本发明属于食品检测领域和分子生物学技术领域，具体来说，属于如何采用实时荧光raa技术并结合特异的引物检测食品中是否含有猪源成分的方法。
背景技术
近年来，食品安全问题，群众反映强烈，社会关注度也越来越高。2017年1月13日，杭州市市场监管局接到有关巨德公司涉嫌在物美、欧尚超市部分门店专柜销售以猪肉冒充牛肉的投诉举报。通过对腌制的熟食样品送检，确定其样本为猪肉，市场监管局共查获涉案嫌猪肉冒充牛肉约1.6万公斤，案值约180万元。随后，杭州市监管部门依据相关规定对巨德公司和涉案超市进行了处罚。一些食品生产企业为了一己私利，以次充好，偷工减料，严重损害了消费者的利益和生命安全。
重组酶介导扩增(recombinase-aidamplification，raa)技术也是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。与rpa不同的是，raa扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温下，该重组酶可与引物dna紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板dna上搜索到与之完全互补的序列时，在单链dna结合蛋白(single-strandeddnabinding，ssb)的帮助下，使模板dna解链，并在dna聚合酶的作用下，形成新的dna互补链，反应产物也是以指数级增长，通常在1h内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。在raa反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个raa扩增过程，20分钟内，可实现对起始模板的定量及定性分析。整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用，适用于食品快速检测领域。
技术实现要素：
本发明目的在于，提供一组优选后的检测食品中猪源性成分的raa引物对和一条相匹配的荧光探针。
在一些优选的方式中，本发明提供用于检测猪源性成分的基因序列，该序列如seqidno.1和2所示、如seqidno.3和4所示、如seqidno.5和6所示；如seqidno.7和8所示或如seqidno.9和10所示的引物。优选的，这些引物利用raa技术对猪源性成分进行检测。
本发明的第二个目的是提供一种含有上述引物组和荧光探针，用于检测食品中猪源成分的试剂盒。在一些具体的方式中，该试剂盒包括raa必须的试剂以及选自如下一对或者多对的引物序列：seqidno.1和2所示、如seqidno.3和4所示、如seqidno.5和6所示；如seqidno.7和8所示或如seqidno.9和10所示的引物。
本发明的第四个目的是为进行实时荧光定量raa，检测食品中掺杂猪源成分的含量提供引物对，这些引物对选自如下一些引物对：seqidno.1和2所示、如seqidno.3和4所示、如seqidno.5和6所示；如seqidno.7和8所示或如seqidno.9和10所示的引物。
本发明的技术方案概述如下：一种检测食品中猪源成分的raa引物组，其中，该引物对选自下列引物对中的一对或者几对：1号引物对、2号引物对、3号引物对、4号引物对或5号引物对组成，所述1号引物对的核苷酸序列分别如seqidno.1和2所示；所述2号引物对的核苷酸序列分别如seqidno.3和4所示；所述3号引物对的核苷酸序列分别如seqidno.5和6所示；所述4号引物对的核苷酸序列分别如seqidno.7和8所示；所述5号引物对的核苷酸序列分别如seqidno.9和10所示。
在一些优选的实施方式中，所处的引物对为，如seqidno.1和2所示的序列。
一种检测食品中猪源成分的试剂盒，包括引物对、raa干粉试剂、abuffer、bbuffer、无菌水，所述引物对选自下列引物对中的一对或者几对：1号引物对、2号引物对、3号引物对、4号引物对或5号引物对，其中，1号引物对核苷酸序列分别如seqidno.1和2所示，所述2号引物对的核苷酸序列分别如seqidno.3和4所示，所述3号引物对的核苷酸序列分别如seqidno.5和6所示，所述4号引物对的核酸序列分别如seqidno.7和8所示，所述5号引物对的核苷酸序列分别如seqidno.9和10所示。在一些优选的实施方式中，所处的引物对为，如seqidno.1和2所示的序列。
所述的abuffer为20％peg；bbuffer为280mmmgac。
所述的raa干粉试剂的成分如下：1mmol/ldntp、90ng/μlssb蛋白、120ng/μlreca重组酶蛋白(sc-reca/bs-reca)或30ng/μlrad51、30ng/μlbsudna聚合酶、100mmol/ltricine、20％peg、5mmol/l二硫苏糖醇、100ng/μl肌酸激酶。或者，raa干粉试剂的组分如下：1mmol/ldntp、90ng/μlssb蛋白、120ng/μlreca重组酶蛋白(sc-reca/bs-reca)或30ng/μlrad51、30ng/μlbsudna聚合酶、30ng/μlexo核酸外切酶，100mmol/ltricine、20％peg、5mmol/l二硫苏糖醇、100ng/μl肌酸激酶。
在一些优选方式中，本发明的引物组扩增的目的片段大小如下，1号引物对：303bp；2号引物对：159bp；3号引物对：177bp；4号引物对：159bp；5号引物对：244bp。
有益效果
本发明的试剂盒可以快速、准确、灵敏的检测肉制品中的猪源成分。特别是针对线粒体dna降解严重的深加工肉制品，因提供引物的目的片段均为小片段，可以很好的进行检测，进而克服了目的片段过大，在实际检测中无法针对熟肉制品进行检测的情况。
附图说明
图1为本发明中涉及的5对引物，即1号引物对分别对5个物种的肉制品基因组dna进行raa扩增的结果，m为dl2000dnamarker(从下往上，100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp)；1-5分别为鸡、猪、鸭、牛、羊的基因组dna。
图2为猪肉基因组不同浓度的检测结果图。
图3a-3e为本发明中涉及的1号引物对经深加工的市售猪肉制品基因组dna的实时荧光raa扩增结果；图3a为猪肉制品基因组dna与阴性对照，图3b为猪肉与鸡肉制品基因组dna平行检测；图3c为猪肉与鸭肉制品基因组dna平行检测；图3d为猪肉与牛肉制品基因组dna平行检测；图3e为猪肉与羊肉制品基因组dna平行检测。
图4为本发明引物raa定量荧光检测结果。
图5为本发明引物对raa定量荧光检测结果图(熟猪肉)。
图6为牛肉中参假熟制猪肉的raa荧光检测结果图。
具体实施方法
以下通过具体实施例对本发明进一步说明。
实施例1：引物设计
首先从ncbi(nationalcenterforbiotechnologyinformation，美国国家生物技术信息中心)的genbank数据库中找到猪的线粒体dna全序列、牛的线粒体dna全序列、羊的线粒体dna全序列、鸡与鸭的线粒体dna全序列、(猪susscrofadomesticus登陆号：nc_012095.1；牛bostaurus登陆号：ay676864.1；羊ovisaries登录号：kr868678.1；鸡gallusgallus登录号：km096864；鸭anasplatyrhynchos登录号：kj833587.1)，进行序列比对。
根据比对结果，利用猪线粒体dna编码的细胞色素b(cytb)基因序列(ab015076.1)放入primer5.0中进行引物设计，获得220对不同的引物对进行筛选试验。
在设计引物的同时参考猪(susscrofadomesticus)、鸡(gallusgallus)与鸭(anasplatyrhynchos)、牛(bostaurus)、羊(ovisaries)的序列对比结果，保证设计出的用于扩增猪线粒体基因组片段的引物序列不与鸡、鸭、牛、羊线粒体基因组任意序列匹配。同时考虑到熟肉制品的基因组dna降解明显，因而所设引物范围为100bp-400bp。并且为了增强引物的特异性，所设引物的gc含量均在30％-50％之间。
根据以上条件，挑选出150对牛源成分引物进行合成，同时以鸡、猪、鸭、牛、羊全基因组dna为模板，经常规pcr扩增检验引物特异性与产物量，挑选最优引物对，即本发明所提供的5对引物，做后续raa筛选和测试。筛选结果如下：
1号引物对：
f：5’-ctatactacggatcctatatattcctagaaac-3’(seqidno.1)
r：5’-ttcgtgcaggaataggagatgtacggctgcgag-3’(seqidno.2)
2号引物对：
f：5’-gtcatcacaaatctactatcagctatccct-3’(seqidno.3)
r：5’-gagatgtacggctgcgagggcggtaatgatg-3’(seqidno.4)
3号引物对：
f：5’-atacattacacatcagacacaacaacagct-3’(seqidno.5)
r:5’-ttctaggaatatataggatccgtagtatag-3’(seqidno.6)
4号引物对：
f：5’-attatcaacaacgcattcattgacctccca-3’(seqidno.7)
r：5’-tgatgagaaagctgttgttgtgtctgatgtg-3’(seqidno.8)
5号引物对：
f：5’-aatctcatcagacatagacaaaattccatt-3’(seqidno.9)
r：5’-cactccacctagtttattaggaattgaacg-3’(seqidno.10)
实施例子2：最佳引物对的筛选(特异性及灵敏度验证)
1号引物对：
分别提取鸡、猪、鸭、牛、羊5个物种的鲜肉组织中基因组dna，提取的方法如下：
将样品(例如：新鲜肉样品)处理成肉末状；取30mg加入1.5mlep管中；加入500μl裂解液(1mtris-hclph8.0；0.5medtaph8.0；5mnacl；0.5％n-lanroylsarc0sine(n-月桂酰肌氨酸)；蛋白酶k(20mg/μl)；rnasea(10mg/μl)70℃消化0.5-1h或50℃过夜消化，离心(12000r/min，5-15min)，取上清；在上清液中加等体积的酚、氯仿与异戊醇(25∶24∶1)抽提；取400μl水相，加40μlnacl，1ml冰乙醇，冰上放置30min；离心(12000r/min，5min)，弃上清；用1ml70％无水乙醇洗3次，晾干；加70-100μlte，静置30min。所提基因组dna放置于-20℃冰箱中保存，为以后实验使用。
以此为模板进行raa反应。
raa反应干粉：1mmol/ldntp、90ng/μlssb蛋白、120ng/μlreca重组酶蛋白(sc-reca/bs-reca)或30ng/μlrad51、30ng/μlbsudna聚合酶、100mmol/ltricine、20％peg、5mmol/l二硫苏糖醇、100ng/μl肌酸激酶。
反应体系：50μl：
提取的基因dna的模板：2.0μl；20％peg的abuffer：12.5μl；280mmmgac的bbuffer：2.5μl；上下游引物分别2.0μl；ddh2o31μl，以及raa反应干粉试剂。
50μl反应体系的配置方法：在上raa反应干粉试剂中添加提取的基因dna的模板：2.0μl；20％peg的abuffer：12.5μl；280mmmgac的bbuffer：2.5μl；上下游引物分别2.0μl；ddh2o31μl，然后混合均匀进入如下步骤的反应扩增。
反应条件：37℃下反应30分钟。
反应结果后进行琼脂电泳，结果如图1所示，1-5为鸡、猪、鸭、牛、羊的基因组dna，6为阴性对照，7为阳性对照；
如图2所示，1-5为猪的基因组dna浓度(依次为78.5ng/μl、7.85ng/μl、785.0pg/μl、78.5pg/μl、7.85pg/μl)的扩增结果，6为阴性对照，7为阳性对照。m为dl2000dnamarker(从下往上，100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp)。
以上是1号引物的结果图，可以看出1号引物可以区分出不同的肉来源，具有较好的特异性，单纯对于肉制品来讲，当dna浓度为78.5ng/μl、7.85ng/μl、785.0pg/μl、78.5pg/μl的时候，可以获得检测结果，而其他浓度，没有明显的线条出现，说明检测结果不够明显。
采取同样的体系和方法对其它4对引物做了检测，结果如下：
2号引物对：2号引物的结果与1号引物的结果相似，具体数据略。
3号引物对：特异性不好，不能很好区分个物种，具体数据略。
4号引物对：灵敏度不好，低浓度的dna，扩增效率不高，可能是因为序列的匹配度不高。
5号引物对：5号引物的结果与1号引物的结果相似，具体数据略。
从以上结果来看，1，2，5号引物对为最佳的引物对，适合用raa的方法进行扩增，具有良好的特异性和灵敏度。
实施例子3：abi7500实时荧光raa扩增验证(以1号引物对为例)
所对应的探针的序列：
ctacggtcatcacaaatctactatcagcta[fam-dt]c[thf]c[bhq-dt]
tatatcggaacagacc(seqidno.11)
反应体系：50μl：
提取新鲜样本的基因dna的模板(鸡、猪、鸭、牛、羊)分别是：2.0μl；20％peg的abuffer：12.5μl；280mmmgac的bbuffer：2.5μl；上下游引物分别2.0μl；probe(探针)0.6μl；ddh2o28.4μl，以及实时荧光raa反应干粉试剂。
实时荧光raa反应干粉：1mmol/ldntp、90ng/μlssb蛋白、120ng/μlreca重组酶蛋白(sc-reca/bs-reca)或30ng/μlrad51、30ng/μlbsudna聚合酶、30ng/μlexo核酸外切酶，100mmol/ltricine、20％peg、5mmol/l二硫苏糖醇、100ng/μl肌酸激酶。
50μl反应体系的配置方法：在上述实时荧光raa反应干粉试剂中添加提取的基因dna的模板：2.0μl；20％peg的abuffer：12.5μl；280mmmgac的bbuffer：2.5μl；上下游引物分别2.0μl；probe0.6μl；ddh2o28.4μl，然后混合均匀进入如下步骤的反应扩增。
首先开启abi7500实时荧光扩增仪(美国应用生物系统公司)进行20-30min预热，设计以下程序：holdingstage，39℃60s，1个循环；cyclingstage，39℃30s，40个循环，并收集荧光信号数据。
结果：最后，对扩增结果进行分析，如图3a-e所示，图3a为猪肉制品基因组dna与阴性对照，图3b为猪肉与鸡肉制品基因组dna平行检测；图3c为猪肉与鸭肉制品基因组dna平行检测；图3d为猪肉与牛肉制品基因组dna平行检测；图3e为猪肉与羊肉制品基因组dna平行检测；
如图4所示，从上到下为1-3为猪的基因组dna浓度(从上到下依次为7.85ng/μl、785.0ng/μl、78.5pg/μl)，最下面平滑直线为阴性对照。
同时采用类似abi7500实时荧光raa扩增验证引物对2和5，结果与1号引物对类似，具体数据略。
实施例子4：对市售经深加工的猪肉制品进行验证(以1号引物对为例)
1、提取深加工的猪肉制品的基因组dna：方法同实施例1中提肉制品的基因组dna。
2、体系：50μl(模板：2.0μl；abuffer12.5μl；bbuffer2.5μl；上下游引物分别2.0μl；probe0.6μl；ddh2o28.4μl)。各个组分具体组成与实施例3中一样。
3、abi7500荧光扩增验证
以上所提的基因组dna为模板，用本发明中引物1进行实时荧光raa扩增。
反应条件：
第一步：39℃60s；
第二步：39℃30s，40个循环。
最后，对扩增结果进行分析，如图5所示，1阳性对照(新鲜猪肉)，2-3为深加工的猪肉制品的基因组dna的检测结果(熟肉制品)，4阴性对照。
同时，采用2号，5号和3号引物对对熟肉猪肉进行raa定量荧光检测，发现3号引物对可以特异区分猪肉，而不能对其他物种进行熟肉有效的扩增。同时，2号和5号也可以对熟肉猪肉获得特异有效的检测，而不能对其他物种进行熟肉有效的扩增(例如鸡、猪、鸭、牛、羊熟制肉品)。
实施例子5：对市售经掺假的牛、羊肉制品(掺入猪肉)进行验证(以1号引物对为例)
对人工掺假的牛、羊肉制品(掺入猪肉)进行验证
1、提取人工掺假的牛、羊肉制品(掺入猪肉，掺假肉质量比1:1)的基因组dna：方法同实施例1中提肉制品的基因组dna。
2、abi7500荧光扩增验证
以上所提的基因组dna为模板，用本发明中引物1进行实时荧光raa扩增。
反应体系：50μl(模板：2.0μl；abuffer12.5μl；bbuffer2.5μl；上下游引物分别2.0μl；probe0.6μl；ddh2o28.4μl)。各个组分具体组成与实施例3中一样。
反应条件：
第一步：39℃60s；
第二步：39℃30s，40个循环。
最后，对扩增结果进行分析，如图6所示，1为猪肉和牛肉混合的牛肉制品的基因组dna(确定是否含有猪肉，其中出现猪肉的线条1)，2为猪肉和牛肉混合的牛肉制品的基因组dna(确定是否含有牛肉，出现牛肉的线条2)，3为纯猪肉制品的基因组dna(猪肉阳性对照)，4为纯牛肉制品的基因组dna(牛肉制品的阳性对照)，5为阴性对照。按照类似的实验方法，也可以特异的鉴定出羊肉中参假的熟制猪肉。
最终，对扩增的产物进行序列测定(线条1对应的扩增产物)，获得的如下序列：
atgaaacattggagtagtcctactatttaccgttatagcaacagccttcataggctacgtcctgccctgaggacaaatatcattctgaggagctacggtcatcacaaatctactatcagctatcccttatatcggaacagacctcgtagaatgaatctgagggggcttttccgtcgacaaagcaaccctcacacgattcttcgcctttcactttatcctgccattcatcattaccgcc
在缺少本文中所具体公开的任何元件、限制的情况下，可以实现本文所示和所述的发明。所采用的术语和表达法被用作说明的术语而非限制，并且不希望在这些术语和表达法的使用中排除所示和所述的特征或其部分的任何等同物，而且应该认识到各种改型在本发明的范围内都是可行的。因此应该理解，尽管通过各种实施例和可选的特征具体公开了本发明，但是本文所述的概念的修改和变型可以被本领域普通技术人员所采用，并且认为这些修改和变型落入所附权利要求书限定的本发明的范围之内。
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