检测PIK3CA基因20号外显子1047号密码子突变的引物对、试剂盒及方法与流程

本发明属于生物医药
技术领域：
，具体地说，本发明涉及一种检测pik3ca基因20号外显子1047号密码子突变的引物对、试剂盒及方法。
背景技术：
：pik3ca基因定位于3q26.3，长34kb，编码1068种氨基酸，该组氨基酸产生一组长124kd的蛋白。pik3ca已被证实是一种癌基因，其突变包括基因的扩增、缺失和体细胞性的错义突变等。pik3ca基因编码pi3k的催化亚基，可以激活pi3k通路的下游akt途径,激活或抑制其下游靶蛋白进而调节细胞的增殖、分化、迁移等多种生命活动，在肿瘤发生发展中起重要作用。美国研究人员发现基因pik3ca产生突变与结肠癌等多种癌症发病存在相关性,发现32％的结肠癌患者体内基因pik3ca存在突变。随着现代医学的快速发展，分子靶向药物的个体化治疗得到广泛应用。研究发现pik3ca基因突变的结直肠癌患者对针对egfr为靶点的单克隆抗体西妥昔单抗(cetuximab，商品名erbitux/艾必妥)产生耐药。大量研究证实pik3ca基因突变可引起乳腺癌患者对her2靶向药物注射用曲妥珠单抗(赫赛汀)的治疗耐药，从而导致疗效欠佳。pik3ca基因检测突变结果可为乳腺癌及结直肠癌患者的预后评估及合理用药提供参考依据。2012年nejm发表研究结果：存在pik3ca基因突变的晚期大肠癌患者，阿司匹林可能延长其生存期。大量数据表明pik3ca的突变约4/5发生在螺旋区(9号外显子)和激酶区(20号外显子)这两个热点区域。pik3ca基因的20号外显子1047号密码子作为热点突变位点，针对该位点的商品化试剂盒越来越多，但价格较为昂贵。目前实验室较常用的方法包括：sanger测序法、基于探针的荧光定量pcr法等。sanger测序法因为可以读出dna每个碱基的变化，目前是检测基因突变公认的金标准方法，但因为灵敏度低，测序步骤繁琐、耗时长，对设备和操作人员的要求较高，且必须在价格昂贵的测序仪上进行检测，不易于形成标准化操作的分子诊断产品。基于探针的荧光定量pcr法检测基因突变是通过已知的特异性探针实现的，该方法灵敏度高、特异性好，目前已有基于该方法的检测pik3ca基因突变的商品化试剂盒，但大部分试剂盒针对pik3ca基因20号外显子1047号密码子只能检测两种突变类型，而对于该位点稀有突变类型，则检测不出来，且检测试剂成本高。因此，有必要提供一种改进的方法以实现pik3ca基因20号外显子1047号密码子突变状态的准确、快速且廉价的检测方法。技术实现要素：基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种针对检测pik3ca基因的20号外显子1047号密码子突变的引物对、试剂盒及hrm检测方法。为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：一种检测pik3ca基因20号外显子1047号密码子突变的引物对，所述引物对具有如seqidno:1和seqidno:2所示的碱基序列。本发明还提供了一种检测pik3ca基因20号外显子1047号密码子突变的试剂盒，所述试剂盒包括如seqidno:1和seqidno:2所示的引物对。在其中一些实施例中，所述检测试剂盒还包括2*mastermix。在其中一些实施例中，所述检测试剂盒还包括mgcl2。本发明还提供了一种检测pik3ca基因20号外显子1047号密码子突变的反应体系，所述反应体系包括如seqidno:1和seqidno:2所示的引物对。在其中一些实施例中，所述反应体系还包括2*mastermix和mgcl2。在其中一些实施例中，检测pik3ca基因20号外显子1047号密码子突变的反应体系为：dna模板1-5μl、2*mastermix10-12.5μl、mgcl22.5-3.5μl、seqidno:1引物0.6-1μl、seqidno:2引物0.6-1μl、无酶水加至15-20μl。本发明还提供了一种检测pik3ca基因20号外显子1047号密码子突变的方法，包括以下步骤：(1)、以待检测样品的dna作为模板，采用如seqidno:1和seqidno:2所示的引物对进行荧光定量pcr反应及hrm分析，收集荧光信号；(2)、判读待检测样品的熔解曲线，若待检测样品的熔解曲线中显示出两个及以上的熔解峰，则表示该患者的1047号密码子存在突变，如只显示一个熔解峰，则表示该患者的1047号密码子为野生型。在其中一些实施例中，步骤(1)的荧光定量pcr的反应体系为：dna模板1-5μl、2*mastermix10-12.5μl、mgcl22.5-3.5μl、seqidno:1引物0.6-1μl、seqidno:2引物0.6-1μl、无酶水加至15-20μl。在其中一些实施例中，步骤(1)所述荧光定量pcr的反应程序为：95℃10min→(95℃20s、62℃20s、72℃20s)45cycles→熔解温度74-84℃，温度每升高1℃获取40次荧光信号→40℃10s。在其中一些实施例中，步骤(1)所述模板的浓度为50-100ng/μl。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：1、本发明的发明人经过多次探索发现，采用本发明的试剂盒进行pik3ca基因的20号外显子1047号密码子hrm法检测，可检测出低至5％的突变分子，可以检测pik3ca基因的20号外显子1047号密码子上的所有突变类型，不受突变碱基位点与类型局限；与sanger测序法(金标准方法)结果相比，结果一致率为99.61％(506/508)；2例不符的样品经厦门艾德人类pik3ca基因种突变检测试剂盒检测，其结果与本发明方法的结果相符。说明该例标本实际上是属于低丰度突变，金标准sanger测序法由于检测灵敏度低不能检出，而本发明的灵敏度高，针对低丰度突变的样品也可检出。另有1例样品的dna质量差，测序法无法获得检测结果，但利用本发明方法，可以获得检测结果，并与厦门艾德人类pik3ca基因种突变检测试剂盒检测结果一致。说明本发明方法对样本dna的质量要求低，适用性广。同时，本发明方法对设备的要求也大大降低，只需一台带有hrm功能的荧光定量pcr仪即可无需使用测序仪，适用范围更广，仪器成本更低；2、本发明的检测方法操作程序大大简化，全程闭管操作，避免交叉污染，易形成标准化操作的体外诊断试剂产品，且检测时间和试剂成本大大降低，90分钟内即可完成检测。附图说明图1:(a)为样本中含有pik3ca基因20号外显子1047号密码子cat>ctt突变的hrm分析图；(b)为样本中不含pik3ca基因20号外显子1047号密码子cat>ctt突变的hrm分析图。图2：(a)为样本中含pik3ca基因20号外显子1047号密码子cat>tat突变的hrm分析图；(b)为样本中不含pik3ca基因20号外显子1047号密码子cat>tat突变的hrm分析图。图3为pik3ca基因20号外显子1047号密码子发生cat>cgt突变的标准品占不同突变比例时的hrm分析图；其中，a为25％突变标准品，b为10％突变标准品，c为5％突变标准品，d为0％突变标准品；图4为采用不同引物，使用本发明所述hrm检测方法检测pik3ca基因20号外显子1047号密码子突变的扩增曲线，其中，使用引物对1扩增效果良好，可以正确分辨出突变型样品；使用引物对2、3无法检测突变型标本；使用引物对4、5扩增效果差；图5为采用不同mgcl2浓度，使用本发明所述hrm检测方法检测pik3ca基因20号外显子1047号密码子突变的扩增曲线，其中，使用浓度梯度1扩增效果良好，可以检测出5％突变标准品(a)；使用浓度梯度2不能检测出5％突变比例标准品(b)；使用浓度梯度3不能检测出10％及以下突变比例的标准品(c)；使用浓度梯度4不能检测出所有突变比例的标准品(d)。具体实施方式以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。以下实施例中的步骤除了特殊说明外，均为本领域常规操作步骤，以下实施例中所使用的原料，均来源于市售。实施例1肠癌肿瘤组织样品pik3ca基因20号外显子1047号密码子的突变检测1、引物本实施例的一种检测肠癌肿瘤组织样品pik3ca基因20号外显子1047号密码子突变的引物，具有如seqidno.1和seqidno.2的碱基序列。上游引物seqidno.1:accctagccttagataaaactgagc下游引物seqidno.2:tccatttttgttgtccagccaccat2、反应体系使用lightcycler480highresolutionmeltingmaster(货号为04909631001)配制如下反应体系：名称用量(μl)2*mastermix10mgcl22.8seqidno:1引物0.8seqidno:2引物0.8无酶水0.6dna模板13、检测方法(1)、样品来源及基因组dna提取：所有肠癌患者肿瘤样品均来自中山大学附属第六医院病理科，收集组织，使用石蜡样品提取试剂盒对基因组dna进行提取。dna模板浓度分别调整至50-100ng/ul。在上述反应体系中分别加入1ul的dna模板。涡旋混匀后，使用罗氏lightcycler480实时荧光定量pcr仪进行检测，程序如下：95℃10min→(95℃20s、62℃20s、72℃20s)45cycles→熔解温度74-84℃，温度每升高1℃获取40次荧光信号→40℃10s。(2)、判读待测标本的熔解曲线，以确定pik3ca基因20号外显子的1047号密码子是否存在突变。若样品pik3ca基因20号外显子的1047号密码子存在突变，则待测样品熔解曲线显示出两个及以上的熔解峰，共检测100例样品，与sanger测序法进行结果比较，两种方法结果100％相符。图1:(a)为样本中含有pik3ca基因20号外显子1047号密码子cat>ctt突变的hrm分析图；(b)为样本中不含pik3ca基因20号外显子1047号密码子cat>ctt突变的hrm分析图。图2：(a)为样本中含pik3ca基因20号外显子1047号密码子cat>tat突变的hrm分析图；(b)为样本中不含pik3ca基因20号外显子1047号密码子cat>tat突变的hrm分析图。实施例2检测pik3ca20号外显子1047号密码子突变的试剂盒本实施例的检测pik3ca20号外显子1047号密码子突变的试剂盒包括以下组分：2*mastermix、mgcl2、seqidno:1引物、和seqidno:2引物。试验例1本发明方法的灵敏度验证灵敏度验证采取了以下方法：1、使用pik3ca基因20号外显子1047号cat>cgt突变标准品，与野生型标准品配制成以下几种不同突变比例的标准品：25％突变、10％突变、5％突变、0％突变，具体配制方法参考本
技术领域：
的常规方法。2、配制检测试剂，即实施例1中反应体系；3、取步骤1所配制的不同突变比例的标准品1ul，加入步骤2中检测试剂中，将检测试剂放入罗氏lightcycler480实时荧光定量pcr仪中进行检测；4、pcr和hrm程序：95℃10min→(95℃20s、62℃20s、72℃20s)45cycles→熔解温度74-84℃，温度每升高1℃获取40次荧光信号→40℃10s。5、hrm结果分析：若样品pik3ca基因20号外显子的1047号密码子存在突变，则检测试剂的待测样品熔解曲线显示出两个及以上的熔解峰。结果如图3所示。图3为不同突变比例的pik3ca基因20号外显子1047号cat>cgt突变标准品的hrm分析图，由图3可看出，使用本发明的检测试剂及检测方法确保能检出5％的突变。试验例2本发明方法与sanger测序法和厦门艾德人类pik3ca基因突变检测试剂盒的检测结果比较509例临床肿瘤样品均来自中山大学附属第六医院病理科，其中结肠癌244例，直肠癌209，乳腺癌20例，胃癌34例，肛管癌2例。分别采取本发明实施例1方法、sanger测序法和厦门艾德人类pik3ca基因突变检测试剂盒对这509例样品进行了检测，结果如表1所示。表1三种方法的检测结果比较由表1结果可知，共有508例样本同时具有本发明所述方法与金标准sanger测序法的结果，本发明方法的特异性为99.61％，敏感性为100％，阳性预测值为89.47％。2例结果不相符的样品，经厦门艾德pik3ca基因突变检测试剂盒进行检测后，其结果均与本发明所述方法一致，说明该例标本实际上是属于低丰度突变，金标准sanger测序法由于检测灵敏度低不能检出，而本发明的灵敏度高，针对低丰度突变的样品也可检出。另有1例样品由于dna质量差，用sanger测序法无法检测，而本发明方法可以对其进行检测，检测结果为野生型。经厦门艾德pik3ca基因突变检测试剂盒进行检测后，其结果均与本发明所述方法一致，说明本发明方法对样本dna的质量要求低，适用性广。试验例3采用不同引物对pik3ca基因20号外显子的突变检测的结果对比发明人摸索了多组引物对，研究hrm法(实施例1的方法)对检测上述pik3ca基因20号外显子基因突变的实验结果的影响。以下表2以实施例1方法，采用多组示例性引物对pik3ca基因的20号外显子1047号密码子进行检测所得结果。实验证明，引物的最终选择关乎方法的可行性。表2采用5对引物对对峰型、判读结果的影响结果注：上表采用hrm检测法，其pcr程序总共设置45个循环。样品扩增ct值<28为佳，若样品扩增ct值不在该范围内，则判读为该次pcr反应扩增效果不好或无法扩增，最后有可能会影响扩增产物的量和后续的hrm分析。结果显示，样品1使用sanger测序法判读为突变型，而表2内的5对引物采用本发明所述方法和检测试剂检测。发现只有seqidno:1、seqidno:2所示引物(即上列表2中引物对1)可以准确检测出样品1为突变型，其余4对引物(即上列表中引物对2-5)均无法准确判读。试验例4不同mgcl2浓度对pik3ca基因20号外显子突变检测的结果对比发明人摸索了多个mgcl2浓度梯度对pik3ca基因20号外显子突变检测的结果影响，采用试验例1中方法，通过检测25％、10％、5％突变标准品来研究不同mgcl2浓度对上述pik3ca基因20号外显子基因突变检测的实验结果的影响。以下表3为采用4个示例性mgcl2浓度梯度对pik3ca的20号外显子1047号密码子突变检测的结果。实验证明，mgcl2浓度的最终选择关乎检测结果的明显性。表3采用不同mgcl2体积对峰型、判读结果的影响试验例5本发明检测方法与sanger测序法时间及成本对比计算方法：针对试验例2中使用本发明检测方法与sanger测序法均有检测结果的508例标本进行核算，结果如表4所示。表4本发明方法与sanger测序法试剂盒的检测时间和成本的比较本发明hrm法sanger测序法实验花费时间估算1.5小时/标本9小时/标本实验成本估算3.5元/标本20元/标本由结果可知，使用本发明hrm检测方法对pik3ca的20号外显子1047号位点进行检测，每个标本的检测时间比sanger测序法缩短了83.33％，同时每个标本的检测成本降低了82.50％。使用本发明所述hrm方法针对pik3ca的20号外显子1047号的检测，可以大大节约检测时间和成本，更好的服务临床病人。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12