JaspineB、3‑epi‑JaspineB氮代类似物、其制备方法及应用与流程

本发明公开了具有抗肿瘤活性的jaspineb、3-epi-jaspineb氮代类似物、它们的制备方法及其作为一类新的抗肿瘤药物先导化合物的应用，属于药物化学领域。

背景技术：

海洋生物资源丰富，种类繁多，并且海洋生态环境特殊，所以海洋中积聚了大量结构特殊并且药理活性各异的生物活性物质。随着陆生药物资源的日益匮乏以及化学药物开发的难度加大,世界各国越来越重视对海洋药物的研究开发。海绵是最原始的多细胞生物体，目前共发现约15,000种海绵，是公认的海洋天然产物与生物医学应用最多才多艺的来源。上世纪50年代，科学家从海绵cryptotethiacrypta中提取出抗肿瘤活性化合物spongothymidine和spongouridine，阿糖胞苷便是在研究spongothymidine时得到的一种衍生物(cancerres.1964,24,1285-1293)，它是世界上第一个由海洋天然产物衍生并成功上市的药物，临床上主要用于治疗各种白血病。

jaspineb是在2002年由higa等人从海绵体pachastrissasp.中分离得到的一种天然植物鞘氨醇化合物(j.nat.prod.2002,65,1505-1506.)；此后不久，debitus等人从另一种海绵体jaspiasp.中也分离得到这个化合物，并将其命名为jaspineb(tetrahedronlett.2003,44,225-228.)。多个课题组经过研究发现其在亚微摩尔级别就能够对多种癌细胞显示出良好的细胞毒活性。对于其作用机制，yahya等人(biochem.pharmacol.2009,78,477-485)研究显示jaspineb是一种优良的鞘氨醇激酶(sphk)和鞘磷脂合成酶(sms)抑制剂，能够增加神经酰胺含量，通过capase途径控制肿瘤的凋亡。fujii等人(bioorgan.med.chem.2011,19,5402-5408)的研究表明jaspineb及其非对映异构体能够抑制sphks和蛋白激酶c。

由于其显著的生物活性及结构新颖性，许多科研工作者致力于合成jaspineb及其类似物。2007年génisson等人(tetrahedron:asymmetry2007,18,857-864)以丁炔-1,4-二醇为原料合成了末端烷基链为8个碳的jaspineb类似物，并测试其对小鼠黑色素瘤细胞b16以及人皮肤黑色素瘤细胞a375的ic50为2.5μm。2011年该课题组(tetrahedron2011,67,4253-4262)又制备出上述类似物的氨基取代的衍生物以及末端苯环取代的衍生物，细胞活性实验结果显示末端氨基的修饰对化合物活性影响较大，当末端氨基上的两个活泼氢都被取代后如氨基被双烷基化的化合物在10μm时仍没有细胞毒活性。该课题组还合成出一种含氮丙啶环衍生物，经测定该化合物没有细胞毒活性。

细胞存活和细胞死亡与自噬密切相关(nature,2011,451(7182),1069-75)，自噬是指一些需要降解的蛋白质和细胞器等包浆成分被包裹，并最终运送至溶酶体降解的过程。自噬分为三种类型，即分子伴侣介导的自噬，微自噬和巨自噬，其主要与其各自的生理功能和它们递送到溶酶体的方式有关(cell,2008,132(1),27-42)。许多数据表明，自噬对各种癌细胞具有良好的抑制作用，自噬是由各种原因引起的，如缺氧(j.pathol.2012,227(3),325-335)，内质网应激(j.biol.chem.2006,281(40):30299-302304)，饥饿或与炎症(autophagy,2015,12(2),245)，癌症和衰老有关的毒素(nature,2016,529(7584),37-42)。自噬是细胞内膜发生剧烈变化的动态过程，当自噬诱导的信号启动时，细胞在细胞质中的某个地方形成小的脂质体样膜，然后膨胀，称为吞噬泡。吞噬泡与需降解的胞浆成分集结在一起，然后延伸并包裹封闭胞浆成分形成一个双层膜的结构，即自噬体。自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，在此期间，自噬体包裹的包浆成分被溶酶体酶降解，产物被转运到细胞质(science,2000,290(5497),1717-1721)。

研究表明，jaspineb能够诱导细胞发生自噬，为此，对此类化合物进行修饰，提高其抗肿瘤活性，有利于新一类药物的开发应用。

技术实现要素：

基于上述，本发明目的之一是提供一类新的具有抗肿瘤活性的jaspineb、3-epi-jaspineb氮代类似物；目的之二是提供该类化合物的制备方法；目的之三是提供该类化合物在制备抗肿瘤药物方面的应用。

本发明所述的jaspineb、3-epi-jaspineb氮代类似物具有以下结构通式：

其中n为6、7、8、9、10、11、13。

制备jaspineb氮代类似物3a-3g的方法通过以下步骤实现：(1)在溶剂中将化合物1与长链伯胺发生还原胺化反应得到化合物2a-2g，所用到的还原剂为nabh(oac)3或nabh4，所选用的溶剂为1,2-二氯乙烷或甲醇；(2)溶剂中，将化合物2a-2g在酸的作用下以及催化剂的作用下合成化合物3a-3g；所述溶剂选自甲醇，乙醇，乙酸乙酯；酸选用盐酸或三氟乙酸，催化剂选择pd/c或pd(oh)2；

其中n为6、7、8、9、10、11、13；

所选用的长链伯胺为正庚胺、正辛胺、正壬胺、正癸胺、十一胺、十二胺或十四胺。

制备3-epi-jaspineb氮代类似物3'a-3'g的方法通过以下步骤实现：(1)在溶剂中将化合物1′与长链伯胺发生还原胺化反应得到化合物2′a-2′g，所用到的还原剂为nabh(oac)3或nabh4，所选用的溶剂为1,2-二氯乙烷或甲醇；(2)溶剂中，将化合物2′a-2′g在酸的作用下以及催化剂的作用下合成化合物3′a-3′g；所述溶剂选自甲醇，乙醇，乙酸乙酯；酸选用盐酸或三氟乙酸，催化剂选择pd/c或pd(oh)2；

其中n为6、7、8、9、10、11、13；

所选用的长链伯胺为正庚胺、正辛胺、正壬胺、正癸胺、十一胺、十二胺或十四胺。

本发明所述的jaspineb、3-epi-jaspineb氮代类似物3a-3g、3'a-3'g能通过降低线粒体膜电位和提高自噬相关蛋白的表达引起细胞自噬进而导致细胞死亡，对肺癌细胞(a549)、小鼠黑色素瘤细胞(b16-f10)、乳腺癌细胞(mcf-7)或前列腺癌细胞(pc-3)表现出了抗肿瘤活性，尤其对乳腺癌细胞(mcf-7)和前列腺癌细胞(pc-3)有很明显的抑制作用，特别是化合物3f对前列腺癌细胞pc-3有明显的抑制作用。与抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶做对比，化合物3g对乳腺癌细胞(mcf-7)的抗肿瘤活性优于后者。因此，本发明合成的jaspineb、3-epi-jaspineb氮代类似物以其具有较好的抗肿瘤活性，原料简单易得，合成方法简单可行，收率较高，总收率达80％以上，为新型抗肿瘤药物的开发提供了一条新型途径。

附图说明

图1为本发明化合物3g细胞存活率的实验结果。

图2为本发明化合物3g自噬标志蛋白表达的实验结果。

图3为本发明化合物3g流式细胞仪检测细胞凋亡的实验结果。

图4为本发明化合物3g流式细胞仪检测线粒体膜电位的实验结果。

图5为本发明化合物3g免疫荧光的实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。

合成化合物表征使用的仪器：nmr谱使用瑞典brukerdpx-400型超导核磁共振仪测定，tms为内标；高分辨质谱使用waters-micromass公司q-tof质谱仪测定。

实施例1化合物2a-2g和2'a-2'g的合成通法

称取化合物1或1’(1mmol)用1,2二氯乙烷(10ml)溶解，冰浴下加入长链伯胺(1.1mmol,1.1eq)，随后加入三乙酰氧基硼氢化钠(1.3mmol,1.3eq)，氮气保护，移去冰浴，室温下搅拌至薄层检测反应(石油醚:乙酸乙酯＝3:1)完全后，加水(10ml)淬灭反应，乙酸乙酯萃取三次(20ml×3)，合并有机相，饱和食盐水反洗，无水硫酸钠干燥过夜，过滤浓缩，硅胶柱层析分离得到系列化合物2或2’。

本实施合成了系列化合物2a-2g和2'a-2'g，如表1

表1

表1中化合物的核磁数据选择性表述如下：

2a，产率75％，黄色油状物；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.41–7.29(m,5h),4.80(d,j＝11.7hz,1h),4.57(d,j＝11.7hz,1h),4.22–4.18(m,1h),4.09–4.03(m,1h),3.91(ddd,j＝7.7,5.9,2.6hz,3h),2.89(dd,j＝12.4,8.3hz,1h),2.80(dd,j＝12.4,4.6hz,1h),2.58(t,j＝7.3hz,2h),1.63(s,1h),1.50–1.40(m,2h),1.27(s,8h),0.88(t,j＝6.8hz,3h)¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ137.51,128.65,128.17,127.97,79.90,79.69,73.83,69.21,61.48,50.42,49.44,31.91,30.24,29.34,27.40,22.72,14.18.

2b，产率72％，黄色油状物；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ4.80(d,j＝11.7hz,1h),4.58(d,j＝11.7hz,1h),4.23–4.18(m,1h),4.10–4.04(m,1h),3.95–3.87(m,3h),2.90(dd,j＝12.4,8.3hz,1h),2.80(dd,j＝12.4,4.5hz,1h),2.59(t,j＝7.3hz,2h),1.49–1.39(m,2h),1.26(s,10h),0.88(t,j＝6.8hz,3h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ137.49,128.69,128.22,128.01,79.91,79.56,73.86,69.27,61.49,50.41,49.43,31.97,30.16,29.65,29.38,27.46,22.79,14.23.

2c，产率69％，黄色油状物；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.40–7.28(m,6h),4.80(d,j＝11.7hz,1h),4.80(d,j＝11.7hz,1h),4.58(d,j＝11.7hz,1h),4.58(d,j＝11.7hz,1h),4.24–4.16(m,1h),4.11–4.03(m,1h),3.96–3.86(m,3h),2.89(dd,j＝12.4,8.3hz,1h),2.89(dd,j＝12.4,8.3hz,1h),2.80(dd,j＝12.4,4.6hz,1h),2.80(dd,j＝12.4,4.6hz,1h),2.59(t,j＝7.3hz,2h),1.75(s,1h),1.52–1.39(m,2h),1.26(s,12h),0.88(t,j＝6.8hz,3h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ137.50,128.65,128.17,127.98,79.90,79.65,73.83,69.22,61.48,50.41,49.43,32.00,30.21,29.69,29.66,29.39,27.45,22.78,14.21.

2d，产率80％，黄色油状物；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.40–7.29(m,5h),4.79(d,j＝11.7hz,1h),4.58(d,j＝11.7hz,1h),4.25–4.18(m,1h),4.17–4.10(m,1h),3.91(ddd,j＝11.3,8.0,5.7hz,3h),2.89(ddd,j＝17.0,12.5,6.3hz,2h),2.66–2.59(m,3h),1.53–1.42(m,2h),1.26(s,14h),0.88(t,j＝6.8hz,3h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ137.42,128.68,128.23,128.03,79.90,79.09,73.87,69.34,61.47,50.22,49.20,32.02,29.75,29.69,29.64,29.44,27.39,22.80,14.22.

2e，产率73％，黄色油状物；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.40–7.29(m,6h),4.80(d,j＝11.7hz,1h),4.58(d,j＝11.7hz,1h),4.22–4.18(m,1h),4.09–4.03(m,1h),3.95–3.86(m,3h),2.89(dd,j＝12.4,8.2hz,1h),2.80(dd,j＝12.4,4.6hz,1h),2.59(t,j＝7.3hz,2h),1.49–1.39(m,2h),1.26(s,16h),0.88(t,j＝6.8hz,3h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ137.51,128.67,128.19,128.00,79.91,79.66,73.85,69.24,61.50,50.43,49.44,30.23,29.75,29.72,29.70,29.47,27.47,22.81,14.23.

2f，产率75％，黄色油状物；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ4.80(d,j＝11.7hz,1h),4.58(d,j＝11.7hz,1h),4.23–4.18(m,1h),4.07(dt,j＝8.1,5.3hz,1h),3.96–3.87(m,3h),2.89(dd,j＝12.4,8.2hz,1h),2.80(dd,j＝12.4,4.6hz,1h),2.59(t,j＝7.3hz,2h),1.50–1.39(m,2h),1.34–1.22(m,18h),0.88(t,j＝6.8hz,3h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ137.51,128.68,128.20,128.00,79.91,79.64,73.85,69.25,61.50,50.43,49.44,32.05,30.21,29.81,29.77,29.76,29.73,29.71,29.48,27.47,22.82,14.24.

2g，产率77％，黄色油状物；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.41–7.29(m,5h),4.78(d,j＝11.5hz,1h),4.78(d,j＝11.5hz,3h),4.59(d,j＝11.6hz,1h),4.59(d,j＝11.6hz,1h),4.25(s,2h),3.97–3.84(m,3h),2.93(d,j＝13.0hz,2h),2.69(dd,j＝13.3,6.7hz,2h),1.54(s,2h),1.25(s,22h),0.88(t,j＝6.8hz,3h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ137.27,128.72,128.30,128.09,79.90,77.98,73.89,69.53,61.43,49.71,48.65,32.05,29.82,29.81,29.78,29.72,29.68,29.53,29.48,28.82,27.25,22.81,14.24.

2'a，产率82％，黄色油状物；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.40–7.28(m,5h),4.60(q,j＝11.8hz,2h),4.02–3.90(m,4h),3.83(d,j＝4.4hz,1h),2.78(qd,j＝12.3,5.8hz,2h),2.60(td,j＝7.0,4.2hz,2h),1.52–1.42(m,3h),1.35–1.21(m,9h),0.88(t,j＝6.8hz,3h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ137.27,128.58,128.08,127.83,86.11,83.69,72.30,70.79,65.96,51.74,50.07,31.83,30.08,29.24,27.28,22.63,14.10.

2'b，产率78％，黄色油状物；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.40–7.28(m,2h),4.60(q,j＝11.8hz,1h),3.96(dtd,j＝13.5,9.0,5.5hz,2h),3.83(d,j＝4.4hz,1h),2.78(qd,j＝12.3,5.8hz,1h),2.59(tt,j＝8.5,4.4hz,1h),1.51–1.43(m,1h),1.27(d,j＝8.8hz,6h),0.88(t,j＝6.8hz,2h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ137.40,128.69,128.19,127.94,86.23,83.83,72.41,70.89,66.08,51.87,50.20,31.97,30.22,29.66,29.40,27.44,22.79,14.22.

2'c，产率75％，黄色油状物；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.34(s,5h),4.60(q,j＝11.7hz,2h),3.96(dd,j＝24.3,11.5hz,4h),3.83(s,1h),3.29(s,1h),2.91–2.76(m,2h),2.66(t,j＝6.4hz,2h),1.52(s,2h),1.26(s,12h),0.87(d,j＝6.4hz,3h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ137.20,128.58,128.10,127.87,86.04,82.99,72.30,70.86,65.88,51.21,49.72,31.88,29.43,27.22,22.68,14.11.

2'd，产率83％，黄色油状物；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.39–7.28(m,5h),4.60(q,j＝11.8hz,2h),4.03–3.90(m,4h),3.83(d,j＝4.4hz,1h),2.78(qd,j＝12.3,5.8hz,2h),2.59(tt,j＝8.4,4.3hz,2h),1.52–1.42(m,3h),1.26(s,17h),0.88(t,j＝6.8hz,3h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ137.28,128.58,128.08,127.83,86.12,83.68,72.30,70.79,65.96,51.73,50.07,31.93,30.07,29.64,29.63,29.59,29.36,27.32,22.70,14.13.

2'e，产率74％，黄色油状物；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.40–7.29(m,5h),4.60(q,j＝11.8hz,2h),4.02–3.90(m,4h),3.83(d,j＝4.5hz,1h),2.78(qd,j＝12.3,5.8hz,2h),2.66–2.53(m,2h),1.51–1.41(m,2h),1.26(s,16h),0.88(t,j＝6.8hz,3h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ137.40,128.71,128.21,127.96,86.25,83.81,72.43,70.92,66.09,51.86,50.20,32.05,30.20,29.75,29.72,29.72,29.47,27.45,22.82,14.25.

2'f，产率80％，黄色油状物；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.35(dd,j＝10.9,6.8hz,5h),4.60(q,j＝11.7hz,2h),4.03–3.90(m,4h),3.82(d,j＝4.1hz,1h),2.85–2.72(m,2h),2.60(dd,j＝11.3,6.8hz,2h),1.52–1.41(m,2h),1.26(s,19h),0.88(t,j＝6.5hz,3h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ137.38,128.70,128.21,127.96,86.23,83.77,72.42,70.91,66.07,51.84,50.18,32.05,30.17,29.81,29.78,29.76,29.75,29.71,29.49,27.44,22.82,14.26.

2'g，产率76％，黄色油状物；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.40–7.29(m,5h),4.60(q,j＝11.8hz,2h),4.02–3.90(m,4h),3.82(d,j＝4.4hz,1h),2.78(qd,j＝12.3,5.8hz,2h),2.59(td,j＝7.0,4.3hz,2h),1.51–1.41(m,3h),1.25(s,22h),0.88(t,j＝6.8hz,3h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ137.38,128.71,128.22,127.97,86.23,83.81,72.43,70.92,66.06,51.90,50.22,32.07,30.22,29.84,29.80,29.78,29.76,29.73,29.51,27.46,22.84,14.27.

实施例2化合物3a-3g和3'a-3'g的合成通法

将系列化合物2或2’(0.78mmol)溶于甲醇(100ml)，转移至加氢反应瓶(500ml)中。加入pd/c(105mg)以及浓盐酸(1ml)，搭建催化加氢装置，60℃、60psi反应5h，经tlc(二氯甲烷：甲醇＝10:1)检测反应完全后，取下。滤去pd/c，旋蒸浓缩，加氨水调ph至13。用二氯甲烷(30mlx3)萃取，合并二氯甲烷，水洗2次，饱和食盐水洗1次，加入无水mgso4干燥。抽滤除去无水mgso4，旋蒸得粗品。柱层析(二氯甲烷：甲醇＝10:1)，得系列化合物3或3’。

本实施合成了系列化合物3a-3g和3'a-3'g，如表2

表2

表2中化合物的核磁数据选择性表述如下：

3a，产率85％，黄色固体，mp：56.3-58.3℃；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ4.08(d,j＝3.4hz,1h),4.01(d,j＝1.4hz,1h),3.95(t,j＝6.9hz,1h),3.50(dd,j＝15.3,7.9hz,2h),3.19(dd,j＝12.5,3.6hz,1h),2.90(d,j＝12.5hz,1h),2.61(ddd,j＝19.4,11.5,5.7hz,2h),1.55–1.42(m,2h),1.29(d,j＝5.6hz,8h),0.88(t,j＝6.8hz,3h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ78.98,75.05,72.64,56.21,49.82,49.67,31.80,29.69,29.17,27.20,22.66,14.11.hrms:calcdforc12h27n2o2[m+h]⁺231.2073,found231.2070.

3b，产率88％，黄色固体，mp：57.8-59.7℃；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ4.08(t,j＝4.0hz,1h),4.00(td,j＝3.9,1.7hz,1h),3.96(t,j＝6.9hz,1h),3.54–3.42(m,2h),3.20(dd,j＝12.5,3.9hz,1h),2.89(dd,j＝12.5,1.6hz,1h),2.60(ddt,j＝26.2,11.6,7.0hz,3h),1.53–1.43(m,2h),1.28(s,10h),0.88(t,j＝6.8hz,3h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ79.03,75.20,72.70,56.35,49.95,49.70,31.92,29.80,29.53,29.30,27.29,22.74,14.18.hrms:calcdforc13h29n2o2[m+h]⁺245.2229,found245.2227.

3c，产率83％，黄色固体，mp：57.9-60.2℃；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ4.08(t,j＝4.0hz,1h),4.00(td,j＝3.9,1.7hz,1h),3.95(t,j＝7.0hz,1h),3.54–3.43(m,2h),3.19(dd,j＝12.5,3.9hz,1h),2.89(dd,j＝12.5,1.6hz,1h),2.67–2.53(m,3h),1.52–1.42(m,2h),1.26(s,12h),0.88(t,j＝6.8hz,3h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ79.03,75.20,72.71,56.35,49.94,49.71,31.97,29.79,29.60,29.58,29.37,27.29,22.76,14.19.hrms:calcdforc14h31n2o2[m+h]⁺259.2386,found259.2385.

3d，产率80％，白色固体，mp：57.4-59.9℃；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ4.08(t,j＝4.0hz,1h),4.01(td,j＝3.9,1.8hz,1h),3.96(t,j＝6.9hz,1h),3.54–3.42(m,2h),3.19(dd,j＝12.5,3.9hz,1h),2.89(dd,j＝12.5,1.7hz,1h),2.67–2.52(m,2h),1.47(dd,j＝13.3,6.2hz,2h),1.26(s,14h),0.88(t,j＝6.8hz,3h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ79.02,75.19,72.69,56.33,49.93,49.71,31.99,29.79,29.67,29.65,29.57,29.40,27.29,22.77,14.19.hrms:calcdforc15h33n2o2[m+h]⁺273.2542,found273.2542.

3e，产率89％，白色固体，mp：60.7-62.7℃；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ4.08(t,j＝4.0hz,1h),4.01(td,j＝3.9,1.8hz,1h),3.95(t,j＝6.9hz,1h),3.47(tdd,j＝9.0,7.9,5.8hz,2h),3.19(dd,j＝12.5,3.9hz,1h),2.89(dd,j＝12.5,1.7hz,1h),2.67–2.53(m,3h),1.52–1.43(m,2h),1.26(s,16h),0.88(t,j＝6.8hz,3h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ79.04,75.22,72.73,56.37,49.96,49.72,32.02,29.80,29.72,29.66,29.59,29.44,27.31,22.79,14.21.hrms:calcdforc16h35n2o2[m+h]⁺287.2699,found287.2696.

3f，产率84％，白色固体，mp：64.5-66.5℃；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ4.08(t,j＝4.0hz,1h),4.01(td,j＝3.9,1.7hz,1h),3.96(t,j＝6.9hz,1h),3.54–3.43(m,2h),3.19(dd,j＝12.5,3.9hz,1h),2.89(dd,j＝12.5,1.6hz,1h),2.67–2.52(m,3h),1.51–1.43(m,2h),1.26(s,18h),0.88(t,j＝6.8hz,3h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ79.04,75.23,72.72,56.37,49.96,49.73,32.03,29.80,29.77,29.75,29.74,29.67,29.59,29.46,27.31,22.80,14.22.hrms:calcdforc17h37n2o2[m+h]⁺301.2855,found301.2854.

3g，产率89％，白色固体，mp：66.6-68.4℃；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ4.09(t,j＝4.0hz,1h),4.03–4.00(m,1h),3.96(t,j＝6.9hz,1h),3.54–3.43(m,2h),3.19(dd,j＝12.5,3.9hz,1h),2.90(dd,j＝12.5,1.4hz,2h),2.67–2.52(m,2h),1.47(d,j＝7.0hz,2h),1.26(s,22h),0.88(t,j＝6.8hz,3h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ78.97,75.17,72.68,56.29,49.88,49.72,32.04,29.81,29.79,29.77,29.74,29.67,29.59,29.47,27.30,22.81,14.24.hrms:calcdforc19h41n2o2[m+h]⁺329.3168,found329.3169.

3'a，产率83％，黄色油状物；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ4.04(dd,j＝9.1,6.1hz,1h),3.78–3.70(m,2h),3.58(dd,j＝9.1,4.8hz,1h),3.35(dd,j＝10.2,4.6hz,1h),2.84(t,j＝3.9hz,2h),2.67–2.59(m,3h),1.53–1.44(m,2h),1.28(s,8h),0.88(t,j＝6.8hz,3h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ83.74,81.38,73.89,59.59,51.90,50.32,31.81,29.89,29.21,27.26,22.62,14.08.hrms:calcdforc12h27n2o2[m+h]⁺231.2073,found231.2071.

3'b，产率86％，黄色油状物；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ3.98(dd,j＝9.0,6.1hz,1h),3.69(t,j＝4.6hz,2h),3.51(dd,j＝9.1,4.8hz,1h),3.30(d,j＝4.0hz,1h),2.79(d,j＝4.6hz,2h),2.56(t,j＝7.3hz,3h),1.47–1.35(m,2h),1.20(d,j＝8.4hz,10h),0.81(t,j＝6.8hz,3h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ82.57,80.53,72.88,58.48,50.80,49.29,30.81,28.80,28.47,28.24,26.26,21.64,14.08.hrms:calcdforc13h29n2o2[m+h]⁺245.2229,found245.2230.

3'c，产率93％，黄色油状物；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ4.05(dd,j＝9.1,6.1hz,1h),3.80–3.70(m,2h),3.58(dd,j＝9.1,4.8hz,1h),3.35(dt,j＝9.0,4.6hz,1h),2.86(d,j＝4.7hz,2h),2.63(dd,j＝10.8,4.0hz,2h),2.42(s,3h),1.53–1.42(m,2h),1.26(s,12h),0.88(t,j＝6.8hz,3h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ83.77,81.72,74.10,59.73,52.03,50.46,32.00,30.04,29.69,29.68,29.41,27.42,22.79,14.22.hrms:calcdforc14h31n2o2[m+h]⁺259.2386,found259.2384.

3'd，产率90％，黄色油状物；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ3.98(dd,j＝9.1,6.0hz,1h),3.70(d,j＝3.1hz,2h),3.51(dd,j＝9.1,4.7hz,1h),3.33–3.25(m,1h),2.79(d,j＝4.0hz,2h),2.56(t,j＝7.3hz,3h),1.48–1.34(m,2h),1.19(s,14h),0.81(t,j＝6.8hz,3h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ83.78,81.42,73.99,59.62,51.87,50.42,32.02,29.88,29.73,29.71,29.66,29.45,27.41,22.80,14.23.hrms:calcdforc15h33n2o2[m+h]⁺273.2542,found273.2540.

3'e，产率87％，黄色固体，mp：49.7-51.8℃；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ4.06(dd,j＝9.0,6.1hz,1h),3.80–3.71(m,2h),3.59(dd,j＝9.1,4.9hz,1h),3.41–3.34(m,1h),2.87(qd,j＝12.2,5.1hz,2h),2.63(t,j＝7.3hz,2h),1.56–1.42(m,2h),1.26(s,16h),0.88(t,j＝6.8hz,3h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ83.55,82.11,59.63,52.10,50.48,32.05,30.06,29.77,29.75,29.69,29.48,27.42,22.83,14.26.hrms:calcdforc16h35n2o2[m+h]⁺287.2699,found287.2697.

3'f，产率89％，黄色固体，mp：48.4-49.8℃；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ4.05(dd,j＝9.1,6.0hz,1h),3.80–3.71(m,2h),3.58(dd,j＝9.1,4.7hz,1h),3.34(dd,j＝4.2,1.4hz,1h),2.85(d,j＝3.9hz,2h),2.65–2.59(m,2h),1.52–1.44(m,2h),1.26(s,18h),0.88(t,j＝6.8hz,3h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ83.85,81.56,77.48,77.16,76.84,74.13,59.76,52.01,50.46,32.04,30.03,29.79,29.76,29.75,29.68,29.47,27.43,22.80,14.23.hrms:calcdforc17h37n2o2[m+h]⁺301.2855,found301.2853.

3'g，产率88％，黄色固体，mp：51.6-53.2℃；¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ4.06(dd,j＝9.1,6.1hz,1h),3.80–3.72(m,2h),3.59(dd,j＝9.1,4.8hz,1h),3.37(d,j＝5.2hz,1h),2.87(qd,j＝12.1,4.7hz,2h),2.63(t,j＝7.3hz,2h),1.54–1.41(m,2h),1.25(s,22h),0.88(t,j＝6.7hz,3h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ83.77,81.59,74.08,59.70,51.96,50.45,32.05,29.97,29.82,29.80,29.78,29.76,29.75,29.68,29.49,27.42,22.82,14.25.hrms:calcdforc19h41n2o2[m+h]⁺329.3168,found329.3165.

应用例1本发明化合物体外抗肿瘤活性测定：

本发明中抗肿瘤活性评价方法采用mtt法：取对数生长期的细胞，消化计数后，用培养基调整细胞密度，3×10³个/孔(190μl)接种至96孔板中，培养24h至细胞贴壁后，弃去培养基，加入9个不同浓度的待测样品溶液，每组孔的浓度分别为0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml和128μg/ml，每个浓度设3个复孔，另设空白对照组及阳性对照组。药物作用72h后，每孔加入20μlmtt溶液，37℃继续培养4h后，吸去上清液，加入150μl的dmso，振荡均匀，酶标仪490nm处检测吸光度值，计算抑制率，计算公式如下：

抑制率(％)＝(1-给药组吸光度值/空白组吸光度值)×100％

最后将化合物的抑制率％和其相应浓度进行曲线拟合，计算出ic50值。结果如下表3所示。

表3化合物3a-3g和3′a-3′g的抗肿瘤活性数据(ic50,μmol/l,72h)

注：a549为人肺癌细胞

b16-f10为小鼠黑色素瘤细胞

mcf-7为人乳腺癌细胞

pc-3为前列腺癌细胞。

由表3可知，本发明大多数化合物均对四种肿瘤细胞有一定程度的细胞毒活性，其中化合物3f对前列腺癌细胞pc-3，化合物3g对乳腺癌细胞mcf-7活性较好，ic50值分别为0.859μm和0.719μm。

应用例2细胞存活率实验

实验方法：mtt，简称四唑盐，又名噻唑蓝。mtt产品为淡黄色粉末，易被水溶解和透过细胞膜进入细胞内。可被活细胞内的琥珀酸脱氢酶还原，形成不溶于水的蓝紫色晶体。该晶体可溶于酸性异丙醇、二甲基亚砜(dmso)、十二烷基磺酸(sds)等有机溶剂中，通过多孔扫描分光光度计依颜色深浅可测定出各吸光度值。由于结晶物形成的量与细胞数量及代谢活性成正比，因此吸光度值(a值)的大小可反映细胞的数量及活性。细胞存活率＝实验组a值/阴性对照组a值×100％。

将培养皿中处于对数生长期且汇合度达到90％的肿瘤细胞用胰酶消化后，离心收集细胞，将收集的细胞沉淀用新鲜完全培养基重悬。用计数板计数后，配成一定浓度的细胞混悬液，以每孔5×10³个/孔接种于96孔培养板，每孔加100μl细胞混悬液，边缘孔加入无菌pbs，防止边缘效应。在培养箱中培养，待细胞贴壁后再选取不同浓度1,2,3,4μm的化合物3g。作用48h后向每孔中加入5g/l的mtt溶液20μl，继续在37℃、体积百分比5％co2、饱和湿度培养箱培养。4h后弃去上清液，每孔加入dmso150μl，置于摇床摇5～10min使结晶物溶解。在酶标仪上测其吸光度值(a，λ＝570nm)，结果以复孔a的均值表示。

由图1可知，化合物3g以浓度依赖型的方式抑制肿瘤细胞生长，随着浓度的增大，细胞的存活率显著降低，当化合物3g的作用浓度为3μm时，细胞的存活率下降了56％，当作用浓度为4μm时，几乎没有剩余的细胞存活。

应用例3自噬标志蛋白表达实验

实验方法：(1)蛋白提取

将处于对数生长期，生长状态良好的pc-3细胞用含edta的质量百分比0.25％胰酶消化后，收集细胞沉淀。根据需要，用适量培养基重悬细胞，然后接种至100mm的培养皿中，置于37℃、体积百分比5％co2、饱和湿度的培养箱中培养。待细胞完全贴壁后，设置对照组和不同时间给药组(0,1,2,3,4μm)，作用48h后，用1ml枪头将皿底贴壁的细胞刮下，取15mlep管，分别收集每个培养皿中的细胞混悬液到ep管中，再用2ml冰浴预冷的pbs冲洗培养皿，并收集到ep管中，用离心机以1000rpm/min的转速，离心5min，弃去上清液。将细胞沉淀用1ml冰pbs重悬后，转入1.5mlep管，用4℃低温离心机以1500rpm/min的转速，离心5min。再用冰pbs离心清洗两遍细胞沉淀。最后轻轻吸去离心后的上清液，注意枪头不要碰到ep管底部的细胞沉淀。将细胞沉淀放在准备好的冰盒上，根据需要每管加入适量含有全酶抑制剂的细胞裂解液，在冰上裂解30分钟，裂解过程中每隔10min吹打几次细胞悬液。裂解完后，放入已经预冷到4℃的低温离心机中，以12000rpm·min^-1的速度离心25分钟。小心将上清液(即我们需要的蛋白提取液)吸取到干净的ep管中，待下一步定量。

(2)蛋白定量

bca蛋白定量法是最常用的测定蛋白浓度的方法，原理是：蛋白质可以在碱性条件下将cu²⁺还原为cu⁺，而cu⁺可以和bca试剂形成在562nm波长处有最大吸光的蓝紫色络合物。根据酶标仪测得的吸光度与蛋白浓度之间的关系绘制标准曲线，便可计算出待测蛋白的浓度。

a.配制bca蛋白定量工作液，进行蛋白定量时将bca工作液的a液和b液按50:1的比例混匀，注意现用现混匀。

b.取一块96孔细胞培养板，每个蛋白样品设置三个复孔，每孔加入1μl提取的蛋白溶液和19μl超纯水。

c.将事先混匀的bca工作液按200μl/孔加入后，将96孔板放入37℃培养箱中孵育25min。

d.孵育完成后，用酶标仪在562nm波长处测定吸光度值，将吸光度值带入使用标准蛋白得到标准曲线公式，计算蛋白浓度。

(3)蛋白变性

定量完成后，使用5×loadingbuffer和超纯水将各个样品浓度调成一样，以便后续上样时保证等量等体积，然后在100℃放置10min以使蛋白充分变性，变性完成后，-20℃保存备用。

(4)十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)

制胶：用洗干净的一定厚度的玻璃板装好制胶架，加满超纯水检漏。确定不漏后，根据实验需要，一般选用质量百分比8-12％的分离胶，灌入适合高度的分离胶后上面空间加入超纯水液封，注意排除气泡。室温下放置25-30分钟，分离胶基本可以凝聚，如果室温较低凝胶较慢，可以适当延长凝聚时间。待分离胶凝聚后配置浓缩胶，倒掉液封的水，用滤纸将玻璃板间残留的水吸干，注意不要碰到分离胶面。接下来灌注浓缩胶，插上和玻璃板厚度匹配的胶梳，室温放置25-30分钟使其凝聚。

上样：胶凝聚好之后放入电泳槽，加入电泳缓冲溶液，拔出胶梳，如果梳齿变形，可以用针头拨正。使用预染蛋白marker作为分子量指示标志，在紧挨着marker的相邻泳道按顺序等量上样，上样时注意涡旋混匀蛋白样品。

电泳：浓缩胶使用80v恒定电压，当样品到达分离胶后，调整电压为120v，当蓝色的loadingbuffer达到分离胶低端时，停止电泳。

(5)转膜

我们实验室选用比较稳定的湿转法进行转膜，首先根据目的蛋白的分子量切出所需凝胶，裁取大小相当的nc膜和滤纸，制成海绵-滤纸-nc膜-胶-滤纸-海绵顺序的“三明治”，注意夹层中不能有气泡。将做好的“三明治”夹子放入电转槽中，注意区分胶正(极)膜负(极)。加入电转液，调电压至300ma,根据目的蛋白分子量大小，确定不同的转膜时间。

(6)丽春红染色

将转膜完成后的nc膜放入丽春红染液中染色，检查转膜是否成功，若转膜成功则出现清晰的蛋白条带，如果丽春红染色看不到蛋白条带，或者条带模糊不清则证明转膜不成功。根据marker和丽春红染色条带，裁剪出不同分子量的目的蛋白条带。然后将裁剪好的条带用pbst洗三遍，每遍3min，基本可以洗去丽春红。

(7)牛奶封闭

用质量百分比5％的脱脂奶粉(pbst配制)室温封闭2h。

(8)免疫杂交

封闭完之后，将nc膜用pbst轻漂一下，取出放入湿盒中，用滤纸吸干膜上残留的pbst，在nc膜上覆盖一层稀释好的目的蛋白的一抗，4℃冰箱孵育过夜。第二天，用pbst洗膜三次，每次10min；之后同样用湿盒在室温下孵育二抗2h。二抗孵育结束后，pbst洗膜三次，每次10min。

(9)曝光

洗完二抗，用ecl超敏发光液在暗室压片曝光，显影，定影。定影之后，将胶片用水冲洗干净，晾干，扫描保存。

由图2可知，随着化合物作用浓度的增加，beclin-1和lc3-ii蛋白的表达量都明显增加，这两种蛋白是已知的自噬标志蛋白，说明化合物3g诱导前列腺癌细胞pc-3发生了细胞自噬。

应用例4流式细胞仪检测细胞凋亡实验

实验方法：取处于对数生长期且生长状态良好的pc-3细胞，用含edta的质量百分比0.25％胰酶消化离心后，再重悬细胞，通过计数，细胞以2×10⁵个/孔的密度均匀铺在6孔板中，待细胞完全贴壁之后，加化合物3g浓度0,1,2,3,4μm作用48h后，以质量百分比0.25％的胰蛋白酶(不含edta)消化分散细胞，分别收集对照组和不同时间给药组的细胞，用离心机以1000r/min的速度离心细胞5min，用冰的pbs洗涤细胞2次。然后，按照试剂盒说明书加入适量bindingbuffer，每管加入5μlannexinv-fitc染液，室温条件下避光染色15min；继续加入10μlpi染液，在室温条件下避光孵育5min；最后用pbs调整好细胞浓度，混匀；利用流式细胞仪(bdfacscalibur)检测细胞凋亡，cflowplus软件进行数据分析。

由图3可知，流式细胞仪检测细胞凋亡只能检测到细胞的晚期凋亡，当化合物3g的浓度在3μm以下时，细胞早期凋亡的数量几乎没有变化，说明化合物3g的作用机制并不是诱导细胞凋亡。

应用例5流式细胞仪检测线粒体膜电位的实验

实验方法：(取对数生长期生长状态良好的pc-3细胞，用含edta的质量百分比0.25％胰蛋白酶消化离心再重悬细胞后，通过计数，将pc-3细胞以2×10⁵个/孔的密度均匀铺在6孔板中，待细胞完全贴壁之后，按需求给药。作用一定时间后，以质量百分比0.25％的胰蛋白酶消化分散细胞，分别收集对照组和不同时间给药组的细胞，用离心机以1000r/min离心细胞5min，用1ml完全培养基重悬细胞后，以jc-1(2.5μg/ml)在37℃避光染色10min。染色结束后，以冰的pbs洗涤细胞2次。最后用pbs调整好细胞浓度，混匀；利用流式细胞仪(bdfacscalibur)检测细胞线粒体膜电位，cflowplus软件进行数据分析。

由图4可知，随着化合物3g作用浓度的增加，细胞的线粒体膜电位变化明显，当化合物3g的浓度为4μm时，线粒体膜电位降低了42.5％。有研究表明线粒体膜电位的变化能引发细胞自噬，说明化合物3g的作用机制与细胞自噬有关。

应用例6免疫荧光实验

实验方法：(1)铺ibidi板：在免疫荧光技术中我们使用的是1μ-slide8wellibitreat板，pc-3细胞每孔7*10³个细胞和每孔100μl完全培养液进行铺板，铺板要求各个孔细胞数一致，在细胞贴壁后细胞均匀分散于孔中。

(2)加药：对ibidi板中pc-3细胞进行加药处理，每孔200μl配制化合物3g药物浓度3μm，根据不同的作用时间6h，12h，24h加药，对照组无需加药，只需加入200μl完全培养液。

(3)检测前预处理：化合物作用不同时间后，以37℃水浴热过的pbs溶液轻轻漂洗pc-3细胞3次，质量百分比4％多聚甲醛固定30min，后pbs溶液漂洗细胞3次，用质量百分比0.1％tritonx-100进行通透10min，质量百分比10％的羊血清封闭40min，配制的nrf2抗体，放入冰箱4℃过夜。pbs溶液漂洗4次，每次8min，配制荧光二抗封闭1h，后使用pbs溶液漂洗二抗，最后加入dapi染色10min洗干净，加抗猝灭剂，使用共聚焦显微镜进行观察并留存现象。

由图5可知，随着化合物3g作用时间的延长，自噬标志蛋白lc-3在共聚焦显微镜中的荧光强度越来越强，说明发生自噬的细胞在逐渐增多。