本发明属于食品安全检测领域，涉及食品污染物遗传毒性的评估，尤其是一种利用rpsl基因突变率检测评估食品污染物遗传毒性的方法。
背景技术：
食品污染物是在生产、加工、运输和储藏等过程中带入食品中的污染物质，黄曲霉毒素、丙烯酰胺、溴氰菊酯、二恶英及二恶英类多氯联苯等，食品污染物经研究发现均具有致突变性，在食品安全性毒理学评价中，遗传毒性试验常采用细菌致突变试验，即鼠伤寒抄门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验，即ames试验
ames试验广泛应用于致突变化学物的初筛，但是在实际应用中仍存在以下几个问题：
1、ames测试只能检出引起少数几个碱基变化导致突变，如碱基置换突变、移码突变的致突变物，而对于导致dna链断裂及染色体大段缺失而引发突变的致突变物，则无法检测它们的致突变性，具有一定的局限性；
2、ames测试试验程序比较繁琐，方法不够简便，有待于创建新的更为快速灵敏、简单易行的诱变剂短期生物测试法。
通过对现有公开专利文献的检索并未发现rpsl基因突变率检测在评估食品污染物遗传毒性的应用，即没有公开的专利文献作为现有技术影响本发明的新颖性和创造性。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种利用rpsl基因突变率检测评估食品污染物遗传毒性的方法，该方法灵敏度高且简便易行，可以测定农药残留、化学污染物、微生物毒素等诸多食品污染物的遗传毒性，应用这种技术所获得的遗传毒性资料将是食品有毒物质资料库的有力补充，对制定食品安全法规和标准具有重要理论指导价值。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
一种利用rpsl基因突变率检测评估食品污染物遗传毒性的方法，该方法包括如下步骤：
(1)提取质粒pmol21：将分子量为3993bp，带有375bp的rpsl基因序列，并带有氨苄青霉素抗性基因的质粒pmol21通过碱裂解法或质粒提取试剂盒提取该质粒dna；
(2)质粒转入宿主细胞：采用cacl2法制备mf101感受态细胞，并将pmol21质粒转化至感受态细胞内，转化后宿主细胞对链霉素敏感；
(3)食品污染物处理：液态食品污染物直接进行检测，固态食品污染物配制成溶液，根据不同食品污染物的性质加入水和有机溶剂进行溶解，并进行梯度稀释；
(4)基因突变率的检测：将带有质粒pmol21的大肠杆菌mf101培养至对数生长期，od600为0.5-0.7，以0.5-1.5：100稀释至含有食品污染物的液体培养基中，于36-38℃进行振荡培养，并且以550-650nm处的光吸收值测定细胞的生长曲线；
(5)食品污染物培养：食品污染物加入到培养基中，各组均培养10个小时后用于rpsl突变频率的测定，将细菌培养液涂布于含氨苄青霉素的平板上来确定转化细胞的总数，涂板于含氨苄青霉素和链霉素平板上以确定rpsl基因突变的总数，突变率是突变菌数/总菌数，其中突变菌数含氨苄青霉素和链霉素平板的菌数，总菌数含氨苄青霉素平板的菌数，每组至少三次重复，总菌落数不低于103个；
(6)食品污染物遗传毒性的评估：选取rpsl基因突变克隆，提取质粒dna，测定rpsl突变序列，采用dnaman软件进行序列比对，对于突变序列进行碱基置换、移码突变和大片段缺失统计分析，确定食品污染物导致的突变频率、基因突变热点和基因突变的主要类型。
而且，步骤(4)中带有质粒pmol21的大肠杆菌mf101培养至对数生长期，od600为0.6，以1：100稀释至含有食品污染物的液体培养基中，于37℃进行振荡培养，并且600nm处的光吸收值测定细胞的生长曲线。
而且，步骤(5)中含氨苄青霉素的平板与含氨苄青霉素和链霉素平板的浓度为50μg/ml。
而且，所述步骤(4)基因突变率的检测还有另一种体外检测方法，该方法步骤如下：
a采用带有rpsl基因的质粒提取试剂盒提取质粒pmol21，利用scai酶切线性化质粒，并利用生物素标记的引物进行pcr反应，体外扩增质粒pmol21，pcr反应体系中加入食品污染物；
b将dna扩增产物经过纯化、酶切、自连接反应，转化入宿主细胞mf101，利用氨苄青霉素和链霉素筛选rpsl基因突变菌落；
c进行数据统计，并计算rpsl基因突变率，突变率是突变菌数/总菌数，其中突变菌数含氨苄青霉素和链霉素平板的菌数，总菌数含氨苄青霉素平板的菌数，每组至少三次重复，总菌落数不低于106个；
而且，所述的食品污染物是指在生产、加工、运输和储藏过程中带入食品中的污染物质，主要包括农药残留、化学污染物、微生物毒素中的一种或多种。
本发明的优点效果：
1、本发明利用rpsl基因突变与链霉素抗性筛选，同时用rpsl基因突变率的正向筛选系统进行检测，正向筛选系统是指仅有质粒rpsl基因突变的菌株才能够检出，而质粒未突变的菌株不得检出，由于链霉素抗性为隐性的遗传表型，宿主菌mf101的rpsl基因是突变的，只有质粒pmol21的rpsl基因同时被诱发突变才会最终导致宿主细胞具备链霉素抗性，从而达到正向筛选质粒中rpsl突变基因的目的，该正向筛选可以大大提高检测时间，整个分析过程可以在24小时内实现，
2、本发明所采用的rpsl基因分析背景较低，涉及微生物高温培养的方法简单易行，采用rpsl正向选择系统进行致突变性的评价不需要复杂的实验条件，tk基因的自发突变率在10-5，而rpsl的自发突变率低至10-6，远低于同类正向筛选体系，节省人力物力，检测快速高效。
3、本发明所采用体内水平基因突变率检测，利用rpsl基因突变检测的mf101菌株代替鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型菌株进行ames实验，加入哺乳动物微粒体酶系，弥补体外实验缺乏代谢活化系统的不足，并采用平板渗入法检测食品污染物的致突变性。
4、本发明所涉及的rpsl基因突变选择系统是一种灵敏度高且简便易行的体外短期致突变实验方法，可以为检测食品加工过程中产生的潜在致癌物提供一种快速有效的分析方法，rpsl基因突变检测技术是基于rpsl基因的复制保真性来定量检测遗传毒性的方法，应用这种技术所获得的遗传毒性资料将是食品有毒物质资料库的有力补充，对制定食品安全法规和标准具有重要理论指导价值。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明提供一种利用rpsl基因突变率检测评估食品污染物遗传毒性的方法，该方法包括如下步骤：
(1)提取质粒pmol21：将分子量为3993bp，带有375bp的rpsl基因序列，并带有氨苄青霉素抗性基因的质粒pmol21通过碱裂解法或质粒提取试剂盒提取该质粒dna；
(2)质粒转入宿主细胞：采用cacl2法制备mf101感受态细胞，并将pmol21质粒转化至感受态细胞内，转化后宿主细胞对链霉素敏感；
(3)食品污染物处理：液态食品污染物直接进行检测，固态食品污染物配制成溶液，根据不同食品污染物的性质加入水和有机溶剂进行溶解，并进行梯度稀释；
(4)基因突变率的检测：将带有质粒pmol21的大肠杆菌mf101培养至对数生长期，od600为0.6，以1：100稀释至含有食品污染物的液体培养基中，于37℃进行振荡培养，并且600nm处的光吸收值测定细胞的生长曲线；
(5)食品污染物培养：食品污染物加入到培养基中，各组均培养10个小时后用于rpsl突变频率的测定，将细菌培养液涂布于含氨苄青霉素的平板上来确定转化细胞的总数，涂板于含氨苄青霉素和链霉素平板上以确定rpsl基因突变的总数，突变率是突变菌数/总菌数，其中突变菌数含氨苄青霉素和链霉素平板的菌数，总菌数含氨苄青霉素平板的菌数，每组至少三次重复，总菌落数不低于103个，氨苄青霉素的平板与含氨苄青霉素和链霉素平板的浓度为50μg/ml。
(6)食品污染物遗传毒性的评估：选取rpsl基因突变克隆，提取质粒dna，测定rpsl突变序列，采用dnaman软件进行序列比对，对于突变序列进行碱基置换、移码突变和大片段缺失统计分析，确定食品污染物导致的突变频率、基因突变热点和基因突变的主要类型。
基因突变率的检测还有另一种体外检测方法，该方法步骤如下：
a采用带有rpsl基因的质粒提取试剂盒提取质粒pmol21，利用scai酶切线性化质粒，并利用生物素标记的引物进行pcr反应，体外扩增质粒pmol21，pcr反应体系中加入食品污染物；
b将dna扩增产物经过纯化、酶切、自连接反应，转化入宿主细胞mf101，利用氨苄青霉素和链霉素筛选rpsl基因突变菌落；
c进行数据统计，并计算rpsl基因突变率，突变率是突变菌数/总菌数，其中突变菌数含氨苄青霉素和链霉素平板的菌数，总菌数含氨苄青霉素平板的菌数，每组至少三次重复，总菌落数不低于106个；
上述所述的食品污染物是指在生产、加工、运输和储藏过程中带入食品中的污染物质，主要包括农药残留、化学污染物、微生物毒素中的一种或多种。
本发明涉及方法的原理：
本发明是通过rpsl基因在细胞内或细胞外复制中发生突变，引起微生物细胞链霉素抗性的表型变化，测定食品污染物影响rpsl基因的突变频率，并通过测序的方法确定突变形式，从而达到的评估食品污染物遗传毒性的目的。本发明主要利用rpsl基因突变率正向筛选系统，测定食品污染物在体内外引发的rpsl基因突变率，是一种灵敏度高而且简便易行的体外短期致突变评估方法，可以测定农药残留、化学污染物、微生物毒素等诸多食品污染物的遗传毒性。
其中，利用rpsl基因的抗性主要是由rpsl基因编码的核糖体蛋白s12可以与链霉素(sm,streptomycin)形成复合物，并增强链霉素与细菌16srrna结合的能力，从而阻止了转录的起始，这就是链霉素药理作用的基础。若rpsl基因发生突变，将破坏16srrna与链霉素的相互作用，从而导致微生物细胞对链霉素产生耐药性。
正向筛选系统是指仅有质粒rpsl基因突变的菌株才能够检出，而质粒未突变的菌株不得检出。由于链霉素抗性为隐性的遗传表型，宿主菌mf101的rpsl基因是突变的，只有质粒pmol21的rpsl基因同时被诱发突变才会最终导致宿主细胞具备链霉素抗性，从而达到正向筛选质粒中rpsl突变基因的目的。
利用rpsl基因突变检测的mf101菌株代替鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型菌株进行ames实验，加入哺乳动物微粒体酶系，弥补体外实验缺乏代谢活化系统的不足，并采用平板渗入法检测食品污染物的致突变性。
实施例1
采用rpsl测定体内条件下纳米材料对rpsl基因突变率的影响，评估食品污染物纳米级食品保鲜材料的遗传毒性。
本实验选取两种纳米级食品保鲜材料进行突变率检测，纳米材料加入培养基，并加入哺乳动物微粒体酶系，检测大肠杆菌mf101/pmol21的rpsl位点的诱导突变频率。以溶剂组作为对照组，每组至少三次重复，并采用平板渗入法检测食品污染物的致突变性，rpsl基因突变率结果见表1，其中材料1的突变率3.56×10-6高于对照组1.29×10-6。
表1.体内条件下，两种纳米级食品保鲜材料对rpsl基因突变率的影响
实施例2
采用rpsl测定体外条件下纳米材料对rpsl基因突变率的影响，评估食品污染物纳米级食品保鲜材料的遗传毒性。
本实验选取两种纳米级食品保鲜材料进行突变率检测，进行体外基因扩增质粒pmol21，以溶剂组作为对照组，每组至少三次重复。将扩增产物进行连接和转化宿主细胞mf101，统计rpsl基因突变率，突变率结果见表2，纳米材料2的突变率为2.64％高于对照组。
表2.体外条件下，两种纳米级食品保鲜材料对rpsl基因突变率的影响
实施例3
采用rpsl测定体内条件下，丙烯酰胺对rpsl基因突变率的影响，评估食品污染物丙烯酰胺的遗传毒性。
本实验将不同浓度的丙烯酰胺加入到培养基中，各组均培养10个小时后用于进行培养基平板涂布，测定不同浓度的丙烯酰胺对大肠杆菌mf101/pmol21的rpsl位点的诱导突变频率。以溶剂蒸馏水作为对照组，总菌数不低于10-6，所得结果如表3所示，梯度浓度的丙烯酰胺下的突变频率具有一定的剂量反应关系，1mg/ml的丙烯酰胺突变率达到28.11×10-6，远高于对照组1.85×10-6。
表3.体内条件下，丙烯酰胺对rpsl基因突变率的影响