与水稻粒长及落粒性相关的蛋白及其编码基因与应用的制作方法

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种与水稻粒长及落粒性相关的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术：

稻属(oryzal.)植物包含两个极为重要的栽培作物，即亚洲栽培稻(o.satival.)和非洲栽培稻(oryzaglaberrimasteud.)，分别独立起源于亚洲和非洲。

非洲栽培稻是大约3000年前独立起源于非洲的栽培稻，和亚洲栽培稻是由不同的祖先物种驯化而来。16世纪中叶，葡萄牙人便将亚洲栽培稻引入西非，导致非洲栽培稻的物种迅速减少，所以现在的种植区域和面积远小于亚洲栽培稻。目前，亚洲栽培稻已在全球范围内广泛种植，为世界上近一半人口提供食物来源。非洲栽培稻局限分布于非洲的西部，是当地主要的粮食作物之一，对非洲的文明和当地经济起到了积极的作用。然而，与开展了广泛研究的亚洲栽培稻相比，非洲栽培稻的相关研究十分匮乏，迄今对非洲栽培稻的群体遗传结构和进化历史知之甚少。

但是，非洲栽培稻具有早熟、抗病、耐干旱等特性，在特殊生态环境中有一定的生产优势。因此，提高非洲栽培稻的收获产量具有一定的应用价值。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种与水稻粒长及落粒性相关的蛋白及其编码基因与应用。

本发明所提供的蛋白质，命名为gl4，具体为如下任一：

a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

c)将a)或b)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与植物种子的粒长和/或落粒性相关的蛋白质；

d)与a)-c)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且与植物种子的粒长和/或落粒性相关的蛋白质。

其中，(c)和(d)所示的蛋白质可为来源于水稻的蛋白质。

为了便于所述蛋白质的纯化，可在所述蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna、hnrna或trna等。

在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述蛋白质的基因，所述基因具体可为如下任一所示的dna分子：

1)序列表中序列3的第2341-4346位所示的dna分子；

2)序列表中序列4的第2322-4333位所示的dna分子；

3)序列表中序列5所示的dna分子；

4)序列表中序列6所示的dna分子；

5)在严格条件下与1)-4)中任一限定的dna分子杂交且编码所述蛋白质的dna分子；

6)与1)-5)中任一限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且编码所述蛋白质的dna分子。

上述严格条件可为用6×ssc，0.5％sds的溶液，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。

含上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pcambia1300、pcubi1390、pchf3、pgreen0029、pcambia3301、pbi121、pbin19、pcambia2301、pcambia1301-ubin或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、泛素基因ubiquitin启动子(pubi)、胁迫诱导型启动子rd29a等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在本发明中，所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子为水稻内源启动子，具体如序列表中序列4的第1-2321位或序列3的第19-2340位所示。

更为具体的，在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体为在pcambia1300载体的多克隆位点处(具体为xbai和hindiii)插入序列表中序列4所示dna片段后得到的重组质粒。在本发明的另一个实施例中，所述重组表达载体为将序列表中序列3所示dna片段与pcambia1300载体同源重组后所得的重组质粒。

所述表达盒由能够启动所述基因表达的启动子，所述基因，以及转录终止序列组成。

所述蛋白质或所述核酸分子或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：

(a)增加植物种子的籽粒长度；

(b)选育籽粒长度增加的植物品种；

(c)提高植物种子的落粒性；

(d)选育落粒性提高的植物品种。

其中，所述选育籽粒长度增加的植物品种的方法以及所述选育落粒性提高的植物品种的方法，均具体可包括将所述基因表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。

本发明还保护一种培育籽粒长度增加和/或落粒性提高的植物的方法。

本发明所提供的培育籽粒长度增加和/或落粒性提高的植物的方法，可包括如下步骤：提高受体植物中权利要求1所述蛋白质的表达量和/或活性，从而得到籽粒长度增加和/或落粒性提高的植物。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，具体可包括如下(a1)和(a2)的步骤：

(a1)向受体植物中导入所述蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；

(a2)从步骤(a1)所得转基因植物中得到与所述受体植物相比，具有如下(b1)和/或(b2)所示性状的转基因植物：

(b1)籽粒长度增加；

(b2)落粒性提高。

所述蛋白质在所述转基因植物中的表达量高于所述受体植物；所述基因具体可为如下任一所示的dna分子：

1)序列表中序列3的第2341-4346位所示的dna分子；

2)序列表中序列4的第2322-4333位所示的dna分子；

3)序列表中序列5所示的dna分子；

4)序列表中序列6所示的dna分子；

5)在严格条件下与1)-4)中任一限定的dna分子杂交且编码所述蛋白质的dna分子；

6)与1)-5)中任一限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且编码所述蛋白质的dna分子。

上述严格条件可为用6×ssc，0.5％sds的溶液，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。

所述基因具体可通过上述任一所述重组表达载体导入所述受体植物中，得到所述转基因植物。具体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法将所述重组表达载体转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

在本发明中，所述植物可为单子叶植物，如禾本科植物，具体如水稻，更加具体如非洲水稻。

在本发明的一个实施例中，所述受体植物具体为非洲栽培稻品种irgc102305。

实验证明，将可表达序列表中序列1或序列2所示蛋白质的重组表达载体转化非洲栽培稻品种irgc102305，与相同条件下的未经转基因的非洲栽培稻品种irgc102305植株相比，转基因水稻的籽粒长度更长，落粒性更强。本发明所提供的gl4蛋白及其编码基因在提高植物种子的籽粒长度和落粒性方面具有重要意义，将在培育高产植物新品种中发挥重要作用。

附图说明

图1为株系gil25与非洲稻品种irgc102305的籽粒长度以及落粒性比较。

图2为gl4基因定位示意图。

图3为实施例2中转入pgl4-1载体的转基因株系的pcr鉴定结果。

图4为实施例2中转入pgl4-1载体的转基因株系与非洲稻品种irgc102305的籽粒长度以及落粒性比较。图中，pgl4-1表示转入pgl4-1载体的转基因株系。

图5为实施例2中不同遗传材料的籽粒长度统计结果。

图6为实施例3中转入pgl4-2载体的转基因株系与非洲稻品种irgc102305的籽粒长度以及落粒性比较。图中，pgl4-2表示转入pgl4-2载体的转基因株系。

图7为实施例3中不同遗传材料的籽粒长度统计结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

非洲稻品种irgc102305和非洲野生稻w1411：可从国际水稻所获得，网址为：

http://www.irgcis.irri.org:81/grc/irgcishome.html；或者

https://shigen.nig.ac.jp/rice/oryzabase/strain/wildcore/list。

pcambia1300载体：记载于“zhuzuofeng,tanlubin,fuyongcai,liufengxia,caihongwei,xiedaoxin,wufeng,wujianzhong,matsumototakashi,sunchuanqing.geneticcontrolofinflorescencearchitectureduringricedomestication.naturecommun,2013,4:2200doi:10.1038/ncomms3200.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。

实施例1、调控非洲稻籽粒大小及落粒性基因的定位

非洲稻品种irgc102305与非洲野生稻w1411杂交，再将irgc102305作为轮回亲本，多次回交获得一个在籽粒大小上与irgc102305差别明显的株系gil25，且其籽粒易落(图1)，将其与irgc102305杂交构建了一个包含186个单株的f2分离群体。在这个f2群体中，籽粒长度和落粒性都与标记rm3335与rm5608紧密连锁，且将gl4基因定位在这两个基因之间。然后将分离群体扩大到6500个单株，发现落粒性与籽粒大小共分离。并根据标记rm3335与rm5608之间的序列设计引物，最终将gl4基因定位到标记m3与m4之间的5.9kb上(图2)。且所有籽粒较长的株系表现出落粒性，籽粒较短的株系表现出不落粒性。在网站http://ensembl.gramene.org/oryza_glaberrima上根据非洲栽培稻irgc96717(cg14)序列预测，该区间只含有一个候选基因orgla04g0254300。因此该基因就是gl4基因，控制非洲栽培稻的籽粒长度。株系gil25与非洲野生稻w1411的gl4基因序列相同。

实施例2、gl4转基因非洲稻的获得及其功能验证

一、表达载体的构建

根据非洲野生稻w1411的基因orgla04g0254300以及启动子序列设计引物，并在引物两端分别引入限制性内切酶xbai和hindiii识别位点及保护碱基，引物序列如下：

pgl4-1f：5’-tgctctagagctggccgtagaagtcaag-3’(带下划线碱基为限制性内切酶xbai识别位点及保护碱基，其后的序列为序列4的第1-19位)；

pgl4-1r：5’-acaaagcttgtatagctcagcacgagc-3’(带下划线碱基为限制性内切酶hindiii识别位点及保护碱基，其后的序列为序列4的第4876-4893位的反向互补序列)。

利用ctab法提取非洲野生稻w1411的全基因组dna。以此dna为模板，扩增长度约为4.8kb的dna片段，其序列为“tgctctaga+序列4+aagctttgt”。用试剂盒回收，将其克隆入植物表达载体pcambia1300的酶切位点xbai和hindiii之间，得到非洲栽培稻的植物表达载体，测序正确后命名为pgl4-1。

pgl4-1的结构描述如下：将序列表中序列4所示dna片段替换pcambia1300的酶切位点xbai和hindiii之间的小片段后得到的重组质粒。

序列4的第1-2321位为非洲野生稻w1411内源的gl4基因启动子序列，第2322-4333位为含有内含子的gl4基因序列(第3156-3994位为内含子序列)。对应的不含内含子的gl4基因cds序列如序列表中序列6所示。序列4的第2322-4333位以及序列6均编码序列表中序列2所示的gl4蛋白。

二、转化非洲栽培稻及pcr鉴定

将步骤一构建的载体pgl4-1通过基因枪法转化进籽粒较短且不落粒的非洲栽培稻品种irgc102305，用含潮霉素的nb培养基进行2轮筛选，再经预分化，分化得到转基因植株。实验同时设置向非洲栽培稻品种irgc102305中转入pcambia1300空载体的对照。

通过pcr鉴定转基因植株。具体操作如下：取生长期转化植株以及空载体对照植株和非洲栽培稻品种irgc102305的叶片，使用ctab法提取总dna，使用如下引物针对pcambia1300载体上自带的潮霉素抗性基因进行pcr鉴定：

hptf：5’-gtctccgacctgatgcagctctcgg-3’；

hptr：5’-gtccgtcaggacattgttggag-3’。

鉴定结果如图3所示，泳道1为dnamarkeriii(北京拓英坊科技有限公司产品)，目的条带大小为520bp。泳道2-15为转基因阳性植株，泳道16为双蒸水，泳道17为未转基因的非洲栽培稻品种irgc102305，泳道18为阳性对照pcambia1300载体。

三、转基因稻的功能鉴定

经步骤二潮霉素抗性筛选及pcr鉴定共获得12株转基因植株。以这12株转基因植株，以及转入pcambia1300空载体的对照和未经转基因处理的非洲栽培稻品种irgc102305为实验材料。观察各实验材料的籽粒表型以及落粒性，并统计3个转基因株系、3个空载对照株系和非洲栽培稻品种irgc102305的籽粒长度，每个系10株。

结果显示：

与空载对照和未经转基因处理的非洲栽培稻品种irgc102305相比，经步骤二潮霉素抗性筛选及pcr鉴定的转基因植株其籽粒全部为较长籽粒，且更易落粒(图4)。

统计3个转基因株系、3个空载对照株系和非洲栽培稻品种irgc102305的籽粒长度，结果如图5所示。其中，pgl4-1-1、pgl4-1-2和pgl4-1-3表示随机选取的3个转基因株系，vector-1、vector-2和vector-3表示随机选取的3个空载对照株系，irgc102305-1表示未经转基因处理的非洲栽培稻品种irgc102305。由图可见，非洲栽培稻irgc102305的籽粒长度为8.25厘米，转入空载体的阳性单株籽粒长度为8.21-8.27厘米，转入pgl4-2载体的阳性单株籽粒长度为9.36-9.42厘米。转入pgl4-2的阳性单株籽粒长度相对于转入空载的阳性单株和受体材料irgc102305都有明显提高(t测验，p<0.05)。因此，序列2所示的gl4蛋白(序列4的第2322-4333位或序列6所示的gl4基因)可用于调控籽粒长度和落粒性。

实施例3、关键变异的获得及验证

一、关键变异的获得

利用qpcr的方法比较非洲野生稻w1411和非洲栽培稻品种irgc102305的gl4表达水平发现，gl4在这两种材料中表达量无明显差异。对非洲野生稻w1411和非洲栽培稻品种irgc102305的gl4基因的编码区序列比对发现，一共有五处变异：g294a，c766t，c1466t，a1515g和gccgcc681-686缺失(变异是非洲栽培稻品种irgc102305相对于非洲野生稻w1411而言的)。通过16份野生稻和67份非洲栽培稻的gl4基因序列比对发现，c766t与籽粒长度以及落粒性关联程度最高。

二、表达载体的构建

以非洲栽培稻品种irgc102305的基因组为模板，设计如下两个引物对pgl4-2af/pgl4-2ar和pgl4-2bf/pgl4-2br，其中带下划线且为粗体的碱基为人为引入，为的是回复c766t突变，斜体且带下划线部分为pcambia1300载体序列。

pgl4-2af：5’-tacccggggatcctctaggctggccgtagaagtcaag-3’；

pgl4-2ar：5’-cgacgacggcggcggctgaggaggaggtgggtggtg-3’。

pgl4-2bf：5’-agccgccgccgtcgtcgctgca-3’；

pgl4-2br：5’-tgtaaaacgacggccagtgccacttgtatagctcagcacgagc-3’。

以非洲栽培稻品种irgc102305的基因组为模板，分别以引物对pgl4-2af/pgl4-2ar和pgl4-2bf/pgl4-2br进行扩增，分别获得长度约为3.1kb和1.8kb的片段，切胶回收后，通过同源重组酶将这两个片段与pcambia1300载体相连接，获得一个包含gl4上游2kb以及下游560bp的重组载体，测序正确后命名为pgl4-2。pgl4-2载体所嵌入的片段除上述c766t位置与非洲栽培稻irgc102305不同外，其他序列与irgc102305完全相同。在c766t位置，载体pgl4-2为碱基c，而非洲栽培稻品种irgc102305为碱基t。

pgl4-2载体的结构描述为：将序列表中序列3所示dna片段与pcambia1300载体同源重组(上下游同源臂分别为序列3的第1-18位和第4906-4931位)后所得的重组载体。

其中，序列3的第1-18位和4906-4931位为pcambia1300载体上的序列，第19-2340位为非洲栽培稻品种irgc102305内源的gl4基因启动子序列，第2341-4346位为gl4基因(第3169-4007位为内含子序列)。对应的不含内含子的gl4基因cds序列如序列表中序列5所示。序列3的第2341-4346位以及序列5均编码序列表中序列1所示的gl4蛋白。

三、转化非洲栽培稻及pcr鉴定

将步骤一构建的载体pgl4-2通过基因枪法转化进籽粒较短且不落粒的非洲栽培稻品种irgc102305，用含潮霉素的nb培养基进行2轮筛选，再经与分化，分化得到转基因植株。实验同时设置向非洲栽培稻品种irgc102305中转入pcambia1300空载体的对照。通过pcr鉴定转基因植株。具体如实施例2步骤二。

四、转基因稻的功能鉴定

经步骤二潮霉素抗性筛选及pcr鉴定共获得15株转基因植株。以这15株转基因植株，以及转入pcambia1300空载体的对照和未经转基因处理的非洲栽培稻品种irgc102305为实验材料。观察各实验材料的籽粒表型以及落粒性，并统计3个转基因株系、3个空载对照株系和非洲栽培稻品种irgc102305的籽粒长度，每个系10株。

结果显示：

与空载对照和未经转基因处理的非洲栽培稻品种irgc102305相比，经步骤二潮霉素抗性筛选及pcr鉴定共获得15株转基因植株其籽粒全部为较长籽粒(图6)。

统计3个转基因株系、3个空载对照株系和非洲栽培稻品种irgc102305的籽粒长度，结果如图7所示。其中，pgl4-2-1、pgl4-2-2和pgl4-2-3表示随机选取的3个转基因株系，vector-1、vector-2和vector-3表示随机选取的3个空载对照株系，irgc102305-1表示未经转基因处理的非洲栽培稻品种irgc102305。由图可见，非洲栽培稻irgc102305的籽粒长度为8.25厘米，转入空载体的阳性单株籽粒长度为8.21-8.27厘米，转入pgl4-2载体的阳性单株籽粒长度为9.24-9.28厘米。转入pgl4-2的阳性单株籽粒长度相对于转入空载的阳性单株和受体材料irgc102305都有明显提高(t测验，p<0.05)。因此，序列1所示的gl4蛋白(序列3的第2341-4346位或序列5所示的gl4基因)可用于调控籽粒长度和落粒性。

<110>中国农业大学

<120>与水稻粒长及落粒性相关的蛋白及其编码基因与应用

<130>gncln170814

<160>6

<170>patentinversion3.5

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<213>人工序列

<220>

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