一种山药多糖‑铬配合物的制备方法及其应用与流程

本发明涉及一种山药多糖-铬配合物的制备方法及其应用，属于医药领域。

背景技术：

糖尿病是严重威胁人类生命健康的疾病，全世界都致力于糖尿病新型药物的研究与开发，寻找有效、安全、不良反应小的治疗糖尿病的药物一直是药物研发者的目标，从天然药物中寻找降血糖的有效成分是一条重要的途径。众所周知，几乎所有疾病的产生都与自身免疫力下降有关，或由于疾病导致机体免疫力下降。多糖有免疫调节、抗肿瘤、降血糖、抗氧化等作用。其中降血糖、免疫调节作用是多糖的共性，也是其主要药理活性。山药是药食两用中药，具有良好的降血糖功能。山药多糖促进胰岛素分泌，其作用机制可能是通过增加胰岛素的分泌，并且有清除自由基的作用，干扰胰岛细胞受破化的机制，从而改善ii型糖尿病。研究发现在四氧嘧啶造模的小鼠中山药多糖给药后血糖下降明显，fasl蛋白表达也得到一定程度的抑制。此外粗山药多糖还能提高己糖激酶、琥珀酸脱氢酶以及苹果酸脱氢酶的活性，推测山药多糖支持或者改善了动物体内的糖代谢。

山药多糖经过分离纯化后作为药物喂食动物，发现小鼠的血清igg含量、nk细胞活性、血清溶血素活性等判断免疫力提高的各项指标均有所提升，能显著提高动物体的非特异性免疫和特异性免疫。尤其是山药多糖还对小鼠免疫性肝损伤有保护作用，文献表明山药多糖有自由基清除作用，分析认为山药多糖是通过促进谷胱甘肽酶的合成来提高机体的免疫力。

铬是正常碳水化合物和脂类代谢所必需的微量元素，三价铬参与糖代谢，是维持动物及人体正常的葡萄糖耐量不可缺少的元素，无论是自然条件还是实验条件下，缺铬都可使组织对胰岛素的敏感性降低，胰岛素是糖代谢的核心物质，而胰岛素发挥作用，又必须有铬氧元素参加。除外，铬对动物还具有较强的提高免疫和抗应激作用。过去动物补铬通常采用无机铬盐，但结果不能达到所期待的效果。

国内外学者对糖类物质与铬配合物的研究已经取得相当大的进展。多糖分子的主要作用是使能够与金属离子形成配合物，在机体内多糖分子的吸收程度高，加入一些有免疫调节功能的微量元素后，可以被作为一种亲和力高的药物使用。魔芋精粉用酶降解后的葡甘露寡糖，与三价铬离子配合后使用化学分析手段证明了是羟基与铬的空轨道形成络合物，并进行了降血糖实验取得阳性报道。国内外对多糖铬配合物的生理生化实验报道已经有很多，但是山药多糖铬未见报道。通过文献阅读，发现山药多糖具有降血糖和提高免疫力的作用，并且容易吸收。重要的是多糖类物质可以dna损伤起到保护作用，而三价铬离子在治疗ⅱ型糖尿病的过程中，容易出现了淋巴细胞dna损伤，如果能够以配位化合物的形式将两者结合，可能发挥更好的降血糖和免疫调节作用。

鉴于此，如果将山药多糖与金属离子螯合，其性能也必将发生很大的改善。由于多糖有丰富的羟基，是很好的配体，而cr有空3d轨道是很好的中心离子，只要条件合适必将形成稳定的螯合物。本项目用山药多糖与cr螯合形成山药多糖-cr螯合物，研究其配位结构和抗糖尿病的效果，实验表明，山药多糖-铬配合物显著降低高血糖小鼠的血糖作用，其降血糖作用强于无机铬和山药多糖，在一定剂量下还优于阳性对照药物二甲双胍。免疫力功能显示：与山药多糖比较，在外周血白细胞数、细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、nk细胞活性测定五个测定指标中结果宣示阳性，即山药多糖-铬配合物比山药多糖有更强的提高免疫力功能的作用。因而可用于制备抗糖尿病、免疫调节剂的药物和保健食品中。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术不足，提供一种山药多糖-铬配合物的制备方法及其应用。

本发明原料易得，配合物制备工艺简单，价廉，生产方便，开发价值高，制得的山药多糖-铬配合物具有显著降低动物血糖和提高免疫力功能，可用于制备抗糖尿病、免疫调节剂的药物和保健食品中，可为开发系列新型高效、安全、不良反应小的治疗糖尿病免疫调节剂的药物和活性多糖-金属螯合物的研究开发奠定基础。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种山药多糖-铬配合物的制备方法，所述山药多糖与铬自组装反应形成配合物，配合物中铬的质量分数为5.1%，配合物制备方法包括如下步骤：

（1）通过水提醇沉法从山药饮片中获得山药粗多糖；

（2）山药粗多糖经提纯处理后得到纯化后的山药多糖；

（3）将步骤（2）纯化后的山药多糖于60℃下溶解于水中，随后在90℃水浴条件下将山药多糖溶液调节ph=8，在不出现沉淀的情况下，用胶头滴管缓慢滴加crcl3水溶液（浓度为2mol/l）和naoh溶液（浓度为2mol/l），注意维持溶液的ph=8；直到溶液中出现絮状沉淀再滴3~5滴crcl3水溶液，保持70℃～90℃加热3h；

（4）将步骤（2）所得溶液进行离心并取上清液，加入95wt%乙醇，冷却静置离心收集沉淀；分别用无水乙醇、丙酮和乙醚搅拌振荡洗涤沉淀物并减压干燥，获得浅绿色山药多糖-铬配合物粗品；

（5）将步骤（4）所得山药多糖-铬配合物溶于水中，用透析袋透析，透析后样品浓缩冷冻干燥，得到纯化后的山药多糖-铬配合物。

步骤（2）中所述山药多糖的提纯处理，具体包括以下步骤：

（a）酶溶液的配制：准确称取0.1g胰蛋白酶，磷酸缓冲液10ml，在37℃水浴锅内溶解，得到10mg/ml的胰蛋白酶溶液，备用；

（b）准确称取5g山药粗多糖溶于500ml磷酸缓冲液中，加入2ml步骤（a）配制的胰蛋白酶溶液，置于37℃水浴锅内水浴加热3小时；

（c）将酶解后的粗多糖溶液置于沸水中灭酶10分钟，室温下冷却并离心弃去沉淀，上清液加入2ml的sevage溶液（氯仿和正丁醇按照体积比为3~4:1混合而成），摇床以100r/min的速率摇10min并静置30min，离心后取上清液，再往上清液中加入2~5mlsevage溶液，此过程分别重复3~5次；然后加入4~5倍体积95wt%乙醇，冷却静置离心收集沉淀；分别用无水乙醇、丙酮和乙醚搅拌荡洗涤沉淀物，离心收集沉淀并减压干燥，收集山药多糖；

（d）将步骤（c）得到的山药多糖溶于水中，并装入透析袋中透析过夜，透析后样品浓缩冷冻干燥，得到纯化后的山药多糖。

将上述制得的山药多糖-铬配合物应用于抗糖尿病的活性试验研究，通过对糖尿病小鼠的降血糖活性的研究，结果显示山药多糖-铬配合物显著降低高血糖小鼠的血糖作用，其降血糖作用强于无机铬和山药多糖，在一定剂量下还优于阳性对照药物二甲双胍。

将上述山药多糖-铬配合物应用于免疫调节活性试验研究，通过对小鼠免疫调节活性的研究，结果显示山药多糖-铬配合物比山药多糖有更强的提高免疫力功能的作用。

本发明的有益效果：

（1）山药多糖--铬配合物目前尚未有合成和具有抗糖尿病、提高免疫功能的活性研究报道，本发明可用于制备抗糖尿病、免疫调节剂的药物和保健食品中，此新型化合物其最大优点是山药多糖为天然产物提取物，可药食两用；而铬是正常碳水化合物和脂类代谢所必需的微量元素，三价铬参与糖代谢，是维持动物及人体正常的葡萄糖耐量不可缺少的元素，同时又具有较强的提高免疫和抗应激作用；二者形成螯合物后其性能将发发生较大变化，不但能更好发挥原有配体和金属离子的功能，可能还具有其他的功能。与现有抗糖尿病药相比，无毒副小，无不良反应，可长期使用，且还具有调节免疫力双重作用；

（2）制得的山药多糖-铬配合物可用于制备抗糖尿病、免疫调节剂的药物，也可用于制备保健食品；

（3）原料易得，配合物制备工艺简单，价廉，生产方便，开发价值高，可为开发系列新型高效、安全、不良反应小的治疗糖尿病免疫调节剂的药物和活性多糖-金属螯合物的研究开发奠定基础。

附图说明

图1为无机铬盐紫外-可见光谱；

图2为山药多糖-铬配合物紫外-可见光谱；

图3为山药多糖红外吸收谱图；

图4为山药多糖-络合物红外光谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅仅限于这些实施例。

实施例1

1山药粗多糖的提纯

（1）酶溶液的配制：准确称取0.1g胰蛋白酶，磷酸缓冲液（ph=7.0）中10ml，在37℃水浴锅内溶解，得到10mg/ml的胰蛋白酶溶液；

（2）准确称取5g山药粗多糖溶于500mlph=7的磷酸缓冲液中，加入2ml配制的胰蛋白酶溶液，置于37℃水浴锅内水浴加热3小时；

（3）粗多糖溶液经酶解后，置于沸水中灭火酶10分钟，室温下冷却并离心弃去沉淀，上清液加入2ml的sevage（氯仿:正丁醇=4:1）溶液，摇床以100r/min的速率摇10min并静置30min，3000r/min离心10min后取上清液，再往上清液中加入3.5ml的sevage试剂，此过程分别重复4次；加入5倍体积95wt%无水乙醇，冷却静置离心收集沉淀；分别用无水乙醇、丙酮、乙醚搅拌荡洗沉淀物，离心收集沉淀并减压干燥，收集山药多糖；

（4）将山药多糖溶于于适量水中，装入处理过的透析袋中夹紧，在流水中透析过夜，透析后样品浓缩冷冻干燥，得到纯化后的山药多糖。

2山药多糖与cr⁺³配合

（1）称取1g干燥的提纯山药多糖，于60℃加热溶解于10ml水中；

（2）在90℃水浴条件下将10ml山药多糖溶液调节ph=8，在不出现沉淀的情况下，用胶头滴管缓慢滴加预配制好的crcl3水溶液（2mol•l^-1）和naoh溶液（2mol•l^-1），注意维持溶液的ph=8；直到溶液中出现絮状沉淀再滴4滴crcl3水溶液溶液保持，90℃加热3h；3000r/min离心5min，收集沉淀物；上清液加入100ml的95wt%乙醇，冷却静置离心收集沉淀；合并沉淀物分别用无水乙醇、丙酮、乙醚搅拌荡洗沉淀物，离心，收集沉淀并减压干燥，获得浅绿色山药多糖-铬配合物粗品。

（3）将山药多糖-铬配合物粗品溶解于适量水中，装入透析袋中夹紧，在流水中透析过夜，透析后样品浓缩冷冻干燥，得到纯化后的山药多糖-铬配合物。

3山药多糖-铬配合物光谱分析

3.1紫外光谱分析

将山药多糖-铬合物配制成1wt%的水溶液，使用紫外-可见光谱仪扫描紫外光谱190-800nm，用水做参比，扫描速率为“慢”，采样间隔为0.1nm，并作无机铬水溶液紫外吸收光谱对照。

通过图1和图2对比发现，无机铬元素有两个特征吸收峰410nm与583nm；在山药多糖-铬配合物络合物的峰型上看，这两个吸收峰均发生不同程度的红移，这是由于三价铬的3d轨道由于受到山药多糖上羟基的作用，发生电子跃迁，产生红移。推测三价铬与山药多糖配位形成了配合物。

3.2红外光谱分析

按照山药多糖-铬配合物络合物与干燥溴化钾以1:100的比例磨成均匀粉末，压片机压片，在avatar360红外光谱仪上进行扫描，去除背景干扰，扫描范围为4000cm^-1-400cm^-1，测试分辨率为4cm^-1，扫描次数32次，并作多糖红外吸收光谱对照。通各个官能团的特征吸收进行分析。将无水干燥的样品与kbr混匀、研磨后压片，用红外光谱仪分析山药多糖、以及山药多糖-铬配合物的结构差异，结果如图3、4。

通过对比图3与图4红外谱图中可以发现，在缔合羟基（v-oh）伸缩振动，配合物的峰略小于配体山药多糖，振动峰也从3411cm^-1红移到了3439cm^-1，说明在配合物内部羟基与cr³⁺配位使山药多糖大分子内部许多氢键遭到破坏。而且在1450-1300cm^-1内的o-h面内变形振动和1160-1000cm^-1内的c-o伸缩振动均缩小，这两个证明c-oh存在特征峰减小说明，与山药多糖分子相比较，山药多糖铬络合物分子内部羟基减少，进一步佐证了配合物的形成。两图对比，骨架特征峰没有显著变化，推测cr³⁺只与其中一部分羟基配位，其基本碳骨架并没有发生改变。

3.3配合物中铬含量分析

山药多糖-铬配合物配合物硝酸和双氧水混合液消解，消解液用wfx-130a原子吸收分光光度计检测，检测条件：波长357.9nm，光谱带宽0.4nm，灯电流2ma，燃烧器高度8mm，空气压力0.3mpa，乙炔压力0.09mpa，空气流量6.5l·min^-1，乙炔流量2.5l·min^-1。

测得山药多糖-铬配合物中cr元素的质量比为（5.1%）。

4山药多糖-铬配合物的生物活性

4.1降血糖实验

4.1.1造模

用锡纸包裹装有柠檬酸缓冲液（ph=4.2～4.5）的试剂瓶，再以1%的浓度溶解stz，按空腹体重注射相应的stz。现配现用且需要避光，务必在30分钟内注射完毕。

小白鼠购回后预饲养3d，给予高脂肪饮食按照65mg/kg隔天两次腹腔注射(stz)链脲佐菌素诱导糖尿病模型,3天后禁食12h，尾静脉采血，accu-chek血糖仪测定空腹血糖，血糖大于11.1mmol·l^-1为造模成功。

4.1.2分组实验

造模成功小鼠均分成7个小组，每组10只，通过食物喂养研究糖尿病小鼠和空白对照组、阳性对照组的差异；对比山药多糖铬的机体吸收是不是比单独山药多糖和单独无机铬更好。实验分组及处理:见表1。每天灌胃直到15d末次给药后，禁食12h。

表1降血糖实验各组给药剂量

4.1.3空腹血糖值

将检测试纸插入血糖仪，剪短小鼠尾部1cm左右位置，小鼠血液滴在制定测定区域，读数。

4.1.4生长情况

开始各组实验前，小鼠分析天平称重，记录数据，实验结束后，小鼠脱颈处死，分析天平测量体重。

4.1.5实验结果

实验数据均采用spss19.0软件做分组方差齐性检验，后用用（lsd）分析方差齐的实验数据，不齐则采用tambane法进行统计。

在相对cr浓度一样的情况下，山药多糖中剂量组要明显比无机铬给药组具有更好的降血糖功效。虽然高剂量组平均值很低，但是个体差异大，失去统计学意义(p<0.05)。纯山药中性多糖虽然有一定的降血糖作用，但是在用量很大的情况下比二甲双胍低。

在降血糖实验中，实验证明了山药多糖铬具有一定的降血糖功能，但是短期内没有二甲双胍效果好，可能是由于造模为短期造模成功的。

表2糖尿病小鼠降血糖实验()

4.1.6降血糖试验小结

根据血糖实验结果，在相对cr浓度、山药多糖浓度一样的情况下，通过设置二甲双胍阳性对照组，糖尿病对照组等实验，研究了山药多糖-铬配合物的降血糖能力，在实验条件下，虽然中、低剂量组降血糖能力比阳性对照组弱，但各剂量要比无机铬、山药中性多糖给药组具有更好的降血糖功效，且中、低剂量表现明显，具有统计意义。可见，山药多糖-铬配合物比无机铬、山药多糖具有更好的降血糖功效。

4.2增强免疫力功能作用

4.2.1抵免疫模型小鼠增强免疫力实验

分组及模型：150只km小鼠（18~20g）分为5个大组，每大组分为5个小组（高剂量组、中剂量组、低剂量组、山药多糖组生理盐水组），每个小组6个重复。适量给予小鼠高压饲料和饮水，预饲养3天后每天开始灌胃给药，连续给药3周，按照剂量连续灌胃21d，剂量选择见表3-1，于第四周开始给予免疫抑制剂环磷酰胺腹腔注射，环磷酰胺腹腔注射40mg/kg，连续注射2d，注射后第五天测定各项指标。进行预给药和低免疫模型相结合的实验。

4.2.2外周血白细胞数测定

取50µl8%edta·k2于1ml离心管内制作成抗凝管，干净无菌眼科镊子摘除小鼠眼球，血液流入抗凝管，注意需要不断混匀抗凝液以防止血液在滴干前凝固，盖好盖子置于冰水中。3%冰醋酸1.5ml和1%龙胆紫1ml，混匀，加蒸馏水至100ml。取20µl新鲜血液加入到40µl龙胆紫冰醋酸稀释液中混匀，取20ul到细胞计数板上，低倍镜观察计数，最终计算各个实验样本白细胞总数

外周血白细胞测定实验中，虽然表现出高剂量组有增加全血内白细胞数的数据体现，但是没有统计学意义（p>0.05）。

表3小鼠外周血白细胞总数()

4.2.2迟发型变态反应--（dth）细胞免疫功能测定

称取50mg二硝基氟苯于干净清洁的试剂瓶内，将丙酮麻油按照1：1配制成丙酮麻油溶液，用移液枪移取5ml丙酮麻油溶液于试剂瓶内溶解二硝基氟苯。瓶口盖紧并用封口膜密封，振荡混匀溶解备用。小鼠腹部用脱毛膏脱毛，形成3cmx3cm的无毛肚皮，微量取样器取50µl涂抹于无毛处致敏。

测定（dth）：五天后，准确取二硝基氟苯溶液10ul均匀涂抹于小鼠右耳的单面，待24h后攻击完全形成炎症，处死小鼠，用圆形打孔器避开耳骨打下均匀耳片，电子天平称重。

根据小鼠肿胀右耳与正常左耳的重量对比，发现低、中、高剂量组在迟发型变态反应中呈递增趋势，与对照组相比较具有统计学意义(p<0.05).山药多糖组只能与空白组差不多持平山药多头铬络合物能显著增强低免疫力小鼠的t细胞活力。

表4dth测定结果(左右耳质量差值mg/只)

4.2.3血清溶血素测定（血凝法）--体液免疫功能测定

血清溶血素测定结果表，与对照组比较，中剂量组与低剂量组没有统计学意义（p>0.05）。

表5血清溶血素测定()

4.2.4小鼠碳廓清实验--单核巨噬细胞功能测定

造模后小鼠从尾静脉无菌注射稀释4倍的印度墨汁，每10g体重0.1ml，墨汁注入后开始计时。

准确计时，在注入墨汁后第2min，用毛细管扎入小鼠右边眼球取血20ul于0.1%naco3溶液中，分光光度计在600nm波长处测光密度值；

准确计时，在注入墨汁10min后，用毛细管扎小鼠左眼球取血20ul于0.1%naco3溶液内，分光光度计在600nm波长测光密度值。以上测定空白对照都为0.1%naco3。10min取血后小鼠处死，取肝脏和脾脏，清理干净脏器并称重。

以吞噬指数表示小鼠碳廓清能力:

碳廓清实验各剂量组与对照组比较，各个剂量组与对照组相比没有统计学意义（p>0.05）。

表6碳廓清实验()

4.2.5nk细胞活性测定

实验表明，山药多糖铬络合物作为药物进入小鼠体内后，具有增强nk细胞活性的效果，高、中、低剂量组与对照组相比差异有统计学意义（p<0.05）。

表7小鼠nk细胞活性测定()

4.2.6评价方法

主要评价理论依据为方差分析，进行分析前，先进行方差齐性检验。其中各组实验数据中：nk细胞活性需进行数据转换，x＝sin^-1。

在免疫功能低下模型成立条件下:细胞免疫功能、体液免疫功能、血液白细胞总数、单核－巨噬细胞功能、nk细胞活性五个方面测定中，任意两组试验的试验结果为阳性，判定该受试样品对免疫功能低下者具有增强免疫力作用。

4.2.7增强免疫力实验总结

本实验的五个方面测定中nk细胞活性与细胞免疫功能的迟发型变态反应结果为阳性，判定本实验室合成的山药多糖-铬配合物有比山药中性多糖有更好的增强免疫力功能的作用。且高、中、低各剂量均表现明显，具有统计意义。

4．3小结

1．根据血糖实验结果，在相对cr浓度、山药多糖浓度一样的情况下，通过设置二甲双胍阳性对照组，糖尿病对照组等实验，研究了山药多糖-铬配合物的降血糖能力，在实验条件下，虽然中、低剂量组降血糖能力比阳性对照组弱，但各剂量要比无机铬、山药中性多糖给药组具有更好的降血糖功效，且中、低剂量表现明显，具有统计意义。可见，山药多糖-铬配合物比无机铬、山药多糖具有更好的降血糖功效。

2.用山药多糖为作为阳性对照，在山药多糖-铬配合物的提高免疫力功能试验中，五个方面测定有两个方面：nk细胞活性和细胞免疫功能的迟发型变态反应结果为阳性，判定合成药物山药多糖-铬配合物比山药多糖有更强的提高免疫力功能的作用。

5结论

本实验在最佳条件：温度70~90℃、反应时间3h、ph=8下，山药中性多糖与cr³⁺配合物形成的并且通过紫外-可见光谱法、红外光谱法对山药中性多糖与cr³⁺的配位进行了验证，用火焰原子吸收分光光度法测得山药多糖-铬配合物中cr元素的含量为5.1%。

通过设置二甲双胍阳性对照组，糖尿病对照组等实验，研究了山药多糖-铬配合物的降血糖能力，在实验条件下，虽然中、低剂量组降血糖能力比阳性对照组弱，但各剂量要比无机铬、山药中性多糖给药组具有更好的降血糖功效，且中低剂量表现明显，具有统计意义。说明配合物产品有助于促进对cr和多糖的吸收，提高了cr和多糖的生物活性。据国家对保健食品提高免疫力的评价标准，进行山药多糖-铬配合物的增强免疫力功能实验探究，在五个方面：外周血白细胞数、细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、nk细胞活性测定中细胞免疫功能与nk细胞活性测定获得阳性结果，具有统计学意义(p<0.05)。判定山药多糖-铬配合物与山药多糖比较具有更好的增强机体免疫力功能作用。

可见，山药多糖-铬配合物具有较好的降血糖功效和增强机体免疫力功能。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。