酵时就出现了下降的趋势。当开启时间为18h时，三种浓度的菊芋料液中还原糖在发酵开始时即开始下降，此时体系中大部分的菊芋已经水解成还原糖，发酵速率快于后期的水解速率，还原糖开始呈消耗下降趋势。
发酵的开启时间对于耦合工艺来说非常重要，若耦合发酵时间过早，大部分菊芋尚未水解成可发酵糖，体系中还原糖浓度偏低，导致发酵速度缓慢，若耦合发酵时间过晚，发酵速度并无明显提高反而导致时耗耦合过程时耗过长，与缩短反应时间意愿相悖。耦合发酵开启时间对不同浓度菊芋“三耦合”过程的影响见图4。在三个浓度下，初始的发酵速度均随着耦合发酵时间开启时间的延迟而增大。
实施例2
克鲁维酵母在纯菊芋提取物中的培养：取一环保存在yepd平板培养基上的克鲁维酵母，接种至装有100ml灭菌冷却后的2wt％菊芋提取物的250ml锥形瓶中，在30℃下振荡培养，转速为170rpm。每隔一段时间取出3ml培养液，使用紫外可见分光光度计在600nm下进行od600的测定，测定所采用的空白样为未进行克鲁维酵母培养的菊芋提取物溶液。
克鲁维酵母产酶及菊芋酶解过程的耦合(cbp)：取一环保存在yepd平板培养基上的克鲁维酵母，直接接种至装有100ml10wt％菊芋料液的250ml容器中。在30℃下振荡培养，转速为170rpm。此步称为对产酶、水解环节的第一次整合生物工艺(thefirstconsolidatedbioprocessing，cbp)。每隔一定时间取样，离心后测定上清液的还原糖，总糖，菊粉酶活力。离心条件：8000rpm，5min。
图1所示，在耦合过程的前10个小时，因为体系中菊粉酶的含量较低，无法进行准确的测定，但是从菊粉酶酶活测量曲线可以看到，克鲁维酵母在菊芋料液中培养时能够快速的产酶，并且在培养后期仍呈现出一个快速的上升趋势，在整个耦合工艺过程中，克鲁维酵母保持着良好的产酶能力，使得体系中不断有高活力的菊粉酶被生产出来，参与到水解反应中去，从体系的还原糖变化曲线也可以得到相同的结果，耦合过程中还原浓度不断增加，并维持增高趋势直至24h后达到一个稳定期，此时的菊粉水解率已达到91.2％。通过对体系中的总糖浓度进行测定，发现在耦合工艺过程中并未观察到总糖浓度的明显降低，证明克鲁维酵母并未消耗大量的还原糖。