一种老虎家系鉴定的试剂、方法和应用与流程

本申请涉及老虎家系鉴定领域，特别是涉及一种老虎家系鉴定的试剂、方法和应用。

背景技术：

老虎作为濒危物种，已有不少品种灭种绝迹，目前已列入《世界自然保护联盟》(缩写iucn)2012年濒危物种红色名录version3.1、《中国国家重点保护野生动物名录》ⅰ级以及《华盛顿公约》citesⅰ级保护动物。据统计我国现存老虎仅5000多只，以人工圈养为主。在人工圈养的过程中，容易引起老虎近亲繁殖，进而导致生育率下降、存活率较低等一系列问题。

基因育种能够实现优生优育，防止近亲交配，保护种群的遗传多样性。但是，目前国内外尚没有老虎家系鉴定的方法或试剂盒，无法对老虎进行有效的基因育种。因此，开发一种准确、高效、快捷、经济的老虎家系鉴定方法已经刻不容缓；这对老虎基因育种具有极大的指导意义。在建立老虎基因家谱的同时，建立老虎群体的dna档案，从基因水平指导老虎的育种和繁殖，提高老虎群体的遗传多态性，对提高老虎的生育率和生存率具有重大的科学意义和应用价值。

技术实现要素：

本申请的目的是提供一种新的老虎家系鉴定的试剂，基于该试剂的老虎家系鉴定方法，以及该试剂的应用。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种老虎家系鉴定的试剂，该试剂包括22对特异性引物，22对特异性引物的上下游引物依序为seqidno.1至seqidno.44所示序列，其中，seqidno.1和seqidno.2为一对特异性引物，seqidno.3和seqidno.4为一对特异性引物，seqidno.5和seqidno.6为一对特异性引物，如此两条引物组合为一对特异性引物，以此类推。

需要说明的是，本申请的22对特异性引物实际上是针对22个靶标设计的，这22个靶标包括21个短串联重复序列(缩写str)和1个性别鉴定靶标，通过对这22个靶标进行检测，就可以快速的进行老虎家系的鉴定，从而有效的预防老虎的近亲交配，实现老虎的基因育种和优生优育，保护老虎群体的遗传多态性，进而提高老虎的生育率和生存率。本申请的22个靶标具体为：da2s1059、de1s613、da2s1575、da1s1145、db1s542、da1s1290、db2s734、dd3s86、db3s187、db4s1505、da3s461、de3s497、de3s579、da1s1470、da3s1123、dc1s1364、amel、dd3s899、dd2s793、db1s1096、db1s1259和dd4s705。其中，amel为老虎性别鉴定靶标，其余21个为短串联重复序列。本申请的22对特异性引物具体如表1所示。

优选的，22对特异性引物被分为五个引物混合组，具体的，第一引物混合组由第1-5对特异性引物组成，第二引物混合组由第6-10对特异性引物组成，第三引物混合组由第11-14，第四引物混合组由第15-18，第五引物混合组由第19-22对特异性引物组成。

需要说明的是，为了使用方便，本申请的优选方案中，将22对特异性引物被分为五个引物混合组，即五个引物混合组可以分组进行五个多重pcr扩增，对22个靶标进行检测。可以理解，在不考虑效率，或者要求较低的情况下，也可以22对特异性引物一起进行pcr扩增；又或者，22对特异性引物单独进行22个pcr扩增。当然，22对特异性引物单独进行22个pcr扩增，是可以保障检测质量和效果的，但是，进行22个pcr扩增，一是耗时，二是浪费试剂成本；因此，本申请优选的将22对特异性引物被分为五个引物混合组。

优选的，五个引物混合组中，至少有四个引物混合组的引物上分别标记有不同颜色的荧光素。

需要说明的是，至少四个引物混合组分别标记有不同颜色的荧光素，也就是说，一个引物混合组中所有引物都标记同一颜色的荧光素，另一个引物混合组中所有引物都标记另一个颜色的荧光素；本申请的一种优选方案中，统一标记在上游引物的5’端。可以理解，不同引物混合组标记不同颜色的荧光素，其目的就是区分不同引物混合组的pcr扩增产物，以方便检测。本领域技术人员熟知，对于pcr扩增产物的区分，除了在引物上进行不同颜色的荧光素标记以外，还可以采用索引序列的方式进行区分，例如在不同引物混合组的引物中添加一段特异性的索引序列，或者，每对引物添加不同的索引序列，以此区分pcr扩增产物。

优选的，荧光素包括蓝色荧光素、绿色荧光素、黄色荧光素和红色荧光素。

更优选的，蓝色荧光素为6’-fam，绿色荧光素为hex，黄色荧光素为tamra，红色荧光素为rox。

其中，6’-fam为6’-羧基荧光素的缩写，hex为六氯-6-甲基荧光素的缩写，tamra为4-甲基-6-羧基-罗丹明的缩写，rox为羧基-x-罗丹明的缩写。

优选的，22对特异性引物依序分别为da2s1059、de1s613、da2s1575、da1s1145、db1s542、da1s1290、db2s734、dd3s86、db3s187、db4s1505、da3s461、de3s497、de3s579、da1s1470、da3s1123、dc1s1364、amel、dd3s899、dd2s793、db1s1096、db1s1259和dd4s705等22个基因的特异性检测引物。

本申请的另一面公开了本申请的试剂在老虎家系鉴定或老虎来源材料检测中的应用。

可以理解，本申请的22对特异性引物能够用于老虎家系鉴定，当然能够用于对于一些未知来源的样品进行检测，以判断这些样品是否取自于老虎，或者其中是否含有取自于老虎的成份。

本申请的再一面公开了一种用于老虎家系鉴定或老虎来源材料检测的试剂盒，该试剂盒中含有本申请的试剂。

本申请的再一面公开了一种老虎家系鉴定的方法，包括采用本申请的试剂对采集自老虎的dna样品进行pcr扩增。

优选的，pcr扩增分为五组进行，第一引物混合组、第二引物混合组、第三引物混合组、第四引物混合组和第五引物混合组分别对老虎dna样品进行pcr扩增。

优选的，本申请的方法还包括采用核酸测序仪或遗传分析仪对pcr扩增产物进行分析检测。

本申请的有益效果在于：

本申请用于老虎家系鉴定的试剂，能够对老虎家系进行准确、高效、快捷的检测和鉴定，对老虎的基因育种和优生优育具有重要的指导作用。采用本申请的试剂，对老虎进行家谱和老虎群体dna档案建立，从基因水平指导老虎的育种和繁殖，提高了老虎群体的遗传多态性，进而提高了老虎的生育率和生存率，具有极高的科学意义和应用价值。

附图说明

图1是本申请实施例中22个靶标序列在基因组中的定位图谱；

图2是本申请实施例中引物筛选的电泳图；

图3至图5是本申请实施例中老虎样品的21个str基因座和1个性染色体鉴别位点的基因分型图谱。

具体实施方式

老虎作为ⅰ级保护动物已经濒临灭绝，人工圈养是维系其种群的有效途径；但是，人工圈养容易引起近亲繁殖，导致生育率下降、存活率低等一系列问题，不利于老虎种群的维系。在目前老虎数量有限的情况下，利用先进的基因育种技术，防止老虎近亲交配，实现优生优育，保护老虎种群遗传多样性，这是本申请的基本发明思路。

为此，本申请对老虎基因组进行研究，提出了专门用于老虎家系鉴定的试剂，即包括22对特异性引物的试剂；通过本申请的试剂和本申请提供的方法，能够对老虎家系进行快速、准确的鉴定，以便于对老虎进行基因育种和优生优育，对老虎种群维系和发展具有重要意义。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

一、引物设计和筛选

本例从老虎基因组中选取了多态性较高的22个str位点，包含21个常染色str和一个性别鉴定位点amel，针对这22个靶标位点设计特异性引物，用于对老虎进行家系鉴定。

本例的22个基因座为：da2s1059、de1s613、da2s1575、da1s1145、db1s542、da1s1290、db2s734、dd3s86、db3s187、db4s1505、da3s461、de3s497、de3s579、da1s1470、da3s1123、dc1s1364、amel、dd3s899、dd2s793、db1s1096、db1s1259和dd4s705。这22个基因座在基因组中的定位如图1所示。

本例针对每个靶标位点设计了2-8对特异性引物，并用blast对每对引物进行比对，保证引物的特异性。再对每对引物进行pcr扩增测试和琼脂糖凝胶电泳检测，以筛选出符合使用需求的引物。

本例的引物设计采用primerprimier5和oligo7软件，每条引物退火温度接近或高于60℃，不能产生引物二聚体或者错配引起的其它非特异性产物，扩增产物长度在90-450bp之间，引物在生工公司合成。老虎样品为长沙生态动物园提供的孟加拉虎血液样品，dna采用chelex-100法提取。

pcr扩增测试的反应体系为：10×buffer2μl、0.5u热启动taq酶0.1μl、mgcl21.6μl、dntpmix1.6μl、10μm上游引物1μl、10μm下游引物1μl、dna样品1μl，补充灭菌去离子水至20μl。

反应条件为：95℃10min，然后进入35个循环：95℃30s、60℃30s、72℃30s，循环结束后72℃10min，4℃待机。

dna提取：chelex-100方法提取dna方法参考《forensicdnaprotocol》，humanapress，1998。具体如下：

1)取3μl加抗凝剂的血液于1.5ml离心管中；

2)振荡混匀chelex溶液，使chelex充分悬浮，每管加200μl5％的chelex-100；

3)振荡样品，恒温金属浴上56℃温浴2小时，取出样品振荡2分钟；

4)煮沸8-10分钟，13000rpm离心3分钟；

5)小心吸出约150μl上清，转移至新的1.5ml离心管中，即dna样品。

琼脂糖凝胶电泳：

1)配制3％的琼脂糖凝胶；

2)pcr产物按照1:5加入4μl6×loadingdye，上样10μl，dnamarker采用50bpladder，上样5μl；

3)设定电压120v，电泳40min。

4)eb染色5min，凝胶成像仪拍摄电泳胶图。

琼脂糖凝胶电泳如图2所示。根据pcr检测结果，从图2中筛选出条带清晰的引物，本例最终针对每个靶标位点筛选出一对最佳的特异性引物，作为老虎家系鉴定的试剂，如表1所示。

表1老虎家系鉴定的22对特异性引物

二、多重pcr扩增

本例将最终筛选得到的22对特异性引物分为五组，并对各组中引物的量进行优化，以进行多重pcr扩增，引物分组和用量如表2所示。

表2多重pcr扩增引物分组和用量

引物混合物配置：

1)向引物干粉中加入定量灭菌超纯水，配成50μm母液，

2)各引物按照表2所示的分组和用量进行配制，配成五个引物混合组。分别用于多重pcr扩增。

将第一引物混合组、第二引物混合组、第三引物混合组和第四引物混合组分别用蓝色、绿色、黄色和红色荧光素标记。每对引物中只标记一条链，标记在引物的5’端。蓝色用6’-fam标记，绿色用hex标记，黄色用tamra标记，红色用rox标记。荧光标记引物在上海invitrogen公司合成。

pcr扩增测试的反应体系为：2.5×pcrmastermix10μl、2u热启动taq酶0.4μl、引物混合物5μl、dna样品2μl，补充灭菌去离子水至25μl。

反应条件为：95℃10min，然后进入28个循环：95℃30s、60℃40s、70℃40s，循环结束后60℃30min，4℃待机。

多重pcr扩增反应结束后，取出反应管，用abi3500遗传分析仪进行电泳和检测，具体如下：

1)取(0.25μl分子量内标liz-500+9.25μl去离子甲酰胺)×(样品数)，配成混合液；

2)混匀后分装至96孔板，每管9.5μl，再分别加入0.5μl扩增产物，简短离心将液体收集到管子底部；

3)样品95℃变性3分钟，然后迅速冰上冷却4分钟，使dna完全变性并且保持变性状态，这一步变性可选，甲酰胺本身可以使dna变性；

4)将样品放入基因分析仪的样品托盘中，设置仪器参数：进样电压3kv、进样时间10秒钟，开始电泳检测，电压15kv，炉温60℃；

5)约37分钟后，电泳结束，用genemapperidx软件分析实验数据，观察各位点的扩增情况，观察是否有杂峰，不断调整引物比例，建立均一稳定的复合扩增体系，使组内各个片段峰值均衡性达到40％以上。

图3至图5为按照表2的引物和分组，对编号10号老虎样品的21个str基因座与1个性染色体鉴别位点的基因分型图谱；结果显示，多重pcr扩增检测靶标与预期的各靶标的基因分布和分型相符。

三、多重pcr扩增对两个老虎样品的检测

本试验分别对长沙生态动物园提供的1例雌性和1例雄性孟加拉虎血液样品进行检测，检测方法按照步骤“二、多重pcr扩增”的反应体系和条件。pcr扩增产物的电泳及检测在abi3500遗传分析仪上进行，数据分析采用genemapperidx软件。

用genemapperidx软件分析实验数据得到图谱和分型结果如表3所示。

表3雌性、雄性孟加拉虎检测图谱和分型数据

表3展示的是两只孟加拉虎检测的分型数据，其中第一列为靶标基因，第二列和第三列为对应孟加拉虎在靶标基因座上的片段大小，单位为bp。例如在da1s1145基因座，雌性老虎的两个等位基因片段大小均为241bp，雄性老虎的两个等位基因片段大小分别为233bp和241bp。其中，性染色体上的基因座大小直接显示性染色体类型。表3的检测结果与预期相符，说明本例的试剂和多重pcr扩增检测方法，能够用于老虎群体dna档案建立，以方便对老虎进行基因育种，实现优生优育。

四、多重pcr扩增对三个老虎样品的检测

本试验分别对长沙生态动物园提供的1例雌性母亲、1例雄性父亲和1例儿子孟加拉虎血液样品进行检测，检测方法按照步骤“二、多重pcr扩增”的反应体系和条件。pcr扩增产物的电泳及检测在abi3500遗传分析仪上进行，数据分析采用genemapperidx软件。

用genemapperidx软件分析实验数据得到图谱和分型结果如表4所示。

表4父母和儿子孟加拉虎检测图谱和分型数据

表4为父母和儿子孟加拉虎检测的分型数据，表中的数据分别表示雌性老虎(简写“母”)、雄性老虎(简写“父”)以及小老虎(简写“子”)在22个靶标基因座的分型结果。依据孟德尔遗传定律，在每一个str基因座，小虎的等位基因均由雌性老虎和雄性老虎提供获得，以da2s1059基因座为例，小老虎的等位基因为[345,353]，其中等位基因345可由雌性老虎[345,345]提供，而等位基因353由雄性老虎[353,353]提供，在选取的22个靶标基因位点，小老虎的靶标基因分型均符合孟德尔遗传定律，因此可以判定雌性老虎为小老虎的生物学母亲，雄性老虎为小老虎的生物学父亲。可见，本例的试剂和多重pcr扩增检测方法，能够对老虎进行准确、高效的家系鉴定，进而方便老虎的基因育种，实现优生优育，为保障老虎群体的遗传多态性、提高老虎生育率和生存率，提供了准确、高效、便捷的检测试剂和方法。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

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<110>深圳华大法医科技有限公司

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