用于鉴别辽参的实时荧光PCR引物检测方法及应用与流程

本发明涉及一种海参的检测方法，尤其是一种快速、低成本、无污染及操作方便的用于鉴别辽参的实时荧光pcr引物及方法。

背景技术：

海参（seacucumbers,holothurians）属于棘皮动物门海参纲，广义的海参包括海参纲所有的种类。海参同人参、燕窝、鱼翅齐名，是世界八大珍品之一，不仅是珍贵的食品，也是名贵的药材。据《本草纲目拾遗》中记载：海参，味甘咸，补肾，益精髓，摄小便，壮阳疗痿，其性温补，足敌人参，故名海参。研究表明海参具有提高记忆力、延缓性腺衰老，防止动脉硬化以及抗肿瘤等作用。我国海域出产的可以食用的海参有20多种，辽参（仿刺参）主要产于黄海、渤海海域，又称北方刺参，由于体壁厚，营养价值丰富，是刺参中的顶级佳品，尤其大连海域的仿刺参，更被称为“参中之冠”。但是目前市场上出现了冒充产地，以次充好的问题。

传统海参的鉴别方法主要是观察其外部形态特征，但如果失去原有的形态（胶囊、含片等），则给鉴定造成很大干扰，工作强度大且准确性低。随着分子生物学的发展，dna条形码作为生物鉴定的“有效身份证”被广泛应用。由于线粒体细胞色素c氧化酶亚基i(cytochromeoxidasesubunitigene,coi)具有分子结构简单、严格的母系遗传、无重组、易扩增、进化速率快、多拷贝等优点，被选为dna条形码动物种类鉴别的通用引物。实时荧光pcr技术可以直接对其源性成分进行检测，由于在整个操作过程中都进行闭管操作，可有效减少实验过程中的污染危险且具有较高的灵敏度、特异性和准确性，但迄今为止，还没有关于采用实时荧光pcr技术鉴别辽参的相关报道。

技术实现要素：

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种快速、低成本、无污染及操作方便的用于鉴别辽参的实时荧光pcr特异引物及方法。

本发明的技术解决方案是：一种用于鉴别辽参的实时荧光pcr引物,其特征在于所述引物核苷酸序列如下：

特异引物：

上游引物hs-coif：5'tccagacatggctttcccac3'，

下游引物hs-coir：5'agaattgaggaggcaccagc3'；

通用引物：

上游引物hs-16sf：5'aaaacagaaagacgagaagaccct3'，

下游引物hs-16sr：5'cgctgttatccctgcggtag3'。

一种用于鉴别辽参的实时荧光pcr方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：

a.提取待测样品dna；

b.以所得到的dna为模板,分别以特异引物和通用引物进行实时荧光pcr扩增，所用引物的核苷酸序列如下：

特异引物：

上游引物hs-coif：5'tccagacatggctttcccac3'，

下游引物hs-coir：5'agaattgaggaggcaccagc3'；

通用引物：

上游引物hs-16sf：5'aaaacagaaagacgagaagaccct3'，

下游引物hs-16sr：5'cgctgttatccctgcggtag3'。

c.分别检测特异引物和通用引物进行实时荧光pcr扩增曲线ct值,如特异引物和通用引物实时荧光pcr均有扩增曲线ct值,则被测样本为辽参。

所述实时荧光pcr扩增的反应体系为:2×sybrgreenmix10µl，浓度1µmol/ml的引物各0.2~1µl，50×rox0.4µl，浓度1~20ng/µl的dna模板2.0µl，用双蒸水补足至20µl；反应条件为95℃，2min；95℃，10s；64℃，35s，检测荧光信号；40个循环。

本发明是以被测样本的dna为模板，分别以特异性引物和通用性引物进行实时荧光pcr扩增，如特异引物和通用引物实时荧光pcr均有扩增曲线ct值,则被测样本为辽参，确保辽参鉴别的准确性。dna用量少，操作简便，闭管操作减少污染，可快速（提取dna后2h内）完成辽参的检测，具有通量大、特异性强、灵敏度高等特点，克服了传统形态学鉴定和显微鉴别存在的问题，为辽宁仿刺参的检测和鉴别提供准确可靠的方法。

附图说明

图1本发明实施例被测样本为辽参的特异引物及通用引物实时荧光pcr扩增曲线图。

图2本发明实施例被测样本非辽参的特异引物及通用引物实时荧光pcr扩增曲线图。

图3为本发明实施例被测样本为辽参的熔解曲线图。

图4为本发明实施例被测样本为非辽参的其它海参熔解曲线图。

图5是本发明实施例被测样本为辽参的特异引物灵敏度扩增曲线图。

图6是本发明实施例被测样本为辽参的通用引物灵敏度扩增曲线图。

具体实施方式

本发明在引物设计方面，选择coi基因和16srdna作为目标靶基因，在genbank搜索并下载辽宁仿刺参及常见伪品coi和16srdna基因序列，通过mega5分析软件比对设计特异引物（目的片段210bp）和通用引物（目的片段204bp）的核苷酸序列如下：

特异引物：

上游引物hs-coif：5'tccagacatggctttcccac3'，

下游引物hs-coir：5'agaattgaggaggcaccagc3'；

通用引物：

上游引物hs-16sf：5'aaaacagaaagacgagaagaccct3'，

下游引物hs-16sr：5'cgctgttatccctgcggtag3'。

本发明的用于鉴别辽参的实时荧光pcr检测方法，依次按照如下步骤进行：

a.提取待测样品dna；

b.以所得到的dna为模板,分别以特异引物和通用引物进行实时荧光pcr扩增，所用引物的核苷酸序列如下：

特异引物：

上游引物hs-coif：5'tccagacatggctttcccac3'，

下游引物hs-coir：5'agaattgaggaggcaccagc3'；

通用引物：

上游引物hs-16sf：5'aaaacagaaagacgagaagaccct3'，

下游引物hs-16sr：5'cgctgttatccctgcggtag3'。

c.分别检测特异引物和通用引物进行实时荧光pcr扩增曲线ct值,如特异引物和通用引物实时荧光pcr均有扩增曲线ct值,则被测样本为辽参。

具体如下：

本发明实施例所用实验材料、试剂与仪器如下：

实验材料：

辽宁仿刺参（分别来自辽宁瓦房店、普兰店、长海县、庄河、旅顺、金州）、北大西洋瓜参、糙海参、加州拟刺参、绿刺参、巨梅花参、花刺参、黄玉参、大赤参、海茄子参、蜻蜓、鹿。

实验试剂：

动物组织dna提取试剂盒，dna分子量makerdl2000及pcr等反应试剂购自宝生物工程（大连）有限公司；引物由生工生物工程（上海）有限公司负责合成，2×sybrgreenmix为宝生物工程（大连）有限公司商品。

所用仪器：

abi7500荧光定量pcr仪为abi公司产品，takarapcr仪为宝生物工程（大连）有限公司产品，5424d型高速离心机为eppendorf公司产品。

pcr扩增反应在至少2通道型号的荧光定量pcr仪上进行，根据不同型号的pcr仪的不同要求可以对标记荧光号进行相应的调整。

1.样本dna提取是采用动物组织dna提取试剂盒提取，具体操作步骤见试剂盒说明书。提取的基因组dna经紫外分光光度计测定其纯度和浓度，测定od260/od280值均为1.8～1.9左右，浓度在10ng/μl以上，说明dna纯度较高，浓度适中，符合pcr扩增要求。

2.实时荧光pcr扩增的反应体系为:2×sybrgreenmix10µl，浓度1µmol/ml的上游引物和下游引物各1µl，50×rox（参比荧光）0.4µl，浓度1~20ng/µl的dna模板2.0µl，用双蒸水补足至20µl；反应条件为95℃，2min；95℃，10s；64℃，35s，收集荧光信号；40个循环。

实时荧光pcr扩增结束后，给出δrn（第n个循环时的荧光增加值），得到扩增曲线ct值，具体结果如表1。

表1

辽宁仿刺参的扩增曲线如图1所示，特异引物及通用引物实时荧光pcr扩增时均有扩增曲线ct值。非辽宁仿刺参的其它海参扩增曲线如图2所示，特异引物实时荧光pcr扩增时未见扩增曲线ct值，通用引物实时荧光pcr扩增时有扩增曲线ct值。

图1、图2表明：特异引物及通用引物实时荧光pcr扩增时均有扩增曲线ct值，被测样本为辽宁仿刺参；特异引物实时荧光pcr扩增时未见扩增曲线ct值且通用引物实时荧光pcr扩增时有扩增曲线ct值，则被测样本为非辽宁仿刺参的其它海参。以上可作为鉴定正品辽宁仿刺参的依据，即如特异引物和通用引物实时荧光pcr均有扩增曲线ct值,则被测样本为辽参。

特异引物及通用引物实时荧光pcr扩增时均未见扩增曲线ct值，则被测样本可能是非海参或所提取的dna不符合实时荧光pcr的要求。本发明可避免单独使用特异引物进行实时荧光pcr因所提取的dna不符合要求而出现误判断的可能。

实施例2：

取市售样本15份来自大连、山东青岛等不同地区的海参市场、产品价格高低不等，采用本发明提供的检测方法进行检测，检测结果如表2。

表2

实验例1：引物特异性验证

本发明熔解曲线扩增条件：95℃15s，60℃1min，95℃30s，60-95℃过程中检测荧光信号，60℃15s。

本发明实施例被测样本为辽参的熔解曲线图如图3所示：特异引物及通用引物的熔解曲线同时存在且峰单一，说明引物的特异性好。

本发明实施例被测样本为非辽参的其它海参的熔解曲线图如图4所示，特异引物没有曲线峰值，只有通用引物的熔解曲线同时且峰值不单一，说明引物的特异性好。

实验例2：灵敏度实验

将来自瓦房店的辽宁仿刺参的基因组dna定量到50ng，按10×梯度稀释，每个梯度均取2.0μl为模板量，（即：10ng、1ng、0.1ng、0.01ng和0.001ng）进行实时荧光定量pcr检测，评估本发明的检测限。本发明实施例被测样本为辽参的特异引物灵敏度扩增曲线图如图5所示，本发明实施例被测样本为辽参的通用引物灵敏度扩增曲线图如图6所示。结果表明本发明检测限为0.01ng，说明本发明所提供的方法具有很高的灵敏度。

序列表

<110>大连长生岛集团有限公司

<120>用于鉴别辽参的实时荧光pcr引物及方法

<160>4

<210>1

<211>20

<212>dna。

<213>人工序列

<400>1

tccagacatggctttcccac20

<210>2

<211>20

<212>dna。

<213>人工序列

<400>2

agaattgaggaggcaccagc20

<210>3

<211>24

<212>dna。

<213>人工序列

<400>3

aaaacagaaagacgagaagaccct24

<210>4

<211>20

<212>dna。

<213>人工序列

<400>4

cgctgttatccctgcggtag20