本发明涉及生物
技术领域：
中，蛋白质及其在制备隐丹参酮中的应用。
背景技术：
药用植物有效成分的形成是植物次生代谢途径中特有基因表达的产物，随着植物功能基因组研究的广泛与深入，独具特色又有广阔应用前景的药用植物次生代谢合成相关功能基因的研究逐渐成为研究的热点，这些基因的克隆将为诠释药用植物有效成分的生物合成途径及其调控机制、为药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用前景。丹参为唇形科鼠尾草属药用植物丹参(salviamiltiorrhizabunge)的干燥根及根茎，具有祛瘀止痛，活血通经，清心除烦等功效，其主要有效成分包括脂溶性的丹参酮和水溶性的丹酚酸。其中丹参酮类主要包括隐丹参酮、丹参酮iia、丹参酮iib和二氢丹参酮等，具有扩张血管、抗血栓、抗菌消炎以及抗肿瘤、抗氧化等多种药理作用，在制药以及美容、化妆品等领域得到广泛应用。丹参酮类化合物为松香烷型二萜醌类化合物，其生物合成在萜类化合物前体物质合成的基础上，通过异戊二烯基转移酶(prenyltransferases，pt)的作用产生20个碳原子的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(geranylgeranyldiphosphate，ggpp)，ggpp进一步在丹参柯巴基焦磷酸合酶(s.miltiorrhizacopalyldiphosphatesynthase,smcps)和丹参类贝壳杉烯合酶(s.miltiorrhizaent-kaurenesynthase,smks)的作用下形成丹参类化合物的基本骨架次丹参酮二烯(miltiradiene)，在次丹参酮二烯的基础上经过甲基化和羟基化等形成丹参酮类化合物。cyp450酶为血红蛋白结合蛋白，在所有已知的cyp450酶中都存在一个保守的血红素结合域，是鉴定该基因的一个重要特征。拟南芥基因组中有272个cyp450基因，水稻基因组注释显示有457个cyp450基因。技术实现要素：本发明的目的是提供一种可以催化丹参新酮生成隐丹参酮的蛋白质。本发明首先提供了蛋白质在制备隐丹参酮中的应用；所述蛋白质名称为cyp71d375a，是下述a1)、a2)或a3)：a1)氨基酸序列是seqidno.2的蛋白质；a2)将序列表中seqidno.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；a3)在a1)或a2)的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质。为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中seqidno.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1、标签的序列标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl上述a2)中的cyp71d375a，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述a2)中的cyp71d375a可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述a2)中的cyp71d375a的编码基因可通过将seqidno.1所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。seqidno.1所示的dna分子编码seqidno.2所示的cyp71d375a蛋白质。本发明还提供了与cyp71d375a相关的生物材料在制备隐丹参酮中的应用；所述生物材料为下述b1)至b12)中的任一种：b1)编码cyp71d375a的核酸分子；b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体；b4)含有b2)所述表达盒的重组载体；b5)含有b1)所述核酸分子的重组微生物；b6)含有b2)所述表达盒的重组微生物；b7)含有b3)所述重组载体的重组微生物；b8)含有b4)所述重组载体的重组微生物；b9)含有b1)所述核酸分子的转基因细胞系；b10)含有b2)所述表达盒的转基因细胞系；b11)含有b3)所述重组载体的转基因细胞系；b12)含有b4)所述重组载体的转基因细胞系。上述应用中，b1)所述核酸分子可为如下b1)-b3)中任一种：b1)其编码序列是序列表中seqidno.1的cdna分子或dna分子；b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码cyp71d375a的cdna分子或基因组dna分子；b3)在严格条件下与b1)限定的核苷酸序列杂交，且编码cyp71d375a的cdna分子或基因组dna分子。其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码cyp71d375a的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的cyp71d375a的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码cyp71d375a且具有cyp71d375a功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码seqidno.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述应用中，所述严格条件是在2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×sspe(或0.1×ssc)、0.1％sds的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述应用中，b2)所述的含有编码cyp71d375a的核酸分子的表达盒(cyp71d375a基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达cyp71d375a蛋白质的dna，该dna不但可包括启动cyp71d375a基因转录的启动子，还可包括终止cyp71d375a基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35s：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("lap",chao等人(1999)plantphysiol120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(pr1)(由水杨酸和bth(苯并噻二唑-7-硫代羟酸s-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂ii启动子(pin2)或lap启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pf128(cn101063139b(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的启动子(beachy等人(1985)emboj.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(nos终止子)、花椰菜花叶病毒camv35s终止子、tml终止子、豌豆rbcse9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：odell等人(i985)nature313:810；rosenberg等人(1987)gene,56:125；guerineau等人(1991)mol.gen.genet,262:141；proudfoot(1991)cell,64:671；sanfacon等人genesdev.,5:141；mogen等人(1990)plantcell,2:1261；munroe等人(1990)gene,91:151；ballad等人(1989)nucleicacidsres.17:7891；joshi等人(1987)nucleicacidres.,15:9627)。可用现有的表达载体构建含有所述cyp71d375a基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pahc25、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb(cambia公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptii基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的epsps基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为酵母表达载体pesc-his。b3)所述重组载体可含有seqidno.1的dna序列。进一步b3)所述重组载体具体可为pesc-cyp。所述pesc-cyp为将pesc-his载体的ecori和speⅰ识别序列间的dna序列替换为seqidno.1所示的dna片段得到的能表达seqidno.2所示的cyp71d375a蛋白质的重组载体。上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，酵母可为wat11。上述应用中，所述转基因细胞系不包括繁殖材料。本发明还提供了隐丹参酮的制备方法，所述方法包括下述m1)或m2)：m1)利用cyp71d375a与丹参新酮进行反应得到隐丹参酮；m2)利用所述重组微生物或其发酵产物与丹参新酮进行反应得到隐丹参酮。上述方法中，m1)和m2)中所述反应的反应体系中均可含有nadph。上述方法中，m1)和m2)中所述反应的反应体系的ph均可为6.0-9.5，具体可为7.0-8.5。m1)和m2)中所述反应的反应体系具体可为向100mm的tric-hcl(ph7.5)中添加nadph、fad、fmn、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、dtt、cyp71d375a或所述重组微生物或其发酵产物和丹参新酮得到的液体，其中，nadph、fad、fmn、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、dtt的浓度分别为500μm、5μm、5μm、4mm、4mm、2mm。上述方法中，所述微生物可为酵母，如wat11。上述方法中，m2)可包括利用所述重组微生物的发酵产物制备的微粒体与丹参新酮进行所述反应得到隐丹参酮。所述微粒体可利用peg4000和nacl处理所述发酵产物制备得到。所述微粒体具体可按照包括如下步骤的方法制备：破碎所述发酵产物中的细胞，离心，弃沉淀，得到上清液，向该上清液中添加peg4000和nacl得到液体1；将所述液体1进行离心，弃上清液，得到沉淀，即所述微粒体。peg4000和nacl在所述液体1中的浓度可为5g/50ml和0.44g/50ml。上述方法还可包括从所述反应的反应产物中纯化得到隐丹参酮。本发明还提供了用于制备隐丹参酮的产品，所述产品包括下述c1)或c2)：c1)cyp71d375a与丹参新酮；c2)所述生物材料与丹参新酮。本发明发现了一种可以用于催化丹参新酮生成隐丹参酮的蛋白质cyp71d375a，cyp71d375a对于调节和生产丹参酮类化合物及培育高品质的丹参具有重要的理论及实际意义。附图说明图1为cyp71d375a基因编码蛋白质的酶促反应产物uplc-tof分析。其中，a：cyp微粒体(cyp71d375a反应)与空载微粒体(空载体反应)催化生成隐丹参酮总离子图；b：cyp71d375a催化产物峰隐丹参酮(cryptotanshinone)对应质谱图；c：隐丹参酮标准品质谱图。空载体反应为对照正己烷相的结果，cyp71d375a反应为cyp正己烷相的结果。图2为cyp71d375a基因编码的蛋白质催化丹参新酮(miltirone)至隐丹参酮图示。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的酵母表达载体pesc-his为agilent公司产品。下述实施例中的宿主菌wat11(philippe，etc.cloning,yeastexpression,andcharacterizationofthecouplingoftwodistantlyrelatedarabidopsisthaliananadph-cytochromep450reductaseswithp450cyp73a5*.[j]jbc,vol.272,19176–19186,1997)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。实施例1、cyp71d375a基因编码的蛋白质可以催化丹参新酮生成隐丹参酮本实施例提供了一个来源于丹参的cyp450基因——cyp71d375a基因，其序列为序列表中seqidno.1，cyp71d375a基因编码序列表中seqidno.2所示的蛋白质cyp71d375a。1、酵母表达载体的构建将酵母表达载体pesc-his的ecori和speⅰ间的dna片段替换为序列表中seqidno.1所示的cyp71d375a基因，得到重组质粒pesc-cyp，pesc-cyp能表达cyp71d375a蛋白质。2、cyp71d375a的诱导表达将步骤1的pesc-cyp导入宿主菌wat11中，得到重组菌，将该重组菌命名为wat11-pesc-cyp；将酵母表达载体pesc-his导入宿主菌wat11中，得到重组菌wat11-pesc，作为对照菌株。对wat11-pesc-cyp利用半乳糖进行诱导表达，将所得蛋白质制成cyp微粒体用于进行酶活检测。酵母外源基因诱导表达1)挑取wat11-pesc-cyp单克隆(菌斑)至10ml组氨酸缺陷培养基(sd-his/glucose)中，30℃250rpm振荡培养48h至静止生长期；2)3,000×g离心5min，收集菌体，用灭菌蒸馏水重悬；3)重复步骤2)两次；4)向菌体中加入50ml诱导表达培养基ypl(即将ypd培养基中的葡萄糖替换成等质量的半乳糖得到的培养基)，30℃50rpm振荡培养12～16h，得到发酵产物。酵母微粒体蛋白提取1)将上述发酵产物于3,000×g离心5min收集菌体，用5mltek(tek由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度为50mmtris-hcl、1mmedta和100mmkcl，ph7.4)重悬细胞(即1/10ypl体积)，室温放置5min，得到细胞悬浮液1；2)将步骤1)的细胞悬浮液1于3,000×g离心10min收集菌体，用500μl冰浴的tesb(tesb由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度为50mmtris-hcl、1mmedta和600mmsorbitol，ph7.4)(即1mltesb/100mlypl体积)重悬菌体，得到细胞悬浮液2；3)将步骤2)的细胞悬浮液2冷冻高压破碎细胞3次，12000rpm离心20min，取上清液，向上清液中加入peg4000和nacl(每50ml上清液中添加的peg4000和nacl的量分别为5g和0.44g)，得到液体1；4)将步骤3)的液体1冰浴15min，12000rpm离心20min，弃上清液；5)向步骤4)的沉淀(即cyp微粒体)中加入2mlteg(teg由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度为50mmtris-hcl、1mmedta和20％(体积百分比)甘油，ph7.4)，冰浴下，吹打溶解，得到cyp微粒体浓度约25mg/ml的液体，-80度保存备用。按照酵母外源基因诱导表达和酵母微粒体蛋白提取方法，将wat11-pesc-cyp替换为wat11-pesc，得到作为对照的含有对照微粒体的液体。3、丹参cyp71d375a的活性分析利用隐丹参酮生成体系制备隐丹参酮，该生成体系为向100mm的tric-hcl(ph7.5)中添加nadph、fad、fmn、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、dtt、步骤2的cyp微粒体和底物丹参新酮得到的液体，其中，nadph、fad、fmn、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、dtt、cyp微粒体和丹参新酮的浓度分别为500μm、5μm、5μm、4mm、4mm、2mm、500μg/ml和20mm。将上述反应体系于30℃反应4小时，得到反应产物。向反向产物中加入与反应产物等体积的正己烷萃取催化产物，收集正己烷相，将其记为cyp正己烷相，对cyp正己烷相进行uplc-qtof分析。uplc-qtof分析所用标准品为隐丹参酮(北京融诚鑫德科技发展有限公司，货号y-002-150802)。按照上述方法，将cyp微粒体替换为对照微粒体，对得到的对照正己烷相进行uplc-qtof分析。结果发现，cyp正己烷相与对照正己烷相相比在总离子图296(m/z)处有新物质产生，与隐丹参酮质谱图相一致，产物鉴定为隐丹参酮(图1)。说明cyp71d375a基因编码的蛋白质在丹参酮类化合物合成代谢途径中能催化丹参新酮生成隐丹参酮(图2)。将上述隐丹参酮生成体系中的100mm的tric-hcl(ph7.5)分别替换为100mm的tric-hcl(ph6.0)、100mm的tric-hcl(ph7.0)、100mm的tric-hcl(ph8.5)和100mm的tric-hcl(ph9.5)，其他均不变，得到不同ph的隐丹参酮生成体系，将不同ph的隐丹参酮生成体系于30℃反应4小时，检测反应产物，确定利用cyp微粒体制备隐丹参酮的ph范围。结果发现，在ph为6.0、7.0、8.5和9.5下，均可以得到隐丹参酮，而在ph为7.0和8.5时可以得到高产量的隐丹参酮，表明，在ph为6.0-9.5的条件下均可以利用cyp微粒体和丹参新酮制备隐丹参酮，制备隐丹参酮的最佳ph为7.0-8.5。实施例2：cyp71d375a基因的组织表达分析提取盛花期的丹参根、茎和叶的rna，利用逆转录试剂盒(fermentas)进行逆转录，以β-actin为内参，进行半定量pcr，半定量pcr的正向引物为：5’-ttattgaagaagccaccc-3’，反向引物为：5’-tgacctatgctgctccac-3’。结果表明cyp71d375a基因在丹参根中的表达明显比茎叶中高。<110>中国中医科学院中药研究所<120>蛋白质及其在制备隐丹参酮中的应用<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>1515<212>dna<213>丹参（salviamiltiorrhizabunge）<400>1atggagttcaacatcccatcaacactcatagctctactttcatttctcctctttctcctc60acgtttcgcaaatcgcgacgaatctcaaaattcgcgaacaattactcacacatcccaggt120cccaaaaccctccctctcatcggaaacctccatctcatgctacgcgccaccgtgccccac180cacatgttcagagacctcgccgccaaacacggcccccttatgcacctccagctgggcgag240atccacttcgtcgtcatctcatccgtcgacttcgcaaaacaagtggtgcgaacccacgac300ctcaacttcgccaaccgcccccgcgggctggtggcggagacgctctcctacaattacacg360gcgatcgtcttcaccccctacggcgaccactggcgccagctgcggaagatctgcacgctc420gagctcctgagcgcgcgccgcgtgcagtccttccgccacataagagaggaggagagcatg480catatgtgcgaatggatagcttcccgcgcgggatcgccggccaacctgtcggagaagctg540ttcttgacgtcgtacgatattattacgagggcggtggtcggggcgaggaccgcagagtgc600ggaacgatgacttctattattgaagaagccacccagttgggggcgggattcatgctggcc660gacctctatccttccgtcaaatggctgccgttgatcaccggagcccggttcaagatccgg720cggatgcatcggaaattagacaagctgttcagtagcatcgtggagcagcataggtcagca780ggtgatgctgcaggtgtgtttgaagatcttgtagatgttctgctcaagattcaacgagat840gggactgaattacctcttaccattgacaatatcaaagcggtggtgctggatatgttcatt900gcaggaactgacacgtcatccattaccatcgaatgggcaatgtcagagctgataagaaac960cccagcaaactcaacaaggcacaagaagaagtaagaaaggttttcgacgacaagggatac1020atagatgaagacaagtttgatgagctgaaatacctcaaattaatcatcaaagagactttg1080agattgcacccaccgttgccgtttctagtccccagaatcaacgcagaaagatgtgaaatc1140aatggatacgaaatcccagcaaaaaccacagtgattgtgaatgcatgggcactgggaagg1200gaccccaagtattggaaagatgcagacaagtttataccagagagattcgaggaaagctcc1260catgatttcaaagggaacaatctagaatacttaccctttggtgcaggaaggagaatgtgt1320cccggcatgtcgttcgggcttgccaatattgagcttccgcttgctatgcttctctatcat1380ttcgattggaagatgcctaaggggatccagaataaggatttggatatggcggaggccttc1440ggtgtcaccgttagaaagaaacaccatttgcatctgattcccactgttaaacgacctttg1500cgtgcagctgcttga1515<210>2<211>504<212>prt<213>丹参（salviamiltiorrhizabunge）<400>2metglupheasnileproserthrleuilealaleuleuserpheleu151015leupheleuleuthrphearglysserargargileserlyspheala202530asnasntyrserhisileproglyprolysthrleuproleuilegly354045asnleuhisleumetleuargalathrvalprohishismetphearg505560aspleualaalalyshisglyproleumethisleuglnleuglyglu65707580ilehisphevalvalileserservalaspphealalysglnvalval859095argthrhisaspleuasnphealaasnargproargglyleuvalala100105110gluthrleusertyrasntyrthralailevalphethrprotyrgly115120125asphistrpargglnleuarglysilecysthrleugluleuleuser130135140alaargargvalglnserphearghisileargglugluglusermet145150155160hismetcysglutrpilealaserargalaglyserproalaasnleu165170175serglulysleupheleuthrsertyraspileilethrargalaval180185190valglyalaargthralaglucysglythrmetthrserileileglu195200205glualathrglnleuglyalaglyphemetleualaaspleutyrpro210215220servallystrpleuproleuilethrglyalaargphelysilearg225230235240argmethisarglysleuasplysleupheserserilevalglugln245250255hisargseralaglyaspalaalaglyvalphegluaspleuvalasp260265270valleuleulysileglnargaspglythrgluleuproleuthrile275280285aspasnilelysalavalvalleuaspmetpheilealaglythrasp290295300thrserserilethrileglutrpalametsergluleuileargasn305310315320proserlysleuasnlysalaglnglugluvalarglysvalpheasp325330335asplysglytyrileaspgluasplyspheaspgluleulystyrleu340345350lysleuileilelysgluthrleuargleuhisproproleuprophe355360365leuvalproargileasnalagluargcysgluileasnglytyrglu370375380ileproalalysthrthrvalilevalasnalatrpalaleuglyarg385390395400aspprolystyrtrplysaspalaasplyspheileprogluargphe405410415glugluserserhisaspphelysglyasnasnleuglutyrleupro420425430pheglyalaglyargargmetcysproglymetserpheglyleuala435440445asnilegluleuproleualametleuleutyrhispheasptrplys450455460metprolysglyileglnasnlysaspleuaspmetalaglualaphe465470475480glyvalthrvalarglyslyshishisleuhisleuileprothrval485490495lysargproleuargalaalaala500当前第1页12