一种玉米发育调控蛋白、编码基因及应用的制作方法

本发明涉及植物基因工程领域，更具体的说，涉及一种玉米发育调控蛋白zmbhlh-4、编码基因及应用。

背景技术：

转录因子在高等植物的生长发育、形态建成以及响应生物和非生物胁迫等环境反应中起着重要的调控作用。植物转录因子家族众多、结构复杂，而且数目也在不断的增加，表明了高等植物转录调控的复杂性同时也体现了转录因子研究的重要性。研究植物转录因子的结构功能，为作物性状的改良提供了重要的理论基础。以此利用这些转录因子在遗传改良过程中改进作物的性状。

转录因子也称反式作用因子，可以直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上，从而参与调控靶基因转录效率的蛋白质，广泛参与植物低温、干旱、高盐、抗病等逆境的应答以及植物生长发育。目前对植物转录因子的结构与功能的研究已成为植物分子生物学领域的研究热点之一。根据planttranscriptionfactordatabase(planttfdb)，玉米中有56个转录因子家族。

其中bhlh(basic/helix-loop-helix)家族是一类大家族，都包含bhlh结构域，该结构域由两个不同的保守区域组成，n端的碱性区域与下游启动子区核心序列e-box(canntg)结合，c端的螺旋环螺旋区域负责形成同源或者异源二聚体，bhlh家族成员主要以二聚体的形式来行使功能。目前，玉米中共有308个bhlh家族成员。

bhlh类转录因子在真核生物的整个生长发育过程中起着重要的调控作用，如毛状体的发生、种子的发育、光形态建成和光信号转导、花器官发育、 气孔开关、激素应答、金属离子体内平衡、类黄酮和花青素合成等，该家族成员还参与植物响应逆境胁迫。例如玉米bhlh家族r1蛋白既能促进叶片毛状体以及根毛的分化又是花青素合成所必须的，r1蛋白连接r2r3-myb蛋白和wd40蛋白，并通过myb-bhlh的相互作用招募未知因子，共同启动花青素合成基因的转录(ramsayandglover2005)。

技术实现要素：

本发明从玉米中分离一种参与植物生长发育的转录调控因子及其编码基因，并对其功能进行了研究，表明该基因参与种子萌发，叶片生长及分枝发育，在调控植物生长发育方面具有重要应用前景。

本发明所提供的蛋白，名称为zmbhlh-4，来源于玉米b73，属bhlh类转录因子。

本发明采用cdna文库pcr扩增的方法，获得了zmbhlh-4基因的cds序列。zmbhlh-4基因的全长cdna序列包含1642bp，cds序列1080bp(序列1)，编码359个氨基酸的蛋白(序列2)。

本发明所克隆的zmbhlh-4基因产物在细胞核中表达(图1)。

本发明把zmbhlh-4基因构建到植物表达载体上，启动子为ubiqutin，得到过表达载体质粒(图2)，将其转化到农杆菌eha105中，用农杆菌转化拟南芥并获得了转基因植株。把转基因植株与未转基因的野生型植株在正常生长条件下进行比较，结果表明，zmbhlh-4的过表达可促进植物种子的萌发、早期叶片生长及分枝形成(图3，图4，图5，图6，图7)。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。附图中：

图1为zmbhlh-4蛋白的亚细胞定位图；

图2为zmbhlh-4过表达载体图谱；

图3为zmbhlh-4转基因拟南芥种子萌发图；

图4为zmbhlh-4转基因拟南芥叶片表型图；

图5为zmbhlh-4转基因拟南芥植株表型图；

图6为拟南芥植株分支数统计图；

图7为拟南芥植株株高统计图。

具体实施方式

下面将结合实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1玉米zmbhlh-4基因cdna的克隆

以玉米b73的cdna文库为模板进行rt-pcr扩增，pcr引物如下：

zmbhlh-4fw：

5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctatatggcgccactctcc-3'；

zmsoc1rv：

5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctcaaagctccgtctttagcttg-3'。

扩增条件是：

扩增出dna片段从琼脂糖胶中回收，利用gateway重组系统的bp反应将pcr产物重组到pdonr221载体，转化e.coli，酶切鉴定后测序。得到cds为序列1所示的基因，将该基因命名为zmbhlh-4，全长1080bp，具体序列如下：

atggcgccactctcccctacccccgcctccgcctctgctcccgtgtcctcctcccctc gttccctcgtcccggacgcctccgccgcgccgatgcgccccgcctcgccgccgcaggagctccccgccgccgggggcgagatccaggcggcgctggcccctgccaatgcctccaccgcgggcgcccgcggaggcggaggctccttcacggcgctgctgggactccccacctcgcaggccatggagctgctcctcccccgcacgacgccccccgccctagccacagcgcccgcgccaaccttcccctccgacccgcacctcgtggaccgcgccgcgcgcttatccacgttcgcgcccccgtccccgtccccatcctccacgtccccggcccggcccctccccgccgccgctaacgccggcaagcgcaaggccgaccccgtcgaccgtgcctccaaggggaaggcggcgaagaaggggaagacggcggaggagaagctcgcgggcggcgacggcgacgacgagaagccggcgtacgtgcacgtgcgggccaggcggggccaggccacggacagccacagcctcgccgagcgggcgagacgcgagaagatcaatgcgaggatggagctgctcaaggagctggtccccggctgcagtaaggtatcaggaacagcattggtgctagatgagatcatcaatcatgttcagtctctccaaaggcaagttgagtacttgtcaatgaggctcgcagctgtaaacccaagggtcgattttggtgggctagacagctttctgaccacagagtgtggaaggatagcaggcttcaactgcaagaacggaatcgacttggagcaggtaacctggccagaaatgggtgttcatggagcaaggcagctgatgcaacttcaacagcagttctggcatggcgatttaacacatccacaccaagtggcttcacagtgggaaaagcgtggggatggccatcctcccgtctttagcaactccagtccctctctcttcggctatgatctaacaagctctggagcccagcaaaccccggcgagcaagctaaagacggagctttga

其编码的蛋白的氨基酸序列如序列2所示，编码359个氨基酸(末端终止子未计入，即序列中***号未计入)，其编码的蛋白的氨基酸序列如下：

实施例2玉米中zmbhlh-4亚细胞定位分析

转录因子的特征之一是定位于细胞核中，并在细胞核中执行其转录调控功能。为此，利用原生质体转化的方法在原生质体中对玉米zmbhlh-4蛋白的亚细胞定位进行了研究。

2.1载体构建：

利用gateway的lr反应将pdonr221载体上的zmbhlh-4重组到pk7wfg2载体，与gfp形成融合蛋白，由35s启动子驱动表达。

2.2玉米叶片原生质体的制备：

取三叶一芯期b73玉米的黄化苗，用刀片切成0.5mm宽的叶条。将切好的叶条放入预先配置好的酶解液(1.5％cellulaser10,0.4％macerozymer10,0.4mmannitol,20mmkcl,20mmmes,ph5.7,10mmcacl2,and0.1％bsa)中。用镊子帮助使叶子完全浸入酶解液，50转/分钟条件下酶解5h。

2.3原生质体的转化：

1)100g离心10分钟使原生质体沉淀在管底，然后用适量mmg溶液(0.4mmannitol,15mmmgcl2,and4mmmes,ph5.7)重悬原生质体，使之最终浓度在2×10⁵个/ml；

2)每100μl原生质体加入10μldna(10微克约5-10kb的质粒dna)至2ml离心管中，轻柔混合；

3)加入等体积110μlpeg溶液(30％peg[v/v],0.2mmannitol,and0.1mcacl2)，轻柔拍打离心管完全混合。诱导转化混合物10分钟；

4)100g离心2分钟去上清后，用1mlwi溶液(0.5mmannitol,20mmkcl，4mmmes,ph5.7)轻柔重悬原生质体；

5)室温下(20-25℃)诱导原生质体14小时以上。以上所有操作在室温下进行。

2.4gfp表达情况观察：

在激光共聚焦显微镜下观察gfp表达，图1示出了zmbhlh-4蛋白的亚细胞定位图，pcambia1302为空载体对照；zmbhlh-4为zmbhlh-4:gfp融合蛋白。结果表明zmbhlh-4:gfp(绿色荧光蛋白)的显示位置与细胞核染料hochest的染色结果重叠，说明zmbhlh-4定位于细胞核中。

实施例3转基因拟南芥的获得

3.1载体构建：

利用gateway的lr反应直接将pdonr221载体上的zmbhlh-4重组到植物表达载体pgwcvp64。转化e.coli，酶切鉴定后测序。获得pgwcvp64-zmbhlh-4质粒如图2所示，该质粒中，lb、rb为农杆菌转化的左右边界序列；bar为抗草铵膦基因；camv35s为启动子；pubi为玉米泛素启动子；attb1、attb2为重组位点；zmbhlh-4为目的基因；vp64为激活标签。将该质粒转化到农杆菌eha105中。

3.2拟南芥转化：

1)挑取阳性的农杆菌单菌落，接种于5ml的lb液体培养基(kan50mg/l，rif50mg/l)中，28℃，250rpm培养约20h；

2)将活化的菌液1:500转接入含200ml的yep培养基(kan50mg/l，rif50mg/l)的500ml锥形瓶中，28℃，200rpm继续培养约14h；至od600＝1.5～3.0时即可。

3)4℃，5000rpm离心10min，收集菌体，弃上清；

4)加入2倍体积10％蔗糖(含0.02％silwetl-77)，将菌体充 分悬浮。

5)转化前剪去拟南芥中已经长出的小果荚，将菌液置于于大培养皿中，花浸泡在菌液中约40s后取出，用吸水纸将残余菌液吸去，将浸染后的拟南芥倒置避光培养24h后正常培养，收集种子。

实施例4转基因植株的抗性筛选和pcr检测

4.1转基因植株的抗性筛选和pcr检测：

将收集到的t0代转基因拟南芥种子消毒后，播种在1/2ms培养基上(含bar20mg/l)，春化3天,放置于培养箱(22℃，光照16小时；18℃，暗8小时)中培养。约7天后在bar抗性培养板上出现黄化苗和绿苗，转基因植株表现为bar抗性，呈正常绿色，非转基因植株呈黄色。将绿苗移至1/2ms培养板上5天恢复生长后，转移至土中。当转移至土中的苗长至10-12片叶子时，提取基因组dna，进行pcr鉴定。

4.2拟南芥基因组的提取：

1)拟南芥苗生长到10-12片叶子时可剪取叶片，置于1.5ml离心管中，加入适量液氮，用预冷的玻璃研磨棒将其研磨成粉末，加入700μl的dna提取液(100mmnacl,100mmtris-hcl,ph8.5,50mmedta,1％sds)，60℃水浴30min；

2)加入200μl酚:氯仿(1:1)混匀后，4℃，12000rpm离心10min。

3)转移上清600μl，加入600μl异丙醇后混匀充分，-20℃放置15-20min。

4)4℃，12000rpm，15min离心后弃上清，75％乙醇洗涤dna。

5)加入30μl超纯水(内含无dna酶的20μg/ml胰rna酶)，37℃放置30min去除rna后，-20℃保存备用。

4.3pcr鉴定：

1)引物序列：

zmbhlh-4-704fw:5'–cacagagtgtggaaggatagc-3'；

rvvp64-104：5'-agcatcagatcccaacatg-3'。

2)反应体系如下：

加水到20μl。

3)pcr扩增条件：

共获得转基因拟南芥株系20株，取其中具有代表性的3个株系(zmbhlh-4-1、zmbhlh-4-2、zmbhlh-4-3)进行后续的实验。

实施例5过表达zmbhlh-4基因的拟南芥株系表型分析

5.1过表达zmbhlh-4拟南芥种子的萌发：

将过表达zmbhlh-4拟南芥的种子消毒后播种在1/2ms培养基上，4℃暗处理三天后，光照培养，并在不同时间点统计种子萌发率。以种子露白为萌发标志，每次每株系使用30颗种子，重复三次独立实验。图3示出了zmbhlh-4转基因拟南芥种子萌发结果；如图3所示，三个过表达zmbhlh-4拟南芥株系正常生长条件下种子萌发均早于野生型，说明在拟南芥中过表达zmbhlh-4可以促进种子的萌发。

5.2转zmbhlh-4拟南芥的莲座叶片：

选取三个过表达zmbhlh-4拟南芥株系，观察它们与野生型植株在生长 4周和8周时的莲座叶形态。图4示出了zmbhlh-4转基因拟南芥叶片表型结果图，结果表明过表达zmbhlh-4的三个株系叶片长宽比显著增大。

5.3过表达bhlh-4拟南芥的株型观察：

统计正常生长八周的过表达zmbhlh-4莲座上的花茎分支数及株高。每个株系统计20株。图5为zmbhlh-4转基因拟南芥植株表型图；图6为拟南芥植株分支数统计图，图7为拟南芥植株株高统计图。结果表明与野生型相比过表达zmbhlh-4植株矮化明显，分支数增多，花茎出现二次或者多次分支，叶片数也显著增加。

显然，上面描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。