基因突变检测用引物对、试剂盒及靶向测序文库构建方法与流程
本发明涉及肿瘤分子标记物的测序方法，尤其是涉及一种基因突变检测用引物对、试剂盒及靶向测序文库构建方法。
背景技术：
随着对与疾病相关的基因信息不断深入的了解，获取基因序列数据在分子水平了解人类的健康状况已然成为现实。对于特定个体，采用扩增子测序方法对目标区域进行测序是高效而便捷的选择，iontorrent测序仪因其操作简单、过程快速且经济实惠更适用于靶向基因的扩增子测序。
测序仪器确定后，测序材料的选择便成为首先要面对的问题。血液中的游离核酸由于其特有的无创性和可重复获取的特点成为理想的样品，但由于游离核酸微量的特性而使得测序极具挑战性。目前普遍认为造成难度增加的主要原因一方面是由于起始样品量较少时，分子间碰撞几率降低且容易受到其他物质的干扰，而使得连接和扩增的反应较难顺利完成；另一方面是处理样品的过程步骤过多导致污染从而导致建库失败。
中国专利cn103668471b公布了一种构建dna高通量测序文库的方法及其配套试剂盒，具体地，该发明提供了一种基于核酸样品构建测序文库的方法，所述方法包括：对用于构建测序文库的核酸样品进行变性处理使其解链为单链核酸，将其与第一衔接子进行退火反应和连接反应，从而形成“第一衔接子-单链核酸”复合物；将所述复合物吸附于磁珠，与第二衔接子进行退火反应和连接反应，从而形成吸附有“第一衔接子-单链核酸-第二衔接子”复合物的磁珠，将经清洗的磁珠进行pcr反应，获得扩增产物，用于构建测序文库。但是上述方法不适用于血液中的游离核酸测序。
技术实现要素：
本发明的目的就是为了针对血浆这类低量核酸文库构建困难的问题，而提供基因突变检测用引物对、试剂盒及靶向测序文库构建方法，本发明的方法除了对血浆这类低量核酸适用外，同时也可以用于其他常规样品的靶向高通量测序文库构建。上述基因突变包括基因的突变、基因缺失或基因插入。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明第一方面提供技术方案一，也就是基因突变检测用引物对。
基因突变检测用引物对，包括正向链与反向链，
所述的正向链包括iontorrent测序平台所必须的测序接头a、用以区别不同检测样品的特定核酸序列、及用以对样品中靶向基因目的片段进行捕获和扩增的捕获目的片段上游引物序列；
进一步地，所述的正向链结构为：5’-ccatctcatccctgcgtgtctccgactcag|barcode|gat|捕获目的片段上游引物序列-3’，其中，第1-30位下划线序列以及第37-39位序列为测序接头a，barcode为由5位序列组成的特定核酸序列，第39位以后序列为捕获目的片段上游引物序列。
捕获目的片段上游引物序列是依据cosmic网站公布的对癌症病人的测序结果的汇总数据结合在线引物设计软件primer3进行分析，通过大量的实验得出的序列，以保证了序列对目的片段扩增时的高效性和特异性。
所述的反向链包括iontorrent测序平台所必须的测序接头trp1、及用以对样品中靶向基因目的片段进行捕获和扩增的捕获目的片段下游引物序列。
进一步地，所述的反向链结构为：5’-cctctctatgggcagtcggtgat|捕获目的片段下游引物序列-3’，其中，第1-23位下划线序列为测序接头trp1，第23位以后序列为捕获目的片段下游引物序列。
捕获目的片段下游引物序列同样是依据cosmic网站公布的对癌症病人的测序结果的汇总数据结合在线引物设计软件primer3进行分析，通过大量的实验得出的序列，以保证了序列对目的片段扩增时的高效性和特异性。
为了对目标片段进行双向测序，我们需要对每个目标片段都使用两对引物从而生成两个库。我们选择的目标区域分别是189-200bp的长度，产生库长度分别是251-262bp。
其中iontorrent测序平台选购自thermofisherscientific公司。
其中特定核酸序列是在同时对多个不同检测样品检测时用以区别不同的检测样品。所述的特定核酸序列为5个核苷酸长度的序列，其由4种核苷酸进行自由组合，同时排除3个连续相同的核苷酸的组合。
进一步地，所述的特定核酸序列中，在最后两位设置gc组合代表正向测序，at组合代表方向测序。当需对多样品进行测序时，只需更换带有不同的barcode序列的引物进行捕获和扩增，从而可以完成对多达50个样品的测序文库的构建。
当所捕获靶向基因目的片段不同时，需要对捕获目的片段上游引物序列以及捕获目的片段下游引物序列进行单独设计，也就是对于不同靶向基因目的片段时，引物对中捕获目的片段上游引物序列以及捕获目的片段下游引物序列是不同的。
下面给出了捕获egfr的第18外显子目的片段、第19外显子目的片段、第20外显子目的片段、第21外显子目的片段及kras的第2外显子目的片段、第3外显子目的片段时捕获目的片段上游引物序列及捕获目的片段下游引物序列的具体设计。egfr的第18外显子目的片段、第19外显子目的片段、第20外显子目的片段、第21外显子目的片段及kras的第2外显子目的片段、第3外显子目的片段均是肺癌常见基因突变片段。
当所述的基因突变检测用引物对用于捕获egfr的第18外显子目的片段时，其中egfr的第18外显子目的片段序列如seqidno.1所示，捕获目的片段上游引物序列如seqidno.7所示，捕获目的片段下游引物序列如seqidno.8所示。
当所述的基因突变检测用引物对用于捕获egfr的第19外显子目的片段时，其中egfr的第19外显子目的片段序列如seqidno.2所示，捕获目的片段上游引物序列如seqidno.9所示，捕获目的片段下游引物序列如seqidno.10所示。
当所述的基因突变检测用引物对用于捕获egfr的第20外显子目的片段时，其中egfr的第20外显子目的片段序列如seqidno.3所示，捕获目的片段上游引物序列如seqidno.11所示，捕获目的片段下游引物序列如seqidno.12所示。
当所述的基因突变检测用引物对用于捕获egfr的第21外显子目的片段时，其中egfr的第21外显子目的片段序列如seqidno.4所示，捕获目的片段上游引物序列如seqidno.13所示，捕获目的片段下游引物序列如seqidno.14所示。
当所述的基因突变检测用引物对用于捕获kras的第2外显子目的片段时，其中kras的第2外显子目的片段序列如seqidno.5所示，捕获目的片段上游引物序列如seqidno.15所示，捕获目的片段下游引物序列如seqidno.16所示。
当所述的基因突变检测用引物对用于捕获kras的第3外显子目的片段时，其中kras的第3外显子目的片段序列如seqidno.6所示，捕获目的片段上游引物序列如seqidno.17所示，捕获目的片段下游引物序列如seqidno.18所示。
以上序列均是更适用于正向测序，如果需要反向测序时，只需要将用以捕获目的片段的正反向链中的捕获目的片段上游引物序列与捕获目的片段下游引物序列的序列部分进行交换即可完成反向测序。
本发明第二方面提供技术方案二，也就是提供一种靶向测序文库构建方法。
一种靶向测序文库构建方法，采用权利要求1-11中任一项所述的引物对，结合天根试剂和hifi试剂建库方法，对样品中靶向基因目的片段进行捕获和扩增，用以对血浆中游离核酸构建不同样品文库；具体包括以下步骤：
1)从血浆中提取游离核酸；
2)对步骤1)提取得到的游离核酸进行质量控制，并调整模板量来达到其后操作的一致性；
3)以权利要求1-11中任一项所述的引物对对步骤1)提取到的游离核酸进行pcr扩增并纯化回收，在这一扩增过程中，靶向基因目的片段被连接上测序接头a和测序接头trp1的同时添加了用以区别不样品的特定核酸序列；
4)使用qubit仪器对步骤3)回收片段进行精确定量后将不同样品等摩尔数混合，并使用beckman的磁珠进行纯化；
5)使用agilent2100(美国agilent公司)进行质量控制，然后在thermofisherscientific公司的iontorrent测序平台进行测序；
6)进行生物信息分析。
如果需要对不同样品进行建库时，则在步骤3)中可以更换带有不同特定核酸序列的引物对对步骤1)中产物进行捕获和扩增。
如果需要对不同目的片段进行捕获和扩增时，则在步骤3)中就可以更换带有不同捕获目的片段上游引物序列及捕获目的片段下游引物序列的引物对对步骤1)中产物进行捕获和扩增。
其中，步骤1)中，使用天根生化科技(北京)有限公司血浆中提取游离核酸试剂盒，即血清/血浆游离dna提取试剂盒dp339，具体操作按其试剂盒说明书操作。
其中，步骤2)中，进行质量控制是指提取物模板为5ul提取物。调整后样品是否pcr质量一致是通过琼脂糖凝胶电泳分析确定的，琼脂糖电泳所用的胶浓度为4％，电泳条件为50ma稳流电泳一小时，其中核酸marker为宝生物公司的20pb的dnaladdermarker，上样量为5ul。
其中，步骤2)中调整模板量是指对不同质量的模板进行优化时，主要是提高或降低模板的使用浓度，最终达到的一致性判断标准为不同模板间扩增产物相差不能产生数量级的差别，使用天能凝胶成像仪自带软件进行判断。
其中，步骤4)中qubit仪器进行精确定量时采用ng级的超微量定量试剂盒，并且必须做到每10个样品，使用标准品矫正一次。
本发明第三方面提供技术方案三，也就是提供一种靶向测序文库构建用试剂盒，尤其是适用于血浆中游离核酸样品的高通量测序文库的构建。
一种靶向测序文库构建用试剂盒，包括以下内容：
a)2*gchifipcrdnapolymerase的混合液，该混合液包含有高保真的核酸扩增酶1u/25μl，100mmkcl，20mmtris-cl，3mmmgso4和0.4mmdntp；
b)权利要求1-11中任一项所述的引物对的正向链：用以给样品中靶向基因目的片段加上附着端的核酸序列以及用以区分不同样品来源的特定核酸序列；
c)权利要求1-11中任一项所述的引物对的反向链：用以给样品中靶向基因目的片段添加游离端的接头；
d)磁珠：用于文库的浓缩与纯化；
e)对照核酸样品：用以在文库构建过程中做阳性对照，以保证验证试剂盒的有效性；
f)试剂盒的说明书。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
1、使用高效的保真聚合酶及高度特异性核酸片段，将微量的dna样品进行一次扩增的同时完成对添加5'及3'接头的处理，在其后的电泳凝胶和胶回收时去除杂质和多余带有接头序列的小片段，得到产物纯度高且已包含双向测序接头，可以直接用于iontorrent高通量测序。
2、本发明最大程度去除了杂质，在其后的电泳凝胶和胶回收时去除杂质和多余带有接头序列的小片段，得到产物纯度高且已包含双向测序接头，可以直接用于iontorrent高通量测序。
3、本发明适用于各种dna构建高通量测序文库，且所需都是常规实验技术及容易购买的试剂，条件易得，且操作简便，一般实验技术人员在此试剂盒的简要说明指导下都可以在短时间掌握。
附图说明
图1为构建高通量测序文库流程图；
图2为基于500ul血浆提取游离核酸的构建的dna测序文库的电泳图；
图3为调整后样品pcr质量达到一致(琼脂糖凝胶电泳分析)；
图4为agilent2100(美国agilent公司)检测文库质量检测结果图；
图5为高通量测序结果一；
图6为高通量测序结果二。
本发明序列表部分，其中序列1-6为设计捕获的目的片段，序列7-18为设计用以捕获目的片段引物的捕获序列部分。详细阐述如下：序列1为egfr第18外显子目的片段；序列2为egfr第19外显子目的片段；序列3为egfr第20外显子目的片段；序列4为egfr第21外显子目的片段；序列5为kras第2外显子目的片段；序列6为kras第3外显子目的片段；序列7为捕获egfr第18外显子目的片段上游引物序列；序列8为捕获egfr第18外显子目的片段下游引物序列；序列9为捕获egfr第19外显子目的片段上游引物序列；序列10为捕获egfr第19外显子目的片段下游引物序列；序列11为捕获egfr第20外显子目的片段上游引物序列；序列12为捕获egfr第20外显子目的片段下游引物序列；序列13为捕获egfr第21外显子目的片段上游引物序列；序列14为捕获egfr第21外显子目的片段下游引物序列；序列15为捕获kras第2外显子目的片段上游引物序列；序列16为捕获kras第2外显子目的片段下游引物序列；序列17为捕获kras第3外显子目的片段上游引物序列；序列18为捕获kras第3外显子目的片段下游引物序列。
具体实施方式
本发明基于血浆中游离核酸样品的高通量测序文库的构建方法，如图1所示，所述方法及步骤如下：
a、取出冻存于-80度冰箱的血浆，使用试剂盒提取游离核酸；
b、对提取的核酸样品进行变性处理，成为单链，提取得到的游离核酸进行质量控制，并调整模板量来达到其后操作的一致性；由于不同批次的样品质量会有所不同，因此需要进行质量控制。如图2所示，就是不同的样品的质量会有差异，但经过调整后能达到一致，如图3所示。
c、退火，使得引物对结合到目的片段上去，由于反向链上有测序接头trp1序列，从而可以保证测序时测序引物能结合其上；正向链上的测序接头a序列能保证测序时能结合磁珠上，从而将片段固定在电极上。同时又由于这对引物上含有所测目的片段的序列，从而保证了目的片段的扩增。
d、延伸，通过72度延伸，对捕获的微量游离核酸被的靶向序列进行扩增；
e、将b-d过程进行25个循环，从而保证下面实验的需要的足够的用量，同时使得目的片段在样品中获得绝对的多量；
f、对上一步骤中获取片段进行清洁回收；
g、对不同来源的测序样品，采用带有不同标记序列的引物，使用步骤b-f进行加标签和a序列及trp序列；
h、对于已获取处理好的片段采用nanodrop2000超微量分光光度计做初步的定量，精确定量采用
i、取定量后的样品同样量，充分混匀后，采用beckman的磁珠进行纯化，由于磁珠的高效性，从而最大程度上减少样品损失和试验时间的高效性；
j、使用agilent2100(美国agilent公司)进行质量控制，然后在thermofisherscientific公司的iontorrent测序平台进行测序；
k、进行生物信息分析。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
下述实施例中所述方法如无特别说明均为常规方法，所用核苷酸序列均由上海invitrogen生物公司合成。所用核酸提取试剂为天根生化科技(北京)有限公司的产品，核酸回收试剂盒为axygen公司产品，磁珠为beckman产品，聚合酶为c&m公司的高保真hifi聚合酶，所用水均为超纯水。
实施例1
一、质量检测。
1、血浆质量的控制：检测样品质量需要控制，由于目前对血浆中游离核酸的稳定性并不明确，故而对样品的质量控制尤为重要，主要对采血后保存及加抗凝新鲜血液中及时分离提取血浆。
二、血浆中游离核酸的提取。
2.使用天根的血浆游离核酸的提取试剂盒来提取血浆中的游离核酸，具体步骤按照试剂盒操作说明书进行。
3.对上述回收产物进行质量控制，主要是使用荧光定量pcr的方法定量检测看家基因cyc基因的方法来进行严格的质控。其反应体系和反应条件如下：
反应体系：
5uloftaqmangenotypingmastermix(2x),
1ulofcycpcrassay(10x),
4ulofh2o
反应条件:
反应总共50循环，预扩增5个循环，接着45个循环，在45个循环时收集数据。
三、对游离核酸进行扩增，同时加上接头和样品标记序列。
4.对步骤3中的检验合格的纯化游离核酸片段进行加pcr：
反应体系和条件如下:
充分混匀
反应条件:
四、对游离核酸进行反向扩增，同时加上接头和样品标记序列，但此时的所用的引物与步骤三相对应。
5.加入引物对，引物对包括正向链与反向链，
正向链具体结构如下：
5’-ccatctcatccctgcgtgtctccgactcag|barcode|gat|捕获目的片段上游引物序列-3’，其中，第1-30位下划线序列以及第37-39位序列为测序接头a，barcode为由5位序列组成的特定核酸序列，第39位以后序列为捕获目的片段上游引物序列。
反向链具体结构为：
5’-cctctctatgggcagtcggtgat|捕获目的片段下游引物序列-3’，其中，第1-23位下划线序列为测序接头trp1，第23位以后序列为捕获目的片段下游引物序列。
为了对目标片段进行双向测序，我们需要对每个目标片段都使用两对引物从而生成两个库。我们选择的目标区域分别是189-200bp的长度，产生库长度分别是251-262bp。
其中特定核酸序列是在同时对多个不同检测样品检测时用以区别不同的检测样品。所述的特定核酸序列为5个核苷酸长度的序列，其由4种核苷酸进行自由组合，同时排除3个连续相同的核苷酸的组合。
使用时，所述的特定核酸序列中，在最后两位设置gc组合代表正向测序，at组合代表方向测序。当需对多样品进行测序时，只需更换带有不同的barcode序列的引物进行捕获和扩增，从而可以完成对多达50个样品的测序文库的构建。
当所捕获靶向基因目的片段不同时，需要对捕获目的片段上游引物序列以及捕获目的片段下游引物序列进行单独设计，也就是对于不同靶向基因目的片段时，引物对中捕获目的片段上游引物序列以及捕获目的片段下游引物序列是不同的。
当所述的基因突变检测用引物对用于捕获egfr的第18外显子目的片段时，其中egfr的第18外显子目的片段序列如seqidno.1所示，捕获目的片段上游引物序列如seqidno.7所示，捕获目的片段下游引物序列如seqidno.8所示。
当所述的基因突变检测用引物对用于捕获egfr的第19外显子目的片段时，其中egfr的第19外显子目的片段序列如seqidno.2所示，捕获目的片段上游引物序列如seqidno.9所示，捕获目的片段下游引物序列如seqidno.10所示。
当所述的基因突变检测用引物对用于捕获egfr的第20外显子目的片段时，其中egfr的第20外显子目的片段序列如seqidno.3所示，捕获目的片段上游引物序列如seqidno.11所示，捕获目的片段下游引物序列如seqidno.12所示。
当所述的基因突变检测用引物对用于捕获egfr的第21外显子目的片段时，其中egfr的第21外显子目的片段序列如seqidno.4所示，捕获目的片段上游引物序列如seqidno.13所示，捕获目的片段下游引物序列如seqidno.14所示。
当所述的基因突变检测用引物对用于捕获kras的第2外显子目的片段时，其中kras的第2外显子目的片段序列如seqidno.5所示，捕获目的片段上游引物序列如seqidno.15所示，捕获目的片段下游引物序列如seqidno.16所示。
当所述的基因突变检测用引物对用于捕获kras的第3外显子目的片段时，其中kras的第3外显子目的片段序列如seqidno.6所示，捕获目的片段上游引物序列如seqidno.17所示，捕获目的片段下游引物序列如seqidno.18所示。
扩增反应体系和条件如下:
充分混匀
反应条件:
6.配制2％的琼脂糖凝胶电泳，如图2、3所示，按摸索条件后的扩增；扩增产物采用axygen公司的胶回收试剂盒进行回收。
7.将步骤4和6中的回收产物nanodrop进行定量，并详细记录以便对qubit的定量结果做对照。
五、对双链扩增产物进行定量和混合。
8.将步骤7中回收的产物，按照测序数据量将不同样品的连接产物进行等量混合精准定量后按最低量进行等量混合，即为所构建的文库。
9.将步骤8中混合产物使用beads进行浓缩和纯化两次；浓缩和纯化过程严格按照使用说明书进行；取出1u1进行agi1ent2100(美国agi1ent公司)检测，结果表明，得到文库大小为251-262bp，如图4所示。
10.将步骤9中的纯化产物进行qubit荧光定量仪进行精准定量。
六、文库库检和上机。
11.将步骤9中所得的纯化产物稀释到1ng/u1，取出1u1用于agi1ent2100(美国agi1ent公司)检测，根据检测结果，决定上机浓度。
12.根据步骤1所得的浓度，将文库稀释到上机要求后，在thermofisherscientific公司的iontorrent测序平台进行测序。
七、上机结果质控。
利用上述方法对50个肺癌病人的血浆样品进行建库。
结合图5、6所示，结果分析如下:建库的有效率为94％，所以此次测序质量良好。
adapter污染率:如图5、6所示，测序总次数是11,302,447，空接头为115，占比0.001<1％。adapterrate在5％以下认为正常，所以此次建库adapterrate正常。
数据量:此次测序目标数据1000m，实际数据721.66m左右，少了78.44m数据。且各个样品得到的数据虽有所差异，但最少的测序深度也到到10000次以上，能符合临床样品检测的要求。
综上所述此次建库合格，测序质量良好。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
<110>同济大学
<120>基因突变检测用引物对、试剂盒及靶向测序文库构建方法
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<213>人工序列
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<221>egfr第18外显子目的片段
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tgagggctgaggtgacccttgtctctgtgttcttgtcccccccagcttgtggagcctctt60
acacccagtggagaagctcccaaccaagctctcttgaggatcttgaaggaaactgaattc120
aaaaagatcaaagtgctgggctccggtgcgttcggcacggtgtataaggtaaggtccctg180
gcacaggcctctgggctg198
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<212>dna
<213>人工序列
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<221>egfr第19外显子目的片段
<400>2
aacatccacccagatcactgggcagcatgtggcaccatctcacaattgccagttaacgtc60
ttccttctctctctgtcatagggactctggatcccagaaggtgagaaagttaaaattccc120
gtcgctatcaaggaattaagagaagcaacatctccgaaagccaacaaggaaatcctcgat180
gtgagtttctgctttgctgt200
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<212>dna
<213>人工序列
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<221>egfr第20外显子目的片段
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gccacactgacgtgcctctccctccctccaggaagcctacgtgatggccagcgtggacaa60
cccccacgtgtgccgcctgctgggcatctgcctcacctccaccgtgcaactcatcacgca120
gctcatgcccttcggctgcctcctggactatgtccgggaacacaaagacaatattggctc180
ccagtacctgctcaa195
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<212>dna
<213>人工序列
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<221>egfr第21外显子目的片段
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gcagggtcttctctgtttcagggcatgaactacttggaggaccgtcgcttggtgcaccgc60
gacctggcagccaggaacgtactggtgaaaacaccgcagcatgtcaagatcacagatttt120
gggctggccaaactgctgggtgcggaagagaaagaataccatgcagaaggaggcaaagta180
aggaggtggctttaggtcag200
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<213>人工序列
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tatgcatattaaaacaagatttacctctattgttggatcatattcgtccacaaaatgatt60
ctgaattagctgtatcgtcaaggcactcttgcctacgccaccagctccaactaccacaag120
tttatattcagtcattttcagcaggccttataataaaaataatgaaaatgtgactatatt180
agaacatgt189
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<212>dna
<213>人工序列
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<221>kras第3外显子目的片段
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gcagggtcttctctgtttcagggcatgaactacttggaggaccgtcgcttggtgcaccgc60
gacctggcagccaggaacgtactggtgaaaacaccgcagcatgtcaagatcacagatttt120
gggctggccaaactgctgggtgcggaagagaaagaataccatgcagaaggaggcaaagta180
aggaggtggctttaggtcag200
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<221>捕获egfr第18外显子目的片段上游引物序列
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<221>捕获egfr第20外显子目的片段上游引物序列
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<221>捕获egfr第20外显子目的片段下游引物序列
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<221>捕获egfr第21外显子目的片段上游引物序列
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<212>dna
<213>人工序列
<220>
<221>捕获egfr第21外显子目的片段下游引物序列
<400>14
ctgacctaaagccacctcc19
<210>15
<211>19
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<221>捕获kras第2外显子目的片段上游引物序列
<400>15
tatgcatattaaaacaaga19
<210>16
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
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<221>捕获kras第2外显子目的片段下游引物序列
<400>16
acatgttctaatatagtcac20
<210>17
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<221>捕获kras第3外显子目的片段上游引物序列
<400>17
aaatacacaaagaaagccctc21
<210>18
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
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<221>捕获kras第3外显子目的片段下游引物序列
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ttttgaagtaaaaggtgcact21
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