适用于荷花淹水胁迫基因表达研究的内参基因及其应用的制作方法

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及荷花淹水胁迫基因表达领域，尤其是适用于荷花淹水胁迫基因表达研究的内参基因及其应用。

背景技术：

荷花是多年生挺水植物，是我国十大名花中唯一的水生花卉，因花色丰富、群体花期长、叶色碧绿、深受人们的喜爱，加上寓意深刻、文化价值，是极好的水景园林美化植物和家庭园艺常用植物，在我国应用和分布都极其广泛。淹水胁迫：荷花是一种水生花卉，环境的变化使荷花时常要面对淹水胁迫影响。因此，耐淹水胁迫资源和基因的挖掘是荷花育种目标之一。

随着分子生物学研究的不断发展，功能基因研究已成为植物抗逆育种的重要手段，基因表达分析则是植物功能基因研究的基础。为了校正不同样本rna提取效率、质量、反转录效率及扩增效率上的差异，通常在基因表达分析中需要用到在细胞中表达恒定的基因即内参基因作为标准。在比较耐淹水品种基因表达差异的研究过程中，较多的涉及到应用qpcr验证和分析基因表达模式和水平，因此筛选淹水胁迫条件下稳定表达的内参基因对qpcr结果有着关键的作用。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供适用于荷花淹水胁迫基因表达研究的内参基因，本发明解决了荷花淹水胁迫基因表达研究中没有内参基因的现状。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

适用于荷花淹水胁迫基因表达研究的内参基因，内参基因包括：荷花肌动蛋白actin基因和核糖体蛋白18srna基因。

优选地，所述荷花肌动蛋白actin基因的核苷酸序列为seqidno.1。

优选地，所述核糖体蛋白18srna基因的核苷酸序列为seqidno.2。

优选地，荷花肌动蛋白actin基因的引物为seqidno.8、seqidno.9。

优选地，核糖体蛋白18srna基因的引物为seqidno.6、seqidno.7。

优选地，荷花肌动蛋白actin基因在荷花耐淹水胁迫基因筛选或研究中的应用。

优选地，核糖体蛋白18srna基因在荷花耐淹水胁迫基因筛选或研究中的应用。

本发明的有益效果是:

发明公开了2个用于研究荷花淹水胁迫基因表达的内参基因，并揭露了利用这2个基因为基础设计的实时荧光定量pcr引物，解决了荷花淹水胁迫基因表达研究中没有内参基因的现状，本发明的内参基因可在荷花应对淹水胁迫时稳定表达，所设计的实时荧光定量pcr引物用于荷花应对淹水胁迫时的基因表达分析，可提高研究的稳定性、可靠性和重复性。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例技术中的技术方案，下面将对实施例技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明18srna5的溶解曲线；

图2是actin的溶解曲线；

图3是ef1a的溶解曲线；

图4是β-tubulin的溶解曲线；

图5是histone的溶解曲线；

图6是erfb2-1的溶解曲线；

图7是erfb2-2的溶解曲线；

图8是本发明应用1的结果图；

图9是本发明应用2的结果图；

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

1、材料处理：以荷花种子为材料，尾部破壳后，在25℃及16h/day光照条件下浸种，胚轴发生1～2周后，选取芽长度一致的种子用于淹水胁迫试验。淹水胁迫时间为1h、2h、4h、12h。

2、荧光定量试验：rna提取采用叶芽材料，提取方法参照上海生工柱式植物总rna抽提纯化试剂盒说明书(产品编号：b518661-0100),cdna第一链合成参照上海生工m-mulv第一链cdna合成试剂盒说明书(产品编号：b532435-0020)。

根据5个内参候选序列，使用primerpremier5.0软件设计引物，引物序列及预计扩增片段长度如表1所示。

qpcr方法参照上海生工2xsgfastqpcrmastermix试剂盒说明书(产品编号：b639271-0005)。

表15个候选内参基因qpcr引物及预计扩增片段长度

表2淹水胁迫不同时间候选内参基因荷花叶片中的ct值

表3bestkeeper、genorm和normfinder三种软件对5个候选内参基因评价

ct值与基因表达量成反比，ct值越大，表达量越小。表2为淹水胁迫处理不同时间5个候选内参基因在荷花叶片中qpcr反应的ct值。结果表明，5个看家基因的ct值在21～32之间，actin的ct值最低，在21.2441～22.6662；histone的ct值最高，在27.4985～31.1361。说明各看家基因的表达量不同，有的差别较大。

bestkeeper、genorm和normfinder是三种常用的用于内参基因稳定性分析的软件。表3为3种软件对5个候选内参基因在不同时间淹水胁迫处理时间下qpcr反应的表达量稳定性分析结果。bestkeeper根据内参基因的ct值计算标准偏差，sd值越小，基因的稳定性越好，根据该软件分析，5个内参基因稳定性从高到低排序为18srna>actin>ef1a>β-tubulin>histone；genome根据平均表达稳定性指数m确定最稳定的内参基因，m值越大，基因的稳定性越低，根据该软件分析，5个内参基因稳定性从高到低排序为actin>18srna>ef1a>β-tubulin>histone；normfinder使用excel软件计算基因的稳定值m，m值越低，则该基因越稳定，根据该软件分析，5个内参基因稳定性从高到低排序为actin>18srna>ef1a>β-tubulin>histon。综合表现看，actin和18srna为淹水胁迫不同时间处理下表达量最稳定的2个基因。

内参基因的应用1

以18srna为内参基因，以淹水胁迫1h、2h、4h的荷花白洋淀红莲幼苗为材料，未淹水材料为对照，实时荧光定量pcr检测荷花erfb2-1基因在不同胁迫时间处理下的表达情况。荧光定量体系和反映程序参照实施例，荧光定量内参基因和目的基因erfb2-1均设3个重复孔，每个处理均为3个生物学重复，相对定量数据处理采用2-△△ct法，△△ct＝△ct处理样本-△ct对照样本。△ct＝△ct目的基因-△ct内参基因。各处理间差异采用excel进行统计分析。

结果如图8所示，淹水胁迫处理后，erfb2-1基因表达量有显著提高，其中以淹水胁迫第1个小时表达量最高，为对照的3.63倍。此后表达量呈现一个先降低后升高的趋势，淹水胁迫处理2小时、4小时erfb2-1基因表达量分别为对照的2.54倍和3.07倍。

内参基因的应用2

以actin为内参基因，以淹水胁迫1h、2h、4h的荷花普者黑白荷幼苗为材料，未淹水材料为对照，实时荧光定量pcr检测荷花erfb2-2基因在不同胁迫时间处理下的表达情况。

实施方法如应用1所示，结果如图9所示，淹水胁迫处理后，erfb2-2基因表达量无显著变化，淹水胁迫处理1小时、2小时、4小时erfb2-2基因表达量分别为对照的1.02倍、0.80倍和0.99倍。

图1-7是5个候选内参基因及应用提及的erfb2-1、erfb2-2基因的溶解曲线。出现单峰说明扩增产物特异性好，出现杂峰特异性差，存在非特异性扩增，如引物二聚体等。图1-7中的显示5个候选内参基因及erfb2-1、erfb2-2基因的溶解曲线均为单峰，无非特异扩增，试验结果可靠。

上述2个用于研究荷花淹水胁迫基因表达的内参基因，并揭露了利用这2个基因为基础设计的实时荧光定量pcr引物，解决了荷花淹水胁迫基因表达研究中没有内参基因的现状，本实施例的内参基因可在荷花应对淹水胁迫时稳定表达，所设计的实时荧光定量pcr引物用于荷花应对淹水胁迫时的基因表达分析，可提高研究的稳定性、可靠性和重复性。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

sequencelisting

<110>苏州市农业科学院

<120>适用于荷花淹水胁迫基因表达研究的内参基因及其应用

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