本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及与伪狂犬病病毒gb蛋白结合的单克隆抗体及其应用。
背景技术：
：伪狂犬病，又称aujeszky氏病，是由疱疹病毒科(herpesviridae)α亚科中的猪疱疹病毒ⅰ型(suidherpesvirus1strain，亦称伪狂犬病病毒pseudorabiesvirus，prv)所引起的猪、牛、羊、犬、猫、兔、鼠、野猪、貂、熊和狐等多种家畜、野生动物的一种以发热、奇痒(除猪外)及脑脊髓炎为主症的急性传染病。猪的伪狂犬病在我国广泛存在，危害严重，是制约规模化猪场生产的主要疾病之一，可引起妊娠母猪流产、死胎或木乃伊胎，仔猪出现神经症状、麻痹、特别地20周龄内感染后100％死亡率，以及大中猪呼吸道症状等。研究表明以prvgb、gc、gd蛋白为主的亚单位疫苗能够给免疫动物特别是猪提供相应的保护，不仅能使猪免遭猪伪狂犬病的侵袭，还能使猪免受猪伪狂犬变异株所引发的伪狂犬病，特别地以三种蛋白中的两者或三者的串联表达或融合表达效果最为显著。但通过基因工程手段串联表达或融合表达后的蛋白存在的难题在于，其仅能通过常用的bca或bradford方法定量表达后的总蛋白含量，无法准确定量各自蛋白表达的含量，进而不能确定各蛋白是否达到预期的表达效果，导致无法配制亚单位疫苗。目前prv病原的临床检测主要为聚合酶链式反应pcr方法，此方法中涉及的引物、酶等多为国外进口，价格较为昂贵，使得养殖场特别是小规模或散户养殖望而却步。另外此方法虽广泛用于疫病诊断，但由于其不能在组织和细胞内进行明确定位、无法跟踪病原在机体的动态分布、半定量检测，从而限制了pcr在病理组织学上的应用。现有技术中，能够用于免疫组化(immunohistochemistry，ihc)的抗体会在其使用说明书中作出明确标识和注明。按说明所示，大多数抗体都不能用于ihc检测。虽然个别抗体标明可用于ihc，但在实际应用发现并非如此。这些抗体均为研究用试剂，没有经过大量样本临床病例试验或验证，没有对病毒感染组织或细胞的定位检测能力，为流行病学的准确调查和后期的预防、治疗带来麻烦。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供了能够与伪狂犬病毒gb蛋白结合的单克隆抗体。含所述单克隆抗体的elisa检测试剂盒，克服了prvgb蛋白与其它蛋白串联表达或融合表达后无法准确定量、预期表达效果无法验证的技术难题，解决了配制疫苗的关键问题。同时，所述单克隆抗体还可用于免疫组化检测，解决了pcr不能在组织和细胞内进行明确定位、无法跟踪病原在机体的动态分布的问题。为此，本发明第一方面提供了特异性结合伪狂犬病病毒gb蛋白的可变区序列，其为鼠单克隆抗体3c12的可变区序列，所述鼠单克隆抗体3c12的可变区序列中，重链可变区氨基酸序列为：序列seqidno.2所示的氨基酸序列，或序列seqidno.2经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；轻链可变区氨基酸序列为：序列seqidno.4所示的氨基酸序列，或序列seqidno.4经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；和/或为鼠单克隆抗体5g12的可变区序列，所述鼠单克隆抗体5g12的可变区序列中，重链可变区氨基酸序列为：序列seqidno.6所示的氨基酸序列，或序列seqidno.6经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；轻链可变区氨基酸序列为：序列seqidno.8所示的氨基酸序列，或序列seqidno.8经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。本发明第二方面提供了一种与伪狂犬病病毒gb蛋白结合的抗体，其包括如本发明第一方面所述的鼠单克隆抗体3c12的重链可变区氨基酸序列，和/或轻链可变区氨基酸序列。根据本发明，第二方面所述抗体为单克隆抗体和/或基因工程抗体；所述基因工程抗体选自单链抗体、单链抗体片段、嵌合单克隆抗体、嵌合单克隆抗体片段、改形单克隆抗体、改形单克隆抗体片段、猪源单克隆抗体、猪源单克隆抗体片段中的一种；在本发明的一些具体实施方式中，所述抗体为鼠单克隆抗体3c12。本发明第三方面提供了另一种与伪狂犬病病毒gb蛋白结合的抗体，其包括如本发明第一方面所述的鼠单克隆抗体5g12的重链可变区氨基酸序列，和/或轻链可变区氨基酸序列。根据本发明，第三方面所述抗体为单克隆抗体和/或基因工程抗体；所述基因工程抗体选自单链抗体、单链抗体片段、嵌合单克隆抗体、嵌合单克隆抗体片段、改形单克隆抗体、改形单克隆抗体片段、猪源单克隆抗体、猪源单克隆抗体片段中的一种；在本发明的一些具体实施方式中，所述抗体为鼠单克隆抗体5g12。本发明第四方面提供了一种elisa检测试剂盒，其包括本发明第二方面和第三方面所述抗体、检测试剂和伪狂犬病病毒gb蛋白标准品。在本发明的一些实施方式中，所述抗体包括鼠单克隆抗体3c12和鼠单克隆抗体5g12；其中，所述鼠单克隆抗体3c12和鼠单克隆抗体5g12中的一种包被在微孔板上，另一种被标记；具体地，所述标记的标记物包括酶、荧光基团或化学发光基团。在本发明的另一些实施方式中，所述检测试剂包括与所述标记物发生颜色反应的底物；优选地，所述检测试剂包括酶显色试剂、荧光试剂或化学发光试剂。在本发明的一些具体实施方式中，所述的试剂盒包括：包被鼠单克隆抗体3c12的微孔板、酶标的鼠单克隆抗体5g12、样品稀释液、洗涤液、显色液、终止液和伪狂犬病病毒gb蛋白标准品。在本发明的一些实施方式中，所述鼠单克隆抗体3c12的包被量为0.1-0.15μg/ml。在本发明的另一些实施方式中，所述酶标的鼠单克隆抗体5g12使用时进行1:(5000-7000)的体积稀释。根据本发明，所述样品稀释液为磷酸盐缓冲液；所述洗涤液为含0.05％(v/v)tween-20的磷酸盐缓冲液；所述显色液包括a液和b液，所述a液为20mgtmb中加入10ml无水乙醇后用双蒸水定容至100ml，混匀后无菌分装获得的溶液；b液为2.1g柠檬酸、2.82g无水na2hpo4、0.75％的过氧化氢和0.64ml尿素用双蒸水溶解并定容至100ml，混匀后无菌分装获得的溶液；所述终止液为2m的h2so4溶液。本发明第五方面提供了一种如本发明第四方面所述的elisa检测试剂盒在定量检测伪狂犬病病毒gb蛋白表达量中的应用；具体地，所述的伪狂犬病病毒gb蛋白表达量为伪狂犬病病毒gb蛋白的单独表达量或伪狂犬病病毒gb蛋白与其它蛋白串联表达或融合表达时的伪狂犬病病毒gb蛋白的表达量。本发明第六方面提供了一种利用本发明第四方面所述elisa检测试剂盒定量检测伪狂犬病病毒gb蛋白表达量的方法，其包括：步骤①将伪狂犬病病毒gb蛋白标准品用样品稀释液做一系列倍比稀释，获得浓度为0-320ng/ml的标准品系列稀释液；将待检样品用样品稀释液进行1:(50-100)的体积稀释，获得待检样品稀释液；然后将标准品系列稀释液、待检样品稀释液同时按90-110μl/孔加入到包被抗体的微孔板中，封板并置35-38℃温育45-90min或室温孵育55-65min；步骤②弃反应液，用洗涤液洗涤2-4次，拍干或抽干；步骤③将稀释后的酶标抗体按90-110μl/孔加入后封板，并置35-38℃温育30-45min或室温孵育40-50min；步骤④弃反应液，用洗涤液洗涤2-4次，拍干或抽干；；步骤⑤加显色液a液、b液各45-55μl/孔，置35-38℃温育8-12min或室温孵育13-17min；步骤⑥加终止液45-55μl/孔，8-12min内用酶标仪读取od450nm处的吸光度值；步骤⑦根据标准品系列稀释液的吸光度值绘制标准曲线，并根据绘制的标准曲线计算待检样品中伪狂犬病病毒gb蛋白的含量。在本发明的一些实施方式中，所述标准品系列稀释液的浓度为0-640ng/ml；优选所述标准品系列稀释液的浓度为0-320ng/ml。本发明第七方面提供了一种如本发明第二方面或第三方面所述的抗体在进行非诊断目的的猪伪狂犬病病毒检测中的应用；优选所述抗体为本发明第三方面所述抗体；进一步优选所述的抗体为鼠单克隆抗体5g12。根据本发明，所述非诊断目的的猪伪狂犬病病毒检测包括流行病学分析、对离体组织进行检测、表位鉴定研究、定性和定量鉴别检验含猪伪狂犬病病毒抗原和其他抗原的疫苗组合物中猪伪狂犬病病毒抗原的检测；优选地，所述对离体组织进行检测包括采用免疫组化方法进行检测。在本发明的一些实施方式中，利用本发明第三方面所述抗体对离体组织进行免疫组化检测的具体方式为：步骤(1)取材：采集猪的扁桃体、脑、肺等组织样品，迅速置于福尔马林中进行固定，必要时对其进行适当修块。步骤(2)石蜡切片的制备：固定后经流水冲洗后再用自动脱水机进行脱水、透明、浸蜡，用包埋机包埋后切片、展片、裱片于已处理的玻片上，烤片后获得石蜡切片；步骤3)抑制内源性酶将玻片脱蜡至蒸馏水，滴加3％h2o2静置以抑制内源性酶；步骤4)抗原修复用抗原热修复如高压热修复、煮沸热修复、微波热修复，或酶消化法处理烤片后的玻片以修复抗原；步骤5)封闭用磷酸盐缓冲液洗涤3次，滴加封闭液如马血清或牛血清白蛋白bsa封闭；步骤6)染色吸去封闭液后加入稀释的一抗，室温孵育1小时或37℃孵育45-60分钟或2-8℃孵育过夜；用磷酸盐缓冲液洗涤3次，加入酶标的羊抗鼠二抗，室温孵育1小时或37℃孵育45-60分钟；步骤7)显色用磷酸盐缓冲液洗涤3次，加入aec或dab显色液显色，视染色情况用磷酸盐缓冲液或蒸馏水终止；加入苏木素衬染细胞核以复染，必要时进行脱水、透明，封片、镜检。在本发明的一些具体实施方式中，所述第三方面所述抗体使用时进行1:(50-1000)的体积稀释。本发明的有益效果为：含本发明所述单克隆抗体的elisa检测试剂盒，克服了prvgb蛋白与其它蛋白串联表达或融合表达后无法准确定量、预期表达效果无法验证的技术难题，解决了配制疫苗的关键问题。同时，所述单克隆抗体可用于免疫组化检测，解决了pcr不能在组织和细胞内进行明确定位、无法跟踪病原在机体的动态分布和不能半定量检测的问题；弥补了现有商品化抗体未经大量样本临床病例试验或验证，无关键的对病毒感染组织或细胞的定位检测能力的缺陷，为流行病学的准确调查和后期的预防、治疗提供便利。具体实施方式为使本发明容易理解，下面将详细说明本发明。本发明第一方面提供了特异性结合伪狂犬病病毒gb蛋白的可变区序列，其为鼠单克隆抗体3c12的可变区序列，所述鼠单克隆抗体3c12的可变区序列中，重链可变区氨基酸序列为：序列seqidno.2所示的氨基酸序列，或序列seqidno.2经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；轻链可变区氨基酸序列为：序列seqidno.4所示的氨基酸序列，或序列seqidno.4经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；和/或为鼠单克隆抗体5g12的可变区序列，所述鼠单克隆抗体5g12的可变区序列中，重链可变区氨基酸序列为：序列seqidno.6所示的氨基酸序列，或序列seqidno.6经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；轻链可变区氨基酸序列为：序列seqidno.8所示的氨基酸序列，或序列seqidno.8经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。本发明第二方面提供了一种与伪狂犬病病毒gb蛋白结合的抗体，其包括如本发明第一方面所述的鼠单克隆抗体3c12的重链可变区氨基酸序列，和/或轻链可变区氨基酸序列。根据本发明，第二方面所述抗体为单克隆抗体和/或基因工程抗体；所述基因工程抗体选自单链抗体、单链抗体片段、嵌合单克隆抗体、嵌合单克隆抗体片段、改形单克隆抗体、改形单克隆抗体片段、猪源单克隆抗体、猪源单克隆抗体片段中的一种。在本发明的一些具体实施方式中，所述抗体为鼠单克隆抗体3c12；具体地，所述鼠单克隆抗体3c12对prvgb蛋白的elisa效价为1:1600000，对hn1201株、bartha株、ma株的ifa效价为1:12800、ipma效价为1:6400，与prvgb蛋白及prv毒株均具有良好的反应性。本发明第三方面提供了另一种与伪狂犬病病毒gb蛋白结合的抗体，其包括如本发明第一方面所述的鼠单克隆抗体5g12的重链可变区氨基酸序列，和/或轻链可变区氨基酸序列。根据本发明，第三方面所述抗体为单克隆抗体和/或基因工程抗体；所述基因工程抗体选自单链抗体、单链抗体片段、嵌合单克隆抗体、嵌合单克隆抗体片段、改形单克隆抗体、改形单克隆抗体片段、猪源单克隆抗体、猪源单克隆抗体片段中的一种。在本发明的一些具体实施方式中，所述抗体为鼠单克隆抗体5g12；具体地，所述鼠单克隆抗体5g12对prvgb蛋白的elisa效价为1:1200000，对hn1201株、bartha株、ma株的ipma效价为1:6400-1:12800、ifa效价为1:3200-1:6400，与prvgb蛋白及prv毒株均具有良好的反应性。用语“gb蛋白”又称“gb糖蛋白”，在疱疹病毒成员中属于最保守的糖蛋白，其大小约2.8kb。用语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群体的抗体个体都相同，除了可能存在少量的自发突变。因此，修饰语“单克隆”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。优选地，所述单克隆抗体包括单价或单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体，以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。用语“抗体”应该解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子。因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、人源化抗体以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽；所述多肽可以是天然的还可以是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如igg、ige、igm、igd和iga)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如fab、scfv、fv、dab、fd；和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在ep.a.0120694和ep.a.0125023中描述。用语“抗体”可以通过许多方式修饰，可用dna重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(cdrs)的dna引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区。参见，ep.a.184187，gb2188638a或ep.a.239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。用于本发明的“单克隆抗体”也可用杂交瘤方法制得。因为编码本发明鼠源化抗体的dna序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成或用pcr法扩增得到，因而也可用重组dna方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。抗体包含通过二硫桥连接在一起的多肽链几何体，称为轻链和重链的两条多肽主链，构成抗体的所有主要结构类别(同型物)。重链和轻链都进一步可分为称作可变区和恒定区的一些亚区。重链包括单个可变区和三个不同的恒定区；轻链则包括单个可变区(不同于重链的可变区)和单个恒定区(不同于重链的恒定区)。重链和轻链的可变区负责抗体的结合特异性。用语“重链可变区”是指一种多肽，其长度为110至125个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从重链n末端氨基酸开始的重链氨基酸顺序。同样，术语“轻链可变区”是指一种多肽，其长度为95至115个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从轻链n末端氨基酸开始的轻链氨基酸顺序。本领域普通技术人员显然知晓，在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列基础上，可以通过常规基因工程和蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得保守性变异体，而仍能保持与伪狂犬病病毒特异性结合。本发明中的单克隆抗体还包括其活性片段或保守性变异体。用语“保守性变异体”是指基本上保留了其母本的特性，如基本的免疫学生物特性、结构特性、调节特性或生化特性的变异体。一般地，多肽的保守性变异体的氨基酸序列不同于母本多肽，但是差异是有限的，以使母本多肽的序列与保守性变异体的序列在总体上非常相似，并且在许多区域是相同的。保守性变异体和母本多肽氨基酸序列上的差异可以是一个或多个氨基酸残基及其任意组合的替换、添加和删除。替换或插入的氨基酸残基可由遗传密码编码，也可不由遗传密码编码。多肽的保守性变异体可以自然产生，也可以非自然产生。多肽的非自然产生的保守性变异体可通过诱变技术或直接合成而产生。本发明第四方面提供了一种elisa检测试剂盒，其包括有效量的本发明第二方面和第三方面所述抗体、检测试剂和伪狂犬病病毒gb蛋白标准品。在本发明的一些实施方式中，所述抗体包括鼠单克隆抗体3c12和鼠单克隆抗体5g12；其中，所述鼠单克隆抗体3c12和鼠单克隆抗体5g12中的一种包被在微孔板上，另一种被标记；具体地，所述标记的标记物包括酶、荧光基团或化学发光基团。在本发明的另一些实施方式中，所述检测试剂包括与所述标记物发生颜色反应的底物；优选地，所述检测试剂包括酶显色试剂、荧光试剂或化学发光试剂。在本发明的一些具体实施方式中，所述的试剂盒包括：包被鼠单克隆抗体3c12的微孔板、酶标的鼠单克隆抗体5g12、样品稀释液、洗涤液、显色液、终止液和伪狂犬病病毒gb蛋白标准品。在本发明的一些实施方式中，所述鼠单克隆抗体3c12的包被量为0.1-0.15μg/ml。在本发明的另一些实施方式中，所述酶标的鼠单克隆抗体5g12使用时进行1:(5000-7000)的体积稀释。根据本发明，所述样品稀释液为磷酸盐缓冲液；所述洗涤液为含0.05％(v/v)tween-20的磷酸盐缓冲液；所述显色液包括a液和b液，所述a液为20mgtmb中加入10ml无水乙醇后用双蒸水定容至100ml，混匀后无菌分装获得的溶液；b液为2.1g柠檬酸、2.82g无水na2hpo4、0.75％的过氧化氢和0.64ml尿素用双蒸水溶解并定容至100ml，混匀后无菌分装获得的溶液；所述终止液为2m的h2so4溶液。本发明第五方面提供了一种如本发明第四所述的elisa检测试剂盒在定量检测伪狂犬病病毒gb蛋白表达量中的应用；具体地，所述的伪狂犬病病毒gb蛋白表达量为伪狂犬病病毒gb蛋白的单独表达量或伪狂犬病病毒gb蛋白与其它蛋白串联表达或融合表达时的伪狂犬病病毒gb蛋白的表达量。本发明第六方面提供了一种利用本发明第四方面所述elisa检测试剂盒定量检测伪狂犬病病毒gb蛋白表达量的方法，其具体包括：步骤①将伪狂犬病病毒gb蛋白标准品用样品稀释液稀释至640ng/ml后进行2倍倍比稀释，即320、160、80、40、0ng/ml，获得标准品系列稀释液；将待检样品用样品稀释液进行1:(50-100)的体积稀释，获得待检样品稀释液；然后将标准品系列稀释液、待检样品稀释液同时按100μl/孔加入包被有鼠单克隆抗体3c12的微孔板中，封板并置37℃温育45-90min或室温孵育60min；步骤②弃反应液，用洗涤液洗涤2-4次，拍干或抽干；步骤③将稀释后的酶标的鼠单克隆抗体5g12按100μl/孔加入后封板并置37℃温育30-45min或室温孵育45min；步骤④弃反应液，用洗涤液洗涤2-4次，拍干或抽干；步骤⑤加显色液a液、b液各50μl/孔，置37℃温育10min或室温孵育15min；步骤⑥加终止液50μl/孔，10min内用酶标仪读取od450nm处的吸光度值；步骤⑦根据标准品系列稀释液的吸光度值绘制标准曲线，并根据绘制的标准曲线计算待检样品中prvgb蛋白的含量。本发明第六方面提供了一种如本发明第二方面或第三方面所述的抗体在进行非诊断目的的猪伪狂犬病病毒检测中的应用；优选所述抗体为本发明第三方面所述抗体；进一步优选所述的抗体为鼠单克隆抗体5g12。根据本发明，所述非诊断目的的猪伪狂犬病病毒检测包括流行病学分析、对离体组织进行检测、表位鉴定研究、定性和定量鉴别检验含猪伪狂犬病病毒抗原和其他抗原的疫苗组合物中猪伪狂犬病病毒抗原的检测；优选地，所述对离体组织进行检测包括采用免疫组化方法进行检测。在本发明的一些实施方式中，利用本发明第三方面所述抗体对离体组织进行免疫组化检测的具体方式为：步骤1)取材：采集猪的扁桃体、脑、肺等组织样品，迅速置于福尔马林中进行固定，必要时对其进行适当修块。步骤2)石蜡切片的制备：用固定液固定、流水冲洗后再用自动脱水机进行脱水、透明、浸蜡，用包埋机包埋后切片、展片、裱片于已处理的玻片上，烤片后获得石蜡切片；步骤3)抑制内源性酶将玻片脱蜡至蒸馏水，滴加3％h2o2静置以抑制内源性酶；步骤4)抗原修复用抗原热修复如高压热修复、煮沸热修复、微波热修复，或酶消化法处理烤片后的玻片以修复抗原。步骤5)封闭用磷酸盐缓冲液洗涤3次，滴加封闭液如马血清或牛血清白蛋白bsa封闭；步骤6)染色吸去封闭液后加入稀释的一抗，室温孵育1小时或37℃孵育45-60分钟或2-8℃孵育过夜；用磷酸盐缓冲液洗涤3次，加入酶标的羊抗鼠二抗，室温孵育1小时或37℃孵育45-60分钟。步骤7)显色用磷酸盐缓冲液洗涤3次，加入aec或dab显色液显色，视染色情况用磷酸盐缓冲液或蒸馏水终止；加入苏木素衬染细胞核以复染，必要时进行脱水、透明，封片、镜检；在本发明的一些具体实施方式中，所述本发明第三方面所述抗体使用时进行1:(50-1000)的体积稀释。用语“酶标的羊抗鼠二抗”中的“酶”选自辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和β-d-半乳糖苷酶的任一种。用语“磷酸盐缓冲液”是指含有磷酸或其盐并被调至理想ph值的溶液，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液。一般地，磷酸盐缓冲液由磷酸或磷酸盐(包括但不限于钠和钾盐)制备而成。本领域已经知道一些磷酸盐，例如磷酸二氢钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸氢二钾、磷酸钠和磷酸钾。已经知道磷酸盐是以盐的水合物形式存在的。由于缓冲液的二级解离作用，缓冲的ph值范围很宽，例如约4-10的范围，优选约5-9的范围，更有选约6-8的范围，最优选约7.4。进一步优选地，所述磷酸盐缓冲液为含氯化钠和氯化钾的磷酸盐缓冲液。实施例为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。实施例1：猪伪狂犬病毒gb蛋白的制备及鉴定。1.1猪伪狂犬病毒gb蛋白的制备在生长良好的pk15细胞上接种prvhn1201病毒或其不同代次的培养物(prvhn1201株保藏号为cctccno.v201311，参见专利cn104004774a)，按专利cn105693827a制备prvgb蛋白(简称为prvgb1)，经his亲和层析和分子筛纯化后按bca蛋白浓度测定试剂盒(购自上海碧云天生物技术有限公司)中的说明书测定prvgb1的含量为5μg/ml。1.2含猪伪狂犬病毒gb蛋白的融合蛋白的制备1.2.1按专利cn105693827a制备prvgb蛋白片段与prvgd蛋白的融合蛋白(简称为prvgb2)，经his亲和层析和分子筛纯化后按bca蛋白浓度测定试剂盒中的说明书测定prvgb2的含量为5μg/ml。设计的引物序列如下：gb2-f：cgcggatccatgctagggggcgtcggggtcct；gb2-r：tgatccacctccccctgatccacctccccctgatccacctcccccatgcccgctggtggcggtctt。gd2-f：gggggaggtggatcagggggaggtggatcagggggaggtggatcaatgctgctcgcagcgctattg；gd2-r：tgtgaagcttctacggaccgggctgcgct。1.2.2按专利cn105693827a制备prvgb蛋白与prvgd蛋白的融合蛋白(简称为prvgb3)，经his亲和层析和分子筛纯化后按bca蛋白浓度测定试剂盒中的说明书测定，prvgb3的含量为8μg/ml。1.3含猪伪狂犬病毒gb蛋白的串联蛋白的制备1.3.1按专利cn105693827a制备prvgb蛋白片段与prvgd蛋白的串联蛋白(简称为prvgb4)，经his亲和层析和分子筛纯化后按bca蛋白浓度测定试剂盒中的说明书测定prvgb4的含量为15μg/ml。设计的引物序列如下：gd4-f：ccaatgcatatgctgctcgcagcgctat；gd4-r：catgccatggctacggaccgggctgcgctt。gb4-f：cgcggatccatgctagggggcgtcggggtcct。gb4-r：tgtgaagcttctaatgcccgctggtggcggtct。1.3.2按专利cn105693827a制备prvgb蛋白与gd蛋白的串联蛋白(简称为prvgb5)，经his亲和层析和分子筛纯化后按bca蛋白浓度测定试剂盒中的说明书测定prvgb5的含量为20μg/ml。prvgb2、prvgb3、prvgb4、prvgb5只能测定总蛋白的含量，无法准确预测各蛋白相应的表达量，无法监测表达效果是否达到预期，导致配苗时各组分不清楚，也无法对疫苗免疫后产生效果好坏的原因进行分析。实施例2：猪伪狂犬病病毒gb蛋白单克隆抗体的制备、纯化及鉴定。2.1prvgb蛋白单克隆抗体的制备将实施例1.1制备的prvgb1经浓缩后按100μg/只的终含量与弗氏佐剂等体积乳化后免疫4只小鼠作为①组，间隔14天(短程)免疫，累计免疫3-5次，并于每次免疫后7天采血持续检测小鼠血清的elisa效价(以实施例1制备的prvgb1作为包被原)，结果见表1。从表1可知，经3-5次免疫后持续检测的小鼠血清的elisa效价均≤1:8000且上升趋势不明显，任选1只融合，无阳性细胞，放弃。将每次免疫的间隔时间拉长为21天(长程免疫)作为②组，累计免疫3-5次并于每次免疫后7天采血持续检测小鼠血清的elisa效价，结果见表1。从表1可知，经3-5次免疫后持续检测的小鼠血清的elisa效价均≤1:16000且上升趋势不明显，任选1只融合，无阳性细胞，放弃。更换佐剂(cpg佐剂)作为③组，按短程免疫程序进行免疫，累计免疫3-5次，并于每次免疫后7天采血持续检测小鼠血清的elisa效价，结果见表1。从表1可知，经3-5次免疫后持续检测的小鼠血清的elisa效价均≤1:32000且3只上升趋势不明显、1只上升趋势明显。将1只上升趋势明显的小鼠按harlowe等(harlowe,laned.antibodies:alaboratorymanual.newyork:coldspringharborlaboratorypress.1998,139-312)文献中所述方法进行细胞融合，阳性率仅为1％。继续进行亚克隆筛选。更换佐剂(弗氏佐剂+cpg佐剂)作为④组，按短程免疫程序进行免疫，累计免疫3-5次，并于每次免疫后7天采血持续检测小鼠血清的elisa效价，结果见表1。从表1可知，经3-5次免疫后持续检测的小鼠血清的elisa效价均≥1:32000且3只上升趋势明显、1只上升趋势不明显。将3只上升趋势明显的小鼠均按harlowe等(harlowe,laned.antibodies:alaboratorymanual.newyork:coldspringharborlaboratorypress.1998,139-312)文献所述方法进行细胞融合，阳性率累计仅为5％。继续进行亚克隆筛选。表1小鼠血清的效价及融合情况将③、④两组进行亚克隆筛选，经4-6轮亚克隆筛选最终获得14株阳性杂交瘤细胞，收集其细胞上清，分别进行以prvhn1201株、bartha株、ma株为抗原的ifa及ipma检测，选择2种方法与3个毒株均反应的细胞上清，并去除阴性及效价低的细胞上清(ifa≤1:80、ipma效价≤1:40)，最终获得3株阳性杂交瘤细胞株，分别命名为3c12、5g12、1d10。进一步通过经产母鼠制备腹水、经纯化获得3株prvgb蛋白的鼠单克隆抗体3c12、5g12、1d10，并用elisa、ifa、ipma方法测定其效价，结果见表2。表2：鼠单克隆抗体3c12、5g12、1d10的ifa及ipma效价检测结果由表2可知，鼠单克隆抗体3c12、5g12、1d10对prv蛋白的elisa效价≥1:1000000(依次分别为1:1600000、1:1200000、1:1000000)，对prv毒株的ifa效价≥1:3200、ipma效价≥1:1600，表明鼠单克隆抗体特别是3c12、5g12、1d10与prvgb蛋白及prv均具有良好的反应性。2.2单克隆抗体识别抗原表位的异同采用抗体相加试验进行测定。将实施例1制备的prvgb1包被于微孔板后用封闭液进行封闭，然后加入第一株饱和浓度的单克隆抗体与之反应，洗涤，拍干，再加入另一株饱和浓度的单克隆抗体与之反应。两株单克隆抗体反应完毕后，再加入hrp标记的羊抗鼠igg与之反应，洗涤，显色，测定其吸光度a值。按公式(1)分别计算单隆抗体两两叠加的增值指数ai。ai＝[(a1.2-a1)/a2]×100％(1)，其中，a1、a2分别为单抗1和2的a值，a1.2为单抗1叠加单抗2的a值。ai大于50％即可初步断定两种单抗对应不同的抗原结合位点。按照此方法对3株抗体进行两两配对检测。结果见表3。表3：单克隆抗体两两叠加的增值指数ai从表3可知，鼠单克隆抗体3c12与5g12抗体相加指数均高于50％，表明两株单克隆抗体识别不同的抗原表位，可用于建立双抗体夹心方法。2.3鼠单克隆抗体3c12、5g12特性的鉴定2.3.1鼠单克隆抗体3c12、5g12类型和亚类的鉴定用piercerapidelisamousemabisotypingkit(购自pierce公司)并参照说明书对鼠单克隆抗体3c12、5g12的抗体亚型进行鉴定。鉴定结果：鼠单克隆抗体3c12、5g12的重链分别为igg2b、igg2a，轻链均为kappa。2.3.2鼠单克隆抗体3c12、5g12特异性的鉴定参考许保疆(许保疆等.抗猪瘟病毒单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定.华北农学报，2009,24(3):64-68)采用间接elisa法测定。分别将猪瘟病毒(csfv)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、猪2型圆环病毒(pcv2)、猪细小病毒(ppv)、prvhn1201株gd蛋白(按专利cn104248757a制备)、sf9细胞培养物抗原(阴性对照)、gb蛋白(阳性对照)依次作为包被抗原，将制备的单克隆抗体3c12、5g12作为一抗进行检测，读取反应的吸光度od值，根据p/n值(p表示样品对应的od值，n表示阴性对照对应的od值)判定制备的单克隆抗体与其它抗原的交叉反应性，以p/n值≥2.0为阳性，从而判断其特异性。结果：鼠单克隆抗体3c12、5g12与其他病毒和阴性对照均不反应，仅与prvgb蛋白发生反应，表明鼠单克隆抗体3c12、5g12为针对prvgb蛋白的特异性单克隆抗体。2.3.3单克隆抗体中和活性的测定按《中国兽药典》2015版所述固定病毒稀释血清法测定鼠单克隆抗体3c12、5g12的中和效价，先将鼠单克隆抗体3c12、5g12的不同稀释倍数(1:1v/v-1:2048v/v)与新鲜兔血清混合，再与pk15细胞于37℃、5％co2条件下孵育1小时，分别加入prv经典株fa株与ma株(均购自中国兽药监察所)，疫苗株bartha株(购自中国兽药监察所)及变异株hn1201株的病毒稀释液(均含100tcid50/ml)，置37℃、5％co2条件下培养72-120小时观察细胞病变，并计算中和效价，结果见表4。表4：单克隆抗体对不同毒株的中和效价单克隆抗体hn1201株bartha株ma5g121:147.61:426.61:50.13c12000结果显示：单克隆抗体5g12在有补体存在情况下，具有中和活性，对3个毒株的中和效价≥1:50.1；单克隆抗体3c12不论在有无补体的情况下，均没有中和活性。据此，可将两株单克隆抗体用于prvgb蛋白结构解析等机理研究，如表位鉴定研究、定性和定量鉴别检验含猪伪狂犬病病毒抗原和其他抗原的疫苗组合物中猪伪狂犬病病毒抗原的检测等。2.3.4单克隆抗体可变区序列的测定根据鼠源单克隆抗体的序列特征，设计的重链可变区引物序列如下：p1：actagtcgacatgagagtgctgattct；p2：gggaattcatgraatgsasctgggtywty。设计的轻链可变区引物序列如下：p3：actagtcgacatggtyctyatvtccttgctg。p4：actagtcgacatgggcwtcaagatgragtcacakwy。按照张爱华等(张爱华，闭兰，王志友等.系列鼠抗cd分子单克隆抗体轻、重链可变区基因的克隆和序列分析.中国生物制品学杂志，2001,15(2):65-68)建立的可变区序列测定方法，通过分子克隆技术分别获得鼠单克隆抗体3c12、5g12的可变区序列，选取对应的克隆质粒送至苏州金维智生物科技有限公司进行测序。结果，鼠单克隆抗体3c12的重链可变区、轻链可变区的基因序列分别如seqidno.1、seqidno.3所示，由其推导的氨基酸序列分别为seqidno.2、seqidno.4；鼠单克隆抗体5g12的重链可变区、轻链可变区的基因序列分别如seqidno.5、seqidno.7所示，由其推导的氨基酸序列分别为seqidno.6、seqidno.8。实施例3：猪伪狂犬病病毒免疫组化试剂盒的制备及应用3.1免疫组化方法的建立免疫组化的方法包括以下步骤：1)取材：采集猪的扁桃体、脑、肺等组织样品，迅速置于福尔马林中进行固定，必要时对其进行适当修块。2)石蜡切片的制备：用固定液固定、流水冲洗后再用自动脱水机进行脱水、透明、浸蜡，用包埋机包埋后切片、展片、裱片于已处理的玻片上，烤片后获得石蜡切片；3)抑制内源性酶将玻片脱蜡至蒸馏水，滴加3％h2o2静置以抑制内源性酶。4)抗原修复用抗原热修复如高压热修复、煮沸热修复、微波热修复，或酶消化法处理烤片后的玻片以修复抗原。5)封闭用磷酸盐缓冲液洗涤3次，滴加封闭液如马血清或牛血清白蛋白bsa封闭；6)染色吸去封闭液后加入稀释的一抗，室温孵育1小时或37℃孵育45-60分钟或2-8℃孵育过夜；用磷酸盐缓冲液洗涤3次，加入酶标的羊抗鼠二抗，室温孵育1小时或37℃孵育45-60分钟。7)显色用磷酸盐缓冲液洗涤3次，加入aec或dab显色液显色，视染色情况用磷酸盐缓冲液或蒸馏水终止；加入苏木素衬染细胞核以复染，必要时进行脱水、透明，封片、镜检。3.2免疫组化用一抗的筛选将实施例2制备的3株鼠单克隆抗体3c12、5g12、1d10(纯化后的腹水)作为一抗，按1:50-1:1600的倍比稀释后对prvhn1201株、fa株、ma株分别攻毒后收集临床病料，按照实施例3.1所述方法进行免疫组化检测，结果见表5。表5：免疫组化用一抗的筛选结果从表5可知：鼠单克隆抗体5g12用于prvhn1201株、fa株、ma株的免疫组化反应时效价为1:800-1:1000，效价较高且背景干净；而其余2株鼠单克隆抗体3c12、1d10的效价较低甚至无效价或背景高，无法有效地得到应用。3.3临床应用将临床收集的278份扁桃体、脑、肺等组织样品经北京世纪元亨动物防疫技术有限公司prvpcr试剂盒检测出207份阳性、71份阴性；并将207份阳性进行测序，结果发现有158份为prv变异株，其余为prv经典株。用鼠单克隆抗体5g12v/v1:800作为一抗按实施例3.1所述免疫组化方法进行检测，结果见表6。表6：免疫组化与pcr检测结果比较由表6可知：免疫组化与pcr方法的阳性符合率为86％，阴性符合率为100％，总符合率为90％；另prv的感染集中于细胞核上和细胞质内，以脑部组织病变(占所有脑部组织样品的91％)最为突出。另外，此次278份有90份阳性临床样品为4头(20份/头)发病猪的扁桃体、脑、肺组织样品(每种各6份)，为连续5天采集的发病猪的脑组织样品，通过免疫组化连续跟踪发现：4头猪的病变均由最初的扁桃体、肺脏逐渐转入到脑部。综上所述，所建立的免疫组化方法，解决了pcr不能在组织和细胞内进行明确定位、无法跟踪病原在机体的动态分布的问题。实施例4：猪伪狂犬病病毒elisa检测试剂盒的制备及应用4.1elisa试剂盒的制备包被微孔板1：将0.1-0.15μg/ml鼠单克隆抗体3c12包被于微孔板中，置2-8℃包被过夜或37℃包被1小时，用样品洗涤液洗2-3遍并拍干或抽干，用封闭液于37℃封闭2小时，用样品洗涤液洗2-3遍并拍干或抽干，获得包被有鼠单克隆抗体3c12的微孔板。酶标抗体1：用过碘酸钠法标记纯化的鼠单克隆抗体5g12，所用酶为辣根过氧化物酶hrp或碱性磷酸酶ap，经鉴定酶标后抗体含量为1.5mg/ml，标记率为0.8；使用时按v/v1:5000-1:7000任意倍数稀释。包被微孔板2：将0.15-0.20μg/ml鼠单克隆抗体5g12包被于微孔板中，置2-8℃包被过夜或37℃包被1小时，用样品洗涤液洗2-3遍并拍干或抽干，用封闭液于37℃封闭2小时，用样品洗涤液洗2-3遍并拍干或抽干，获得包被有鼠单克隆抗体5g12的微孔板。酶标抗体2：用过碘酸钠法标记纯化的鼠单克隆抗体3c12，所用酶为辣根过氧化物酶hrp或碱性磷酸酶ap，经鉴定酶标后抗体含量为1.6mg/ml，标记率为0.9；使用时按v/v1:5000-1:6000任意倍数稀释。伪狂犬病病毒gb蛋白标准品：实施例1制备的prvgb1。样品稀释液：磷酸盐缓冲液。洗涤液：含0.05％v/vtween-20的磷酸盐缓冲液。所述显色液包括a液和b液，所述a液为20mgtmb中加入10ml无水乙醇后用双蒸水定容至100ml，混匀后无菌分装获得的溶液；b液为2.1g柠檬酸、2.82g无水na2hpo4、0.75％的过氧化氢和0.64ml尿素用双蒸水溶解并定容至100ml，混匀后无菌分装获得的溶液。终止液：2m的h2so4溶液。将包被的微孔板1、酶标抗体1、样品稀释液、洗涤液、标准品、显色液、终止液组装成试剂盒1；将包被的微孔板2、酶标抗体2、样品稀释液、洗涤液、标准品、显色液、终止液组装成试剂盒2。4.2elisa试剂盒检测方法的建立检测方法包括：步骤①将伪狂犬病病毒gb蛋白标准品用样品稀释液稀释至640ng/ml后进行2倍倍比稀释，即320、160、80、40、0ng/ml；将待检样品如实施例1制备的prvgb2、prvgb3、prvgb4、prvgb5用样品稀释液稀释进行1:(50-100)的体积稀释；然后将标准品系列稀释液、待检样品稀释液同时按100μl/孔加入微孔板中，封板并置37℃温育45-90min或室温孵育60min。步骤②弃反应液，用洗涤液洗涤2-4次，拍干或抽干。步骤③将稀释后的酶标抗体按100μl/孔加入后封板并置37℃温育30-45min或室温孵育45min。步骤④弃反应液，用洗涤液洗涤2-4次，拍干或抽干。步骤⑤加显色液a液、b液各50μl/孔，置37℃温育10min或室温孵育15min。步骤⑥加终止液50μl/孔，10min内用酶标仪读取od450nm处的吸光度值；步骤⑦根据标准品系列稀释液的吸光度值绘制标准曲线，并根据绘制的标准曲线计算待检样品中prvgb蛋白的含量。4.3elisa试剂盒的优化将一个单克隆抗体按照0.6、0.4、0.3、0.2、0.15、0.1、0.075、0.05、0.0375、0.025、0.01875、0.0125μg/ml12个梯度纵向包被微孔板；将另一抗体酶标后按照1:4000、1:5000、1:6000、1:7000、1:8000、1:100006个梯度稀释后，对2μg/ml的实施例1制备的prvgb1进行夹心elisa检测。选择p/n即样品值/阴性值最高孔所对应的抗体浓度，分别作为包被抗体及酶标抗体最佳工作浓度。按此试验方案分别建立以鼠单克隆抗体3c12为包被抗体与酶标抗体5g12配对的检测方法，及以鼠单克隆抗体5g12为包被抗体与酶标抗体3g12配对的检测方法，分别检测梯度稀释的gb蛋白样品，以蛋白浓度为横坐标，吸光度od值为纵坐标，绘制曲线，计算双抗体夹心elisa的线性范围及相关系数。选择线性范围大且相关系数高的配对方式，作为最优配对，以实现对抗原的准确检测。结果：试剂盒1，以鼠单克隆抗体3c12为包被抗体且包被浓度为0.1-0.15μg/ml，鼠单克隆抗体5g12酶标后做为酶标抗体(1:5000-1:7000)的配对方式，检测的线性范围大(0-640ng/ml)且相关系数高(≥99％)；而试剂盒2，以5g12为包被抗体(0.15-0.20μg/ml)为包被抗体，3c12酶标后做为酶标抗体(1:5000-1:6000)的配对方式，线性范围为0-320ng/ml，相关系数为97％左右。从检测线性范围宽及节省原材料的角度，故选择试剂盒1进行后续试验。4.4elisa试剂盒的应用将实施例1制备的prvgb1分别稀释至50、100、200、500ng/ml进行加标回收试验，按实施例4.2所述方法分别重复检测5次。结果：根据标准品系列稀释液的吸光度值绘制的标准曲线为y＝0.0037x+0.0949，r2＝0.9972；根据prvgb1稀释液50、100、200、500ng/ml对应的吸光度od450nm值，计算各自的加标回收率和变异系数，结果见表7。表7：抗原加标回收试验结果从表7可知：本试剂盒及方法准确度高、重复性好，可用于实际样品的检测。将实施例1制备的prvgb2、prvgb3、prvgb4、prvgb5用样品稀释液稀释1:50-1:100，按实施例4.2所述方法对进行定量检测，结果为：prvgb2、prvgb3、prvgb4、prvgb5中相应的prvgb蛋白部分的含量分别为2.735、4.213、8.013、11.021μg/ml，可根据此结果准确配制疫苗用于动物免疫。应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。sequencelisting<110>洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司<120>与伪狂犬病病毒gb蛋白结合的单克隆抗体及其应用<130>2017<160>8<170>patentinversion3.3<210>1<211>357<212>dna<213>鼠单克隆抗体3c12重链可变区核苷酸序列<400>1tctgatgtgcaacttcaggagtcgggacctggcctggtgaaaccttctcagtctctgtcc60ctcacctgcactgtcactgactactcaatcaccagtgattatgcctggcactggatccgg120caatttccaggaaataaagtggagtggatgggctacataaactacagtggtggcactagc180tacaacccatctctcaaaagacgaatctctatcactcgagacacatccaggaaccagttc240ttcctgcagttgaattctgtgactactgaggacacatccacatattactgtgcaagaggg300ggattacgacgggggtttgctgattggggccaagggactctggtcactgtctctgca357<210>2<211>119<212>prt<213>鼠单克隆抗体3c12重链可变区氨基酸序列<400>2seraspvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproser151015glnserleuserleuthrcysthrvalthrasptyrserilethrser202530asptyralatrphistrpileargglnpheproglyasnlysvalglu354045trpmetglytyrileasntyrserglyglythrsertyrasnproser505560leulysargargileserilethrargaspthrserargasnglnphe65707580pheleuglnleuasnservalthrthrgluaspthrserthrtyrtyr859095cysalaargglyglyleuargargglyphealaasptrpglyglngly100105110thrleuvalthrvalserala115<210>3<211>324<212>dna<213>鼠单克隆抗体3c12轻链可变区核苷酸序列<400>3gacattcagatgacccagtctcctgcctcccagtctgcatctctgggagaaagtgtcacc60atcacatgcctggcaagtcagcccattggtacatggttagcatggtatcagcagaaacca120ggaaaatctcctcagctcctgatttatgttgcaaccagcgtggcagatggggtcccttca180aggttcagtggtagtggatctggcacaaaattttctttcaagatcagcagcctacaggct240gaagatgttgcaagttattactgtcaacaactttacagtaatccgtacacgttcggaggg300gggaccaagctggaaataaaacgg324<210>4<211>108<212>prt<213>鼠单克隆抗体3c12轻链可变区氨基酸序列<400>4aspileglnmetthrglnserproalaserglnseralaserleugly151015gluservalthrilethrcysleualaserglnproileglythrtrp202530leualatrptyrglnglnlysproglylysserproglnleuleuile354045tyrvalalathrservalalaaspglyvalproserargphesergly505560serglyserglythrlyspheserphelysileserserleuglnala65707580gluaspvalalasertyrtyrcysglnglnleutyrserasnprotyr859095thrpheglyglyglythrlysleugluilelysarg100105<210>5<211>357<212>dna<213>鼠单克隆抗体5g12重链可变区核苷酸序列<400>5gaggtccagctgcagcagtctggacctgagctagtgaagactggggcttcagtgaagata60tcctgcaaggcttctggtttctctttcactagatactacatacactgggtcaaacagaga120catggagagagtgttgactggattggatatattaattgttacagtggtactactgactac180caccagaagttcaagggcaaggccacatttactgtcgacaccccctccagcacagcctac240atgcagttcaacagcctgacatctgaagactctgcggtctattactgtatatataggtac300gacggtcggggttcaacggactactggggtcaaggaacctcactcaccgtctcctca357<210>6<211>119<212>prt<213>鼠单克隆抗体5g12重链可变区氨基酸序列<400>6gluvalglnleuglnglnserglyprogluleuvallysthrglyala151015servallysilesercyslysalaserglypheserphethrargtyr202530tyrilehistrpvallysglnarghisglygluservalasptrpile354045glytyrileasncystyrserglythrthrasptyrhisglnlysphe505560lysglylysalathrphethrvalaspthrproserserthralatyr65707580metglnpheasnserleuthrsergluaspseralavaltyrtyrcys859095iletyrargtyraspglyargglyserthrasptyrtrpglyglngly100105110thrserleuthrvalserser115<210>7<211>333<212>dna<213>鼠单克隆抗体5g12轻链可变区核苷酸序列<400>7gacattgtgctgtcccaatctccagcttctttggctgtgtctctagggcagagggccacc60atctcctgcagagccagcgaaagtgttgataattttggcattagttttatgagctggttc120caacagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatgctgcatccaacctaggatcc180ggggtccccgccaggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcagcctcaacatccat240cctatggaggaggatgatactgcattctatttctgtcagcaaagtaaggaggttccgtgg300acgttcggtggaggctccaagctggaaatcaaa333<210>8<211>111<212>prt<213>鼠单克隆抗体5g12轻链可变区氨基酸序列<400>8aspilevalleuserglnserproalaserleualavalserleugly151015glnargalathrilesercysargalasergluservalaspasnphe202530glyileserphemetsertrppheglnglnlysproglyglnpropro354045lysleuleuiletyralaalaserasnleuglyserglyvalproala505560argpheserglyserglyserglythrasppheserleuasnilehis65707580prometglugluaspaspthralaphetyrphecysglnglnserlys859095gluvalprotrpthrpheglyglyglyserlysleugluilelys100105110当前第1页12