一种楸树遗转化体系的构建方法与流程

本发明属于植物的遗传转化体系的构建方法领域，涉及一种楸树遗转化体系的构建方法。

背景技术：

楸树（catalpabungeic.a.mey）是紫葳科梓树属的落叶乔木，是中国珍贵的用材树种之一，在工业用材，园林观赏，生态防护，绿化城市方面有重要作用，被称之为“木王”。楸树利用历史悠久，是珍贵用材树种和著名园林观赏树种（唐玲等，2007年），其木材具有不翘裂、耐腐蚀、易加工、纹理美观等特点，专用来加工高档商品和特种产品。楸树树形优美，叶被密毛、皮糙枝密，有利于隔音、减声、防噪、滞尘，且对环境中多种有毒气体，诸如氯气和二氧化硫等具有较强吸收能力，是我国具有较高环保价值的重要园林绿化和观赏树种。楸树根系发达，属深根性树种，对于防治水土流失、阻滞风蚀、固定沙丘、保护农田起到了很好的作用。因此楸树具有重要的开发利用价值。

目前有关楸树育种研究、开发利用的情况如下，楸树自然状态下自交不亲和，结实率低；楸树的繁育多通过扦插与嫁接的方式，其技术环节多，育苗周期长，且长期的无性繁殖导致品种、类型和无性系单一化，且由于其自花不孕，常常使得楸树存在着华而不实的现象，给楸树优良品系的繁殖和推广利用造成很大的障碍，加之材质优良加剧了人们的开发利用，造成楸树资源的缺乏。此外，已经建立了楸树的器官发生再生体系和滇楸的体细胞胚发生体系，体细胞胚胎发生具有快速、高增殖率及高再生率等优点，能使楸树优良新品种快速繁殖。长期以来，楸树的遗传改良主要是通过杂交育种的方式进行，但林木所特有的许多生物学特性，如较长的生长周期和童期、高度杂合性和组培再生困难等，使得常规育种方法周期漫长，品种改良受到限制。利用现代分子生物学和基因工程技术，有望可以更加快速、高效地改变目标物种的性状特征，从而极大地加快了育种的速度、提高了育种的效率。目前尚未见报道楸树的遗传转化体系构建，限制了楸树分子遗传改良的发展。

技术实现要素：

本发明利用已建立的高效稳定的楸树体细胞胚胎发生体系，通过农杆菌介导法辅以超声波处理对胚性愈伤组织进行遗传转化，确立相关的遗传转化参数，进而将外源基因转入到楸树基因组中，建立有效的楸树遗传转化体系，能够为今后楸树性状的分子遗传改良奠定基础。

为此，本发明提供的技术方案为：

一种楸树遗传转化体系的构建方法，包括：以楸树胚性愈伤组织为转化受体，确立其潮霉素的临界致死浓度，再依次通过工程菌液的制备、胚性愈伤组织的侵染、超声波辅助处理、共培养和选择培养、瞬时表达检测和pcr检测。

1）胚性愈伤组织的潮霉素临界致死浓度的确定：将楸树幼胚诱导的胚性愈伤组织接种到附加不同浓度的潮霉素的选择培养基中培养统计存活率，得到胚性愈伤组织的潮霉素临界致死浓度；

2）农杆菌介导辅以超声波处理进行侵染转化：使用含有目的基因的农杆菌工程菌液对胚性组织进行侵染转化，侵染的同时进行超声波辅助处理；

3）侵染处理的胚性愈伤组织的共培养和选择培养：经过步骤2）侵染转化后将胚性愈伤组织置于增殖培养基中进行共培养，共培养后转置于选择培养基中进行转化子的选择培养，选择培养过程中未转化组织将被抗生素杀死，存活下来的抗性愈伤组织和再生植株可进行下一步的转化检测；

4）转化愈伤组织的报告基因瞬时表达和再生植株的pcr检测：对经过步骤3）共培养后的胚性愈伤组织进行报告基因的瞬时表达检测，对步骤3）选择培养过程中获得抗性再生植株进行pcr扩增检测；

完成楸树遗转化体系的构建。

优选的是，所述楸树遗传转化体系的构建方法中，在进行遗传转化之前，还包括受体材料的获得和保存：

取楸树未成熟果实的幼嫩种胚，依次经75%的酒精、2%的次氯酸钠溶液灭菌后，剥取幼嫩种胚为外植体，经过一系列诱导获得胚性愈伤组织材料在1/2ms培养基中继代保存，以此作为遗传转化受体。

优选地，所述步骤1）选择培养基为1/2ms固态培养基添加10-80mg/l的潮霉素，将0.3-0.4cm见方的小块胚性愈伤组织接种在附加10-80mg/l潮霉素的1/2ms固态培养基中，筛选胚性愈伤组织的临界致死浓度。

优选地，所述潮霉素临界致死浓度的筛选过程中，经过3周的培养确定胚性愈伤组织的临界致死浓度为60mg/l的潮霉素。经过3周的培养即可体现出潮霉素的筛选效果。

优选地，所述农杆菌侵染转化过程中，所述步骤2）制备好的农杆菌工程菌液重悬于1/2ms液体培养基中，菌液od600值为0.4-0.7，工程菌液中添加0.01-100μmol/l的乙酰丁香酮，胚性愈伤组织置于工程菌液中侵染处理10-30分钟，同时将工程菌液和愈伤组织置于50ml离心管中在15μm振幅的超声波处理1-5分钟，确保获得较好的转化效率。1/2ms液体培养基是植物培养基，适合植物组织和细胞的生长，菌液od600值是为了测定菌液的浓度，在一定范围内侵染效率高；添加乙酰丁香酮可提高诱导农杆菌侵染植物细胞的几率，天然状态下受伤的植物组织会分泌此类物质诱导农杆菌感染，通常100μmol/l时诱导效果最好；超声振幅也是经过比较后确定在15um下效果较好。

进一步优选地，所述侵染转化过程中工程菌液的浓度od600值为0.6-0.7，工程菌液中添加100μmol/l的乙酰丁香酮，工程菌液侵染胚性愈伤组织的时间为20分钟，在侵染的同时以15μm振幅的超声波处理3分钟。

优选地，所述步骤2）中的工程菌液制备和侵染转化处理所需总时间为2.5天，2天制备工程菌液，0.5天时间完成超净工作台中的侵染转化，完成侵染处理的胚性愈伤组织进行共培养。经过2天的培养制备，农杆菌细胞处于旺盛的对数生长期，有利于提高侵染转化效率。过长时间的培养会导致菌体老化，过短时间则菌液浓度低，侵染转化效率低。优选地，所述步骤3）共培养是将经步骤2）侵染后的胚性愈伤组织在黑暗条件下培养2-5天，使得t-dna区段导入到植物细胞中。在黑暗条件下农杆菌繁殖较快，易于通过创伤部位感染植物细胞。

进一步优选地，所述共培养时间为3天，能够获得较高的报告基因瞬时表达效率。共培养3天是比较好的时间节点，时间过长农杆菌生长过于旺盛，选择培养时难以除菌，培养时间过短的话，农杆菌生长量不足，侵染转化效率低。

优选地，所述选择培养过程中进行转化子的筛选，经过共培养后转入略低于潮霉素临界致死浓度和和400mg/l羧苄青霉素作为除菌剂的1/2ms固态培养基中进行转化子的筛选培养，培养基中潮霉素浓度≤经步骤1）确定的胚性愈伤组织潮霉素临界致死浓度，所述潮霉素临界致死浓度为60mg/l。

优选地，所述农杆菌与胚性愈伤组织的共培养过程中，培养条件为：黑暗条件下在1/2ms固态培养基中培养2-5天，使得t-dna区段导入到植物细胞中。

优选地，所述潮霉素临界致死浓度的筛选、选择培养的环境条件为：培养温度25±2℃，光照强度1000lx，光照时间16h/d；所述共培养的环境条件：温度25±2℃，黑暗时间24h/天。在此条件下，植物离体组织生长情况最好。

优选地，所述步骤4）报告基因的瞬时表达检测是将共培养后的胚性愈伤组织漂洗干净后置于gus染色液中进行染色，pcr检测是以目的基因的特异性引物对抗性再生植株的基因组dna进行扩增分析其整合与否。

本发明至少提供以下有益效果：

本发明提供了珍贵用材树种楸树的一种遗传转化体系的构建方法。该方法以楸树胚性愈伤组织为受体，通过农杆菌介导辅以超声波处理来建立稳定的遗传转化体系。以胚性愈伤组织作为转化受体的优势在于转化受体细胞数量巨大、胚性细胞分化再生能力强，转化细胞产生的体细胞胚胎可以直接分化发育成为完整再生植株。通过本发明建立的遗传转化体系，可用于楸树的分子遗传改良、种质资源创新提供新种质材料，也为其他林木用材树种的分子育种提供试验参考依据。

2、本发明以木本植物材料和胚性愈伤组织作为受体，相比草本植物，木本植物的体细胞胚胎再生体系建立困难，遗传转化效率低，本发明在建立稳定的楸树体胚发生体系基础上，以分化再生能力强的胚性愈伤组织为受体进行转化，可望提高其遗传转化效率。）

3、本发明的遗传转化方法首次以楸树的胚性愈伤组织为受体，侵染材料的转化群体大，胚性细胞再生能力强。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：

图1（1-a，1-b）遗传转化受体——楸树胚性愈伤组织；

图2（2-a，2-b，2-c，2-d，2-e，2-f）楸树胚性愈伤组织的潮霉素临界致死浓度筛选；

图3植物表达载体质粒的t-dna区段结构；

图4（4-a，4-b，4-c）转化组织中的gus报告基因的表达；

图5转aha基因楸树抗性再生植株的pcr检测；

图6aha基因转化株的pcr产物序列比对；

其中：图2-a潮霉素浓度0mg·l^-1，2-b潮霉素浓度10mg·l^-1，2-c潮霉素浓度20mg·l^-1，2-d潮霉素浓度40mg·l^-1，2-e潮霉素浓度60mg·l^-1，2-f潮霉素浓度80mg·l^-1；

图4-a为阴性对照，4-b为农杆菌介导法转化，4-c为超声波辅助农杆菌介导法转化；

图5中：泳道1-9为抗性再生植株，10为野生型阴性对照，11为质粒阳性对照，m为dl2000分子量marker。

具体实施方式

下面结合实施例来进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选在进行楸树的遗传转化体系构建之前，还包括：胚性愈伤组织的获得与保存，取楸树未成熟的种子，依次经75%的酒精、2%的次氯酸钠溶液灭菌后，剥取幼嫩种胚为外植体，经过一系列诱导获得胚性愈伤组织材料在1/2ms培养基中继代保存（具体方法另文发表），以此作为遗传转化受体。

在本发明的其中一个实例中，作为优选，所述潮霉素临街致死浓度筛选过程中，将0.3-0.4cm见方的小块胚性愈伤组织接种在附加10-80mg/l潮霉素的1/2ms固态培养基中，筛选胚性愈伤组织的临界致死浓度。

在本发明的其中一个实例中，作为优选，所述农杆菌侵染转化过程中，制备好的农杆菌工程菌液重悬于1/2ms液体培养基中，菌液od600值为0.4-0.7，工程菌液中添加0.01-100μmol/l的乙酰丁香酮，胚性愈伤组织置于工程菌液中侵染处理10-30分钟，同时将工程菌液和愈伤组织置于50ml离心管中，在15μm振幅的超声波处理1-5分钟，确保获得较好的转化效率。

在本发明的其中一个实例中，作为优选，所述农杆菌与胚性愈伤组织的共培养过程中，黑暗条件下在1/2ms固态培养基中培养2-5天，使得t-dna区段导入到植物细胞中。

在本发明的其中一个实例中，作为优选，所述选择培养过程中进行转化子的筛选，经过共培养后转入略低于潮霉素临界致死浓度的选择培养基中进行筛选，以获得相对较多的抗性愈伤组织和再生植株。

在本发明的其中一个实例中，作为优选，所述潮霉素临街致死浓度筛选、选择培养的环境条件为：培养温度25±2℃，光照强度1000lx，光照时间16h/d；所述共培养的环境条件：温度25±2℃，黑暗时间24h/天。

在本发明的其中一个实例中，所述楸树遗传转化体系的构建方法具体包括以下步骤：

（1）楸树胚性愈伤组织的获得

取楸树60天果龄未成熟的种子，依次经过75%的酒精、2%的次氯酸钠溶液灭菌后，剥取幼嫩种胚为外植体，经过一系列诱导获得胚性愈伤组织在1/2ms培养基中继代保存，作为遗传转化的受体材料。

（2）潮霉素临界致死浓度筛选

将所述获得的楸树胚性愈伤组织接种于附加不同浓度潮霉素的1/2ms固态培养中，培养温度25±2℃，光照强度1000lx，光照时间16h/d的条件下筛选培养3周。所述筛选培养基为1/2ms固态基本培养基，附加10-80mg/l的潮霉素，优选的临界致死浓度为60mg/l。

（3）农杆菌介导侵染转化胚性愈伤组织

确定楸树胚性愈伤组织的潮霉素临界致死浓度，通过农杆菌介导辅以超声波处理进行侵染转化处理，所述农杆菌工程菌液重悬于1/2ms液体培养基中，菌液od600值为0.4-0.7，工程菌液中添加0.01-100μmol/l的乙酰丁香酮，胚性愈伤组织置于工程菌液中侵染处理10-30分钟，同时将工程菌液和愈伤组织置于50ml离心管中，在15μm振幅的超声波处理1-5分钟。

优选的1/2ms液体培养基重悬工程菌液od600值为0.6-0.7，工程菌液中添加100μmol/l的乙酰丁香酮，胚性愈伤组织侵染处理20分钟，15μm振幅的超声波处理3分钟。

（4）共培养和选择培养

将侵染过的胚性愈伤组织进行共培养，所述共培养是在黑暗条件下、1/2ms固态培养基中培养2-5天。优选的共培养时间为3天。

共培养之后进行选择培养，所述选择培养是将共培养后的胚性愈伤组织转入附加略低于潮霉素临界致死浓度和400mg/l羧苄青霉素作为除菌剂的1/2ms固态选择培养基中进行筛选转化子，可提高筛选效率。优选的潮霉素选择压力为40mg/l。

（5）报告基因瞬时表达和再生植株的pcr检测

经过共培养后的胚性愈伤组织，取部分样本彻底漂洗后进行报告基因的瞬时表达检测，以未侵染转化的胚性愈伤组织作为阴性对照，gus染色液配方参照jefferson等（1987）方法稍作修改。

对选择培养获得的抗性再生植株进行pcr扩增检测，以再生植株的基因组dna作为模板，使用目的基因的特异性引物进行pcr扩增检测，如aha（异天南星甘露糖结合凝集素基因）基因、lea基因（晚期胚胎富集蛋白）的转化再生植株。

实施例1

ms基本培养基可参照文献（murashigetandskoogf.,1962）配制。gus染色液配方参照文献（jeffersonet.al.,1987）配制。

本发明所述楸树的遗传转化体系的构建方法中，包含以下步骤：

（1）楸树胚性愈伤组织的获得

取楸树60天果龄未成熟的种子，依次经过75%的酒精、2%的次氯酸钠溶液灭菌后，剥取幼嫩种胚为外植体；将所述的外植体置于一系列固体培养基中诱导，获得淡黄色胚性愈伤组织（图1（1-a，1-b）），以此作为遗传转化的受体材料。

（2）潮霉素临界致死浓度的筛选

将所述获得的楸树胚性愈伤组织接种于附加10-80mg/l浓度潮霉素的1/2ms固态培养中，培养温度25±2℃，光照强度1000lx，光照时间16h/d的条件下筛选培养3周。对照胚性愈伤组织在不含潮霉素的培养基中培养3周后（图2），所有组织均大量增殖，体胚开始分化同时伴随有次生胚的发育形成；在10mg/l（图2-b）的潮霉素选择培养基中，培养3周后有49%的胚性愈伤组织存活增殖，其余组织则褐化死亡；40mg/l（图2-d）潮霉素选择培养基中处理3周后有9%的材料存活，但生长严重不良；60mg·l-1（图2-e）潮霉素选择培养基中处理3周仅有5%的材料存活，几乎无生长；80mg/l（图2-f）及以上浓度处理的材料全部褐化死亡。由此确定，楸树胚性愈伤组织的潮霉素临界致死浓度为60mg/l。

（3）农杆菌介导侵染转化胚性愈伤组织

确定楸树胚性愈伤组织的潮霉素临界致死浓度，通过农杆菌介导辅以超声波处理进行侵染转化处理，分别使用含有aha基因（异天南星甘露糖结合凝集素基因）、lea基因（晚期胚胎富集蛋白）的植物表达载体（图3）对楸树胚性愈伤组织进行遗传转化。通过17批次的侵染转化和抗性筛选，优选的1/2ms液体培养基重悬工程菌液od600值为0.6-0.7，工程菌液中添加100μmol/l的乙酰丁香酮，胚性愈伤组织侵染处理20分钟，15μm振幅的超声波处理3分钟，黑暗条件下共培养3天后置于40mg/l潮霉素和400mg/l羧苄青霉素作为除菌剂的选择培养基中进行筛选，后期瞬时表达检测表明可以大大提高遗传转化效率。

⑷报告基因瞬时表达和再生植株的pcr检测

经过共培养后的胚性愈伤组织，取部分样本彻底漂洗后进行报告基因的瞬时表达检测，以未侵染转化的胚性愈伤组织作为阴性对照，gus染色液配方参照jefferson等（1987）方法稍作修改。

转化实验中发现，仅通过农杆菌介导侵染转化，共培养过程中农杆菌的附着生长情况不明显，几乎不可见，转化效率较低，gus报告基因表达的组织块较少，表达率仅为53.8%且斑块较小；而在侵染的同时通过3分钟的15μm振幅超声波处理，共培养过程中明显可见附着的农杆菌的生长，应该是通过超声波处理在光滑的胚性愈伤组织表面产生创伤，农杆菌的附着效率大大提高，gus报告基因在愈伤组织中的表达也验证了转化效率的提升，达到71.7%（图4注：4-a为阴性对照，4-b为农杆菌介导法转化，4-c为超声波辅助农杆菌介导法转化，表1）。

对选择培养获得的抗性再生植株进行pcr扩增检测，以再生植株的基因组dna作为模板，其中使用目的基因aha的特异性引物进行pcr扩增检测，引物序列如下：

sequencelisting1：aha-s：gggcaccaaccacctgctgtccg

sequencelisting2：aha-a：acgcgacaatggggcgcttcgag

结果表明5个抗性再生植株样本获得约770bp长度特异性片段，对aha转化株的pcr产物进行正向和反向测序，将测序结果与aha基因序列通过dnaman软件进行序列比对，结果表明序列一致性为95%，由此确定目的基因已整合到楸树基因组中，建立楸树的遗传转化体系。

实施例2

ms基本培养基可参照文献（murashigetandskoogf.,1962）配制。gus染色液配方参照文献（jeffersonet.al.,1987）配制。

本发明所述楸树的遗传转化体系的构建方法中，包含以下步骤：

（1）楸树胚性愈伤组织的获得

取楸树60天果龄未成熟的种子，依次经过75%的酒精、2%的次氯酸钠溶液灭菌后，剥取幼嫩种胚为外植体；将所述的外植体置于一系列固体培养基中诱导，获得淡黄色胚性愈伤组织（图1），以此作为遗传转化的受体材料。

（2）潮霉素选择的临界致死浓度筛选

将所述获得的楸树胚性愈伤组织接种于附加10-80mg/l浓度潮霉素的1/2ms固态培养中，培养温度25±2℃，光照强度1000lx，光照时间16h/d的条件下筛选培养4周。对照胚性愈伤组织在不含潮霉素的培养基中培养4周后，所有组织均大量增殖，体胚开始分化同时伴随有次生胚的发育形成；在10mg/l的潮霉素选择培养基中，培养4周后有50%的胚性愈伤组织存活增殖，其余组织则褐化死亡；40mg/l潮霉素选择培养基中处理4周后有10%的材料存活，但生长严重不良；60mg·l-1潮霉素选择培养基中处理4周仅有4%的材料存活，几乎无生长；80mg/l及以上浓度处理的材料全部褐化死亡（图2）。由此确定，楸树胚性愈伤组织的潮霉素临界致死浓度为60mg/l。

（3）农杆菌介导侵染转化胚性愈伤组织

确定楸树胚性愈伤组织的潮霉素临界致死浓度，通过农杆菌介导辅以超声波处理进行侵染转化处理，分别使用含有aha基因（异天南星甘露糖结合凝集素基因）、lea基因（晚期胚胎富集蛋白）的植物表达载体（图3）对楸树胚性愈伤组织进行遗传转化。通过17批次的侵染转化和抗性筛选，优选的1/2ms液体培养基重悬工程菌液od600值为0.5-0.6，工程菌液中添加80μmol/l的乙酰丁香酮，胚性愈伤组织侵染处理30分钟，15μm振幅的超声波处理3分钟，黑暗条件下共培养4天后置于50mg/l潮霉素和400mg/l羧苄青霉素作为除菌剂的选择培养基中进行筛选，后期瞬时表达检测和pcr检测表明可以大大提高遗传转化效率。

⑷报告基因瞬时表达和再生植株的pcr检测

经过共培养后的胚性愈伤组织，取部分样本彻底漂洗后进行报告基因的瞬时表达检测，以未侵染转化的胚性愈伤组织作为阴性对照，gus染色液配方参照jefferson等（1987）方法稍作修改。

转化实验中发现，仅通过农杆菌介导侵染转化，共培养过程中农杆菌的附着生长情况不明显，几乎不可见，转化效率较低，gus报告基因表达的组织块较少，表达率仅为50.8%且斑块较小；而在侵染的同时通过3分钟的15μm振幅超声波处理，共培养过程中明显可见附着的农杆菌的生长，应该是通过超声波处理在光滑的胚性愈伤组织表面产生创伤，农杆菌的附着效率大大提高，gus报告基因在愈伤组织中的表达也验证了转化效率的提升，达到73.7%（图4，表1）。

对选择培养获得的抗性再生植株进行pcr扩增检测，以再生植株的基因组dna作为模板，其中使用目的基因aha的特异性引物进行pcr扩增检测，引物序列如下：

sequencelisting1：aha-s：gggcaccaaccacctgctgtccg

sequencelisting2：aha-a：acgcgacaatggggcgcttcgag

结果表明5个抗性再生植株样本获得约770bp长度特异性片段（图5：注：泳道1-9为抗性再生植株，10为野生型阴性对照，11为质粒阳性对照，m为dl2000分子量marker），对aha转化株的pcr产物进行正向和反向测序，将测序结果与aha基因序列通过dnaman软件进行序列比对，结果表明序列一致性为95%（图6），由此确定目的基因已整合到楸树基因组中，建立楸树的遗传转化体系。

这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明—一种楸树遗传转化体系的构建方法的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

表1不同侵染转化方法的gus报告基因的表达率

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

sequencelisting

<110>三峡大学

<120>一种楸树遗转化体系的构建方法

<130>1

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>天南星（arisaemaheterophyllum）

<400>1

gggcaccaaccacctgctgtccg23

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<212>dna

<213>一种楸树遗转化体系的构建方法

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