本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种采用滇龙胆内生真菌转化龙胆苦苷的方法，并成功转化、分离得到两个具有保肝活性的成分。
背景技术：
：龙胆（gentianaeradixetrhizoma），为龙胆科植物条叶龙胆gentianamanshuricakitag、龙胆g.scabrabge.、三花龙胆g.triflorapall.或滇龙胆g.rigescensfranch.的干燥根及根茎。始载于《神农本草经》，列为中品，是中医临床的常用中药，性味苦、寒，归肝胆经，能清热燥湿，泻肝胆火，用于湿热黄疸，阴肿阴痒，带下，湿疹瘙痒，肝火目赤，耳鸣耳聋，胁痛口苦，强中，惊风抽搐。其中，滇龙胆别名坚龙胆、南龙胆、蓝花根、龙胆草、雪山苦草等，是云南道地药材，云南彝药主要品种，又是众多企业生产苦胆草片、龙胆泻肝片等的重要原料，为保肝利胆之良药。龙胆中的主要活性成分为龙胆苦苷（gentiopicroside）、獐牙菜苦苷（swertiamarin）、獐牙菜苷（sweroside）等，其中，龙胆苦苷已经作为龙胆的质量控制指标成分，为《中国药典》（2015年版）所收载。现代药理实验发现，这些活性成分均具有显著的保肝利胆作用。龙胆苦苷可以明显保护ccl4所导致的肝损伤，降低谷丙氨转氨酶的受损释放，同时龙胆苦苷还可以明显增加胆汁流量和胆红素的浓度，具有显著保肝、利胆、抗炎、镇痛等药理作用。此类化合物为前体药物，经过肠道菌群或肝脏代谢后，在体内产生药效团，因而在整体动物水平上具有明显的药效（活性），在体外细胞或酶的水平上，却不表现出生物活性。内生真菌（endophyticfungi），是指那些在其生活史中某一段时期生活在植物组织内，对宿主植物没有引起明显病害症状的真菌。根据“内共生理论”学说，内生真菌与宿主在长期的进化过程中有遗传物质的交换，与宿主植物协同进化。近二三十年的研究发现，内生真菌几乎存在于所有已研究的植物中，具有丰富的物种多样性，参与调节植物生长，是植物病害生物防治的天然资源；次生代谢产物丰富，并能产生与宿主相同或相似的成分，研究前景广阔。由此推测，滇龙胆中的内生真菌能协助宿主合成一些宿主代谢所必须的类似物或前体化合物，是具有巨大潜力的资源领域。微生物转化，是通过微生物细胞或酶系对外源底物进行结构修饰和改造，而获得有价值的产物的生理生化反应。微生物转化是巨大的获取新天然化合物结构的宝库，可以有效保护药用资源、低碳环保。鉴于内生真菌与宿主协同进化，可能参与了次生代谢产物的合成，协助宿主合成了一些宿主代谢所必须的类似物或前体物质，且内生真菌中具有丰富的酶系，利用其进行生物转化可以获得有价值的衍生物，我们采用滇龙胆内生真菌转化龙胆苦苷，并获得了1对活性代谢产物。技术实现要素：本发明要解决的技术问题在于采用内生真菌成功转化龙胆苦苷，本发明涉及将底物中龙胆苦苷成分转化为如下1对活性代谢产物：5α-(hydroxymethyl)-6β-methyl-1h,3h-5,6-dihydropyrano[3,4-c]pyran-1(3h)-one（化合物a）；和5β-(hydroxymethyl)-6β-methyl-5,6-dihydropyrano[3,4-c]pyran-1(3h)-one（化合物b）的方法。本发明涉及化合物a在制备治疗肝损伤的组合物的应用。本发明涉及化合物b在制备治疗肝损伤的组合物的应用。本发明涉及化合物a在制备抗氧化的组合物的应用。本发明涉及化合物b在制备抗氧化的组合物的应用。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一株滇龙胆内生真菌及其转化龙胆苦苷的方法：其特征在于：为内生真菌直接发酵转化法，包括内生真菌的培养、发酵、底物的添加及产物制备。所述内生真菌为从滇龙胆中分离得到的一株内生真菌1-10，经18srdna鉴定为fusariumoxysporum；所述生物转化发酵液为pda液体发酵培养基：土豆200g，葡萄糖5g，煮后定容至1000ml，ph7.0；本发明所述的滇龙胆内生真菌转化龙胆苦苷的方法，包括如下具体步骤：a)滇龙胆内生真菌的分离①从滇龙胆新鲜植株的根、茎、叶、花中分离内生真菌：将新鲜植株分别采用水洗、75%酒精浸泡及5%次氯酸钠浸泡的方式消毒，接种于pda固体培养基，于28℃恒温培养箱中培养，直至长出真菌菌落；②分离过程中设立对照组，将消毒好的植株于空白培养基上翻滚接触，并将培养皿同样置于恒温箱中培养，观察是否有菌落产生，以确保内生真菌分离成功；③对分离得到的内生真菌进行反复纯化。b)生物转化活性的筛选：利用分离得到的内生真菌转化其宿主活性成分龙胆苦苷，并同时设立只发酵而不加入底物，及不含菌仅加入底物的对照组。①发酵：将菌株分别发酵，摇床条件为150rpm，28℃；②加入底物：发酵两天，待发酵瓶中菌丝生长旺盛时，加入龙胆苦苷继续摇床培养；③终止发酵：继续共培养7天，待底物基本转化后，加入双倍量甲醇终止反应，并进行q-tof-ms检测。c)生物转化放大实验将筛选得到的目标菌株进行大量发酵，并加大底物的投入量。d)分离转化产物①对生物转化完成的样品进行过滤，得到滤过液，用等体积的水饱和正丁醇分三次反复萃取，合并萃取液，减压浓缩挥干正丁醇。②所得残渣用甲醇溶解后，过mci柱（60cm，50gofmcigel）层析纯化，洗脱剂依次用水、meoh-h2o（50/50，80/20，v/v）梯度洗脱。③收集meoh-h2o（50/50，80/20，v/v）洗脱液，减压回收溶剂。残渣用甲醇复溶，经反相高效液相制备色谱，得到产物。e)产物分析及结构鉴定化合物a和化合物b的1h（400mhz）、13c（100mhz）nmr如下所示：结构鉴定为：化合物a化合物b分离转化产物的方法的优选过程：a)mci柱纯化的优选过程：洗脱剂依次用水、meoh-h2o（10/90、50/50，90/10，v/v）梯度洗脱（各2-3倍柱体积）；洗脱剂依次用水、meoh-h2o（20/80、50/50，80/20，v/v）梯度洗脱（各2-3倍柱体积）；经hplc检测，发现经水、meoh-h2o（50/50，80/20，v/v）洗脱（各2-3倍柱体积），目标产物主要集中在这两部分洗脱液中，故采用此洗脱条件。b)反相高效液相制备的优选过程：流动相a为纯水，流动相b为乙腈，梯度条件设为：a：b=11%：89%，时间为30mina：b=8%：92%，时间为30min经考察，梯度为a：b=8%：92%，时间为30min，比较适合化合物a/b的制备。化合物a和化合物b在反相制备液相中保留时间分别为约15min和18min。本发明具有如下有益效果：1)内生真菌易于培养，发酵过程易于控制。2)转化过程无污染、可控、安全、环保。3)转化率可达1-2.5%。本发明所述的保肝化合物的制备方法，为大量制备纯度较高的保肝化合物用于研究其生理活性及作用机制提供前提，具有应用前景。具体实施例实施例1从滇龙胆中分离得到的一株内生真菌fusariumoxysporumschl的方法从云南临沧采集野生滇龙胆完整植株，48小时内运送至上海中医药大学实验室进行内生真菌分离。滇龙胆内生真菌分离：将整个植株清除掉土壤，小心清洗干净，分为根、茎、叶、花部位，于流动自来水下冲洗1小时，在无菌操作台中用75%乙醇漂洗(20～30s)→无菌水冲洗4次→5%naclo溶液漂洗5min)→无菌水冲洗4次→75%乙醇漂洗(20～30s)→无菌水冲洗4次。无菌滤纸片吸干水分，切成5mm×5mm×1mm的小块，接种于pda固体培养基上，每个培养皿中接种4块，置28℃恒温培养箱中培养3～30d，观察到培养基上从各植物组织块内部向周围长出菌丝时，采用尖端菌丝挑取法把真菌转移到新的培养基上继续培养、转接，直至完全纯化。分离过程中设置对照组，采用经表面消毒的组织块在空白培养基上滚动，使组织块各表面接触到培养皿，与接种好的培养皿一起培养，对照培养皿上未长出菌落，说明表面消毒彻底。分离、纯化采用的培养基为pda固体培养基：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂18g，煮后定容至1000ml，ph7.0。通过以上步骤，从滇龙胆的新鲜叶中分离得到菌株fusariumoxysporumschl。实施例2滇龙胆内生真菌转化龙胆苦苷的方法将菌株1-10在无菌操作台中接种入pda液体发酵培养基，于28℃、150rpm培养。待48小时后，锥形瓶中真菌孢子丰富时，将底物龙胆苦苷加入，继续于28℃、150rpm培养。龙胆苦苷加入量为100mg/l。pda液体发酵培养基：土豆200g，葡萄糖5g，煮后定容至1000ml，ph7.0。250ml锥形瓶装入100ml培养基。实施例3q-tof-ms检测的方法使用的是watersacquitytmsynaptg2系统。色谱方法色谱柱使用watershsst31.8µm，2.1*50mm，柱温45℃。流动相a为0.1%fa水溶液（v/v），流动相b为乙腈，流速为0.4ml/min。采用梯度洗脱，方法如下：时间（min）05913141617a%98928272101098b%28182890902质谱方法毛细管电压为1.5kv；采样锥孔电压为45v；提取锥孔电压为4v；离子源温度为120℃；干燥气温度为400℃，流速为800l/h；锥孔气流速为50l/h。化合物a和化合物b在uplc中保留时间分别为约6.9min和7.1min。实施例4生物转化放大实验的方法将菌株fusariumoxysporumschl在无菌操作台中接种入pda液体发酵培养基，于28℃、150rpm培养。待48小时后，锥形瓶中真菌孢子丰富时，将底物龙胆苦苷加入，继续于28℃、150rpm培养7天。pda液体发酵培养基：土豆800g，葡萄糖20g，煮后定容至4000ml，ph7.0。250ml锥形瓶装入100ml培养基。共计40瓶发酵培养液，分别发酵并加入龙胆苦苷底物1000mg。实施例5分离转化产物的方法萃取：将锥形瓶中的培养液过滤，合并培养液，用三倍量的水饱和正丁醇萃取培养液，合并有机相，减压回收有机相，得到残渣。mci柱纯化：将残渣（800mg）用水和甲醇溶解、超声、上mci柱（60cm，含mci填料约50g）。甲醇洗脱2-3个柱体积，然后依次用水、meoh-h2o（50/50，80/20，v/v）洗脱（各2-3倍柱体积），收集meoh-h2o（50/50，80/20，v/v）洗脱液，将lc分析结果相同的组分合并、减压回收。反相高效液相制备：将残渣样品用甲醇复溶、过滤，上反相高效液相色谱制备。色谱柱：ymc-pa出口，ods-a，10µm，250*20mm。流动相：a为纯水，b为乙腈，梯度：a：b=8%：92%，时间为30min，制备得到化合物a和化合物b单体化合物，均为棕色粉末，分别为25mg、10mg。化合物a和化合物b在反相制备液相中保留时间分别为约15min和18min。实施例6保肝活性1.化合物对过氧化氢诱导的人肝细胞损伤的保护作用1.1实验材料、药品与仪器材料：正常人肝细胞系(hl-7702)购自中国科学院上海细胞库。用含10%的胎牛血清的rpmi-1640培养基培养。每毫升培养基均含有100单位青霉素和100单位链霉素，所有细胞均在含5%co2的37℃孵箱中培养，每3-4天传代一次；cck-8试剂盒。仪器：流式细胞仪，全自动酶标仪，co2培养箱，96孔培养板。1.2受试样品：化合物a、化合物b1.3cck-8法评价肝细胞的活力取对数生长期细胞，经0.25%胰蛋白酶消化后，用含10%fbs的dmem溶液重新悬浮，进行细胞计数，将稀释为含有5×106/l个hl-7702细胞的悬液接种于96孔培养板中，每孔接种5000个，待细胞长成至亚层，即可用于实验，选择长成对数生长期的细胞，换去原培养液，加入不同浓度的各代谢产物，37℃，50ml/lco2条件下培养24h，然后加入含量为2.0mmh2o2，100μl/孔，培养1h，造成h2o2损伤模型。加入cck-8孵育2h，用酶联免疫仪在波长450nm处测od值。每个药物浓度重复测5次。cellviability%=(药物组a_450)/(modea_450)×100%1.4化合物对损伤肝细胞的保护结果（1）实验过程中，分别做了化合物3个浓度（5、10、20um）的生物活性，化合物a在20um时对损伤的hl-7702细胞有保护作用，与模型组相比，具有显著性差异（p＜0.01）；化合物b在5um时对损伤的hl-7702细胞有保护作用，与模型组相比，具有显著性差异（p＜0.01）。化合物对tgf-β1诱导的肝星状细胞活化的抑制2.1实验材料、药品与仪器材料：人肝星状细胞系(lx-2)购自中国科学院上海细胞库；每毫升培养基均含有100单位青霉素和100单位链霉素，所有细胞均在含5%co2的37℃孵箱中培养，每3-4天传代一次。药品：化合物a、化合物b仪器：流式细胞仪，全自动酶标仪，co2培养箱，96孔培养板。2.2mtt法评价肝星状细胞(lx-2细胞)的增殖取对数生长期细胞，经0.25%胰蛋白酶消化后，用含10%fbs的dmem溶液重新悬浮，进行细胞计数，将稀释为含有5×106/l个lx-2细胞的悬液接种于96孔培养板中，每孔接种4000个，待细胞长成至亚层，即可用于实验，选择长成对数生长期的细胞，换去原培养液，然后加入不同浓度的各代谢产物同时加入tgf-β12.5ng/ml，37oc，50ml/lco2条件下培养24h，孵育结束后，加入mtt溶液，4h后1000rpm/min离心15min，弃上清，每孔再加入dmso溶液100μl在37℃下恒温20min，于酶联免疫仪在波长490nm处测od值。每个药物浓度重复测5次。inhibitionofcellviability%=(【"modea"】_"490""-药物组"a_490)/("mode""a"_"490")×100%2.3化合物对活化肝星状细胞的抑制化合物a在浓度为10μg/ml时对活化的肝星状细胞有一定抑制作用，与模型组相比，具有显著性差异（p＜0.01）；化合物b在浓度为20μg/ml时对活化的肝星状细胞有一定抑制作用，与模型组相比，具有显著性差异（p＜0.01）。结论：两个产物a和b均表现出了对损伤的hl-7702细胞有保护作用，及对活化的肝星状细胞的抑制作用，而它们的底物对活化的肝星状细胞没有抑制作用。实施例7化合物a的片剂的制备处方：化合物a1mg，淀粉94mg，硬脂酸镁5mg。制备工艺：取化合物a过筛，加淀粉、硬脂酸镁混合均匀，制成颗粒，干燥，压片，即得。实施例8化合物b的片剂的制备处方：化合物b1mg，淀粉94mg，硬脂酸镁5mg。制备工艺：取化合物b过筛，加淀粉、硬脂酸镁混合均匀，制成颗粒，干燥，压片，即得。最后有必要在此说明的是：上述内容只用于对本发明的技术方案作进一步详细说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。 sequencelisting <110>上海中医药大学 <120>一种采用滇龙胆内生真菌进行生物转化的方法 <160>1 <170>patentinversion3.3 <210>1 <211>1085 <212>dna <213>fusariumoxysporum <400>1 taccccgacctgcgaatggctcattatataagttatcgtttatttgaaaaaggatactac60 ttggataaccgtggtaattctagagctaatacatgctaaaaatcccgacttcggaaggga120 tgtatttattagattaaaaaccaatgcccttcggggctcactggtgattcatgataactc180 ctcgaatcgcatggccttgtgccggcgatggttcattcaaatttcttccctatcaacttt240 cgatgtttgggtattggccaaacatggttgcaacgggtaacggagggttagggctcgacc300 ccggagaaggagcctgagaaacggctactacatccaaggaaggcagcaggcgcgcaaatt360 acccaatcccgacacggggaggtagtgacaataaatactgttttagggctcttttgggtc420 ttgtaattggaatgagtacaatttaaatcccttaacgaggaacaattggagggcaagtct480 ggtgccagcagccgcggtaattccagctccaatagcgtatattaaagttgttgtggttaa540 aaagctcgtagttgaaccttgggcctggctggccggtccgcctcaccgcgtgtactggtc600 cggccgggcctttccctctgtggaaccccatgcccttcactgggtgtggcggggaaacag660 gacttttactgtgaaaaaattagagtgctccaggcaggcctatgctcgaatacattagca720 tggaataatagaataggacgtgtggttctattttgttggtttctaggaccgccgtaatga780 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