用于检测人类EGFR基因T790M突变的引物、检测方法及试剂盒与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种用于检测人类egfr基因t790m突变的引物、检测方法及试剂盒。
背景技术：
：人类表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,egfr)是一种蛋白酪氨酸激酶受体，广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，具有酪氨酸激酶活性。它是her/erbb家族成员之一，因此又名her1或erbb1。egfr与其配体结合后在细胞表面形成二聚体，通过酪氨酸激酶的活性，激活受体自磷酸化，在细胞内发出信号，经过细胞质中衔接蛋白和酶的级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、黏附、增殖、分化和凋亡。当egfr发生突变时，egfr自身或其配体过表达，从而通过自分泌或旁分泌方式刺激细胞形成失控性增殖。此外，egfr过度活化还可以启动多种蛋白水解酶和促血管生成因子的表达，从而加速癌细胞的转移。因此，egfr过表达者通常预后较差。美国食品药品监督管理局于2003年5月批准了美国阿斯利康(aotrazeneca)公司生产的小分子基因靶点药物吉非替尼(gefitinib，也称为易瑞沙/iressa)用于治疗晚期非小细胞肺癌(nsclc)，我国也与2005年2月批准了吉非替尼进入临床。吉非替尼是一种口服的小分子egfr酪氨酸激酶抑制剂(egfr-tki)，它可以特异性地竞争结合癌细胞egfr激酶功能区的atp结合位点，通过抑制该酶的活性来抑制肿瘤的增长、增殖，却无明显的化疗副作用。美国哈佛医学院的研究人员lynch等率先报道，肺癌细胞中有egfr酪氨酸激酶基因编码区18～21外显子突变的患者，靶向药物吉非替尼的有效率高达80％以上。这种现象可能是由于egfr突变使egfr酪氨酸激酶atp结合位点的某些基团发生重构，增强了与atp或其竞争性抑制剂吉非替尼的相互作用。因此，有egfr基因突变的患者表现出对吉非替尼更好的治疗反应。研究表明，美国非小细胞肺癌患者中只有约10％有egfr基因突变，然而在亚洲人中，约30％的非小细胞肺癌患者有egfr基因突变。临床运用的结果表明，egfr基因外显子18～21的突变(体细胞突变)是患者对此类靶向药物有效的必要前提，如果病人不携带有egfr基因突变而服用此类药物，不仅耽误病情还造成巨额药费的浪费。因此，在用药前筛查检测病人是否携带有egfr基因突变显得尤为重要，也是未来肿瘤个体化治疗的发展方向。目前，针对egfr基因突变的检测方法主要有直接测序法、传统的荧光定量pcr法和高分辨率熔解曲线法。测序法耗时长且灵敏度低，通常只用于科研，难以用于临床的检测。传统的荧光定量pcr法难以使突变型基因在大量的野生型基因中得到专一性的扩增，容易产生假阳性的检测结果。高分辨率熔解曲线法所使用的仪器较特殊，难以在医院进行普及，而且此方法在检测缺失突变时，效果较差。若能在癌症早期检测出癌基因，早发现早治疗，另外，快速准确灵敏地检测这些与药物反应性有关的基因突变，可以大大提高癌症患者的存活率。但由于癌症早期癌变样品特别是血液样品中的癌基因含量很少，而以上方法的检测灵敏度最多只能达到0.2％，远远还没达到从大量正常dna背景下检测极其微量的异常dna分子的要求，因此，快速准确灵敏地检测这些与药物反应性有关的egfr基因突变，就成为人们亟待解决的问题。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了用于检测人类egfr基因t790m突变的引物、检测方法。本发明还提供了含有该引物和检测方法的试剂盒，通过特异性扩增技术，在抑制正常背景的情况下，把微量的异常dna分子指数扩增，能从十万个正常dna分子的背景之下，检测到一个异常dna分子，其灵敏度达到0.001％，实现癌症早期检测。为达到上述目的，本发明第一方面提供用于检测人类egfr基因t790m突变的检测方法，包括以下步骤：将用于检测人类egfr基因t790m突变的引物、阻断剂、检测荧光信号基团、待测基因样品混合，进行实时荧光定量pcr，获得检测结果；其中，所述用于检测人类egfr基因t790m突变的引物，包括突变上游引物和突变下游引物，突变上游引物包括1-10条针对不同突变位点的引物，其长度为15-40个碱基，靠近3’末端的第1、2、3、4或5位的碱基为突变位点，与待测egfr突变型基因的一条链互补；突变下游引物为一条共用的下游引物，其长度为15-40个碱基，与待测egfr突变型基因的另一条链互补；所述阻断剂能与egfr基因t790m突变位点野生型序列特异结合，抑制野生型非特异扩增；所述检测荧光信号基团能与pcr扩增片段结合并发出荧光信号。在本发明一实施例中，所述突变上游引物，包括1条针对突变位点的引物，其长度为33个碱基，其中3’末端的第3位碱基为突变位点，与待测egfr突变型基因的一条链互补。在本发明一实施例中，所述突变下游引物，其长度为24个碱基，与待测egfr突变型基因的另一条链互补。在本发明一优选实施例中，所述用于检测人类egfr基因t790m突变的引物，其序列包括：突变上游引物：tctgcctcacctccaccgtgcagctcatcatgc(seqidno.1)，突变下游引物：aatattgtctttgtgttcccggac(seqidno.2)。在本发明一实施例中，所述阻断剂匹配egfr野生型基因的核酸序列，所述核酸序列修饰有化学基团。在本发明一优选实施例中，所述阻断剂中匹配egfr野生型基因的核酸序列包括：agctcatcacgcagctcat(seqidno.3)；所述化学基团包括：胺基、磷酸基团、生物素、生物素-teg及c3-spacer中的一种或多种。在本发明一实施例中，所述检测荧光信号基团包括：fam、cy3、hex、texasred、joe、vic、tamra、cy5、syto9、sybrmix中的一种或多种。本发明第二方面提供用于检测人类egfr基因t790m突变的引物，包括突变上游引物和突变下游引物，突变上游引物包括1-10条针对不同突变位点的引物，其长度为15-40个碱基，靠近3’末端的第1、2、3、4或5位的碱基为突变位点，与待测egfr突变型基因的一条链互补；突变下游引物为一条共用的下游引物，其长度为15-40个碱基，与待测egfr突变型基因的另一条链互补。在本发明一实施例中，所述突变上游引物，包括1条针对突变位点的引物，其长度为33个碱基，其中3’末端的第3位碱基为突变位点，与待测egfr突变型基因的一条链互补。在本发明一实施例中，所述突变下游引物，其长度为24个碱基，与待测egfr突变型基因的另一条链互补。在本发明一优选实施例中，所述用于检测人类egfr基因t790m突变的引物，其序列包括：突变上游引物：tctgcctcacctccaccgtgcagctcatcatgc(seqidno.1)，突变下游引物：aatattgtctttgtgttcccggac(seqidno.2)。本发明第三方面提供用于检测人类egfr基因t790m突变的阻断剂，所述阻断剂能与egfr基因野生型序列特异结合，抑制野生型非特异扩增。在本发明一实施例中，所述阻断剂匹配egfr野生型基因的核酸序列，所述核酸序列修饰有化学基团。在本发明一优选实施例中，所述阻断剂中匹配egfr野生型基因的核酸序列包括：agctcatcacgcagctcat(seqidno.3)；所述化学基团包括：胺基、磷酸基团、生物素、生物素-teg及c3-spacer中的一种或多种。本发明第四方面提供用于检测人类egfr基因t790m突变的试剂盒，包括如本发明第二方面所述的用于检测人类egfr基因t790m突变的引物、如本发明第三方面所述的用于检测人类egfr基因t790m突变的阻断剂以及检测荧光信号基团。在本发明一实施例中，所述检测荧光信号基团包括：fam、cy3、hex、texasred、joe、vic、tamra、cy5、syto9、sybrmix中的一种或多种。本发明第五方面提供如本发明第一方面所述的用于检测人类egfr基因t790m突变的检测方法、如本发明第二方面所述的用于检测人类egfr基因t790m突变的引物、如本发明第三方面所述的用于检测人类egfr基因t790m突变的阻断剂和/或如本发明第四方面所述的用于检测人类egfr基因t790m突变的试剂盒在检测人类egfr基因突变中的应用。在本发明一实施例中，所述应用中，所述被检测样品中，所述突变型基因的浓度不低于1％、0.1％、0.01％或0.001％。进一步地，所述突变型基因浓度为变型基因占野生型基因数量或摩尔浓度的比例。进一步地，所述突变型基因浓度为变型基因占样品总基因数量或摩尔浓度的比例。本发明提供的用于检测人类egfr基因t790m突变的检测方法能在10万个正常野生型dna分子中，检测出存在的1个异常突变型dna分子，即能检出含0.001％egfr基因突变的样本，实现癌症早期检测,。附图说明图1为本发明实施例提供的原理示意图；图2为本发明实施例提供的加阻断剂体系与不加阻断剂体系扩增效果对比图，其中a1为不加阻断剂体系扩增突变型基因的扩增曲线、b1为不加阻断剂体系扩增野生型基因的扩增曲线、a2为加阻断剂体系扩增突变型基因的扩增曲线、b2为加阻断剂体系扩增野生型基因的扩增曲线；图3为本发明实施例提供的试剂盒的灵敏度检测，其中a、b、c、d分别为突变基因浓度为1％、0.1％、0.01％、0.001％的扩增曲线；图4为本发明实施例提供的试剂盒的特异性检测，其中a为对突变异常基因扩增、b为对正常基因扩增、c为对tp53基因扩增、d为kit基因扩增、e为对非目标基因混合物扩增。具体实施方式以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。下面将结合图1，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。本发明实施例中若无特别说明，所用试剂及耗材均为市售商品。实施例11、用于检测人类egfr基因t790m突变的引物及阻断剂根据ncbi数据库公布的egfr基因野生型序列，以egfr突变位点为参考，设计特异性egfr突变引物。以基因工程构建的突变质粒和野生型质粒为模板，建立了实时荧光pcr突变(mutation)检测体系，实现对人类egfr基因t790m突变的高灵敏度和高特异性检测。用于检测人类egfr基因t790m突变的引物序列：突变位点egfr(c.2369c>t)突变上游引物：5’-tctgcctcacctccaccgtgcagctcatcatgc-3’(seqidno.1)突变下游引物：5’-aatattgtctttgtgttcccggac-3’(seqidno.2)。其中，突变上游引物，与egfr(c.2369c>t)位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列；突变下游引物，与egfr基因保守序列结合。为了进一步区分野生型序列与突变型序列，本发明添加了阻断剂，包括匹配egfr野生型基因的核酸序列及化学修饰基团；其中，所述阻断剂中匹配egfr野生型基因的核酸序列为：5’-agctcatcacgcagctcat-3’(seqidno.3)；所述化学修饰基团为c3-spacer磷酸胺。上述阻断剂能与egfr基因t790m位点野生型序列特异性结合，抑制野生型基因非特异扩增。2、本发明提供的人类egfr基因t790m突变的检测试剂盒，其操作步骤如下：1)提取血液dna样本，备用：2)按下表中组份的用量配制qrt-pcr反应体系：试剂用量sybrmix10μl突变上游引物(4μm)1.0μl突变下游引物(4μm)1.0μlddh2o4.0μl阻断剂(1μm)2.0μldna2.0μl3)qrt-pcr反应：qrt-pcr反应条件：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃延伸1min(收集荧光)，进行40个循环。3、试剂盒的性能验证1)检测模板的制备：取含有egfr基因t790m突变质粒的基因工程菌以及对应的野生型质粒基因工程菌分别培养，使用质粒纯化试剂盒(plasmidminikit购自omega公司)制备纯化的质粒作为检测模板。2)阻断剂的作用：由于本试剂检测的目标基因片段egfr基因t790m突变只有一个碱基的点突变，本发明提供的检测引物在不加阻断剂的体系中在检测野生型基因时可能会出现假阳性，如图2(横坐标为qpcr的ct值，纵坐标为所检测到的萤光增量)中扩增曲线b1所示，而在加入阻断剂的体系中由于阻断剂的存在，抑制了野生型基因的扩增，如图2扩增曲线b2(不扩增)所示，结果表明加入阻断剂可抑制野生型基因的扩增；而加入阻断剂的体系与不加阻断剂的体系，两者对检测突变型基因的灵敏性相近，扩增曲线a1(不加阻断剂)其ct值为20，扩增曲线a2(加阻断剂)的ct值为21，结果表明扩增突变基因时，加阻断剂对突变基因仅有一个ct的延后，加与不加阻断剂对突变基因的扩增影响很小，但加阻断剂可以明显抑制野生型基因的扩增，大大减少大量野生型基因对突变型基因检测的干扰，更利于突变型基因的检出。3)试剂盒的灵敏度：制备纯化的质粒并进行核酸定量，计算出拷贝数，10倍梯度稀释，取108拷贝/μl、107拷贝/μl、106拷贝/μl、105拷贝/μl的突变型质粒加入1010拷贝/μl的野生型质粒中得到突变型基因占野生型基因的比例为1％、0.1％、0.01％、0.001％的样品，分别取2μl各稀释度的质粒dna作为模板，对试剂盒的灵敏度进行检测，结果如图3所示，本发明提供的用于检测人类egfr基因t790m突变的试剂盒在突变基因浓度为1％、0.1％、0.01％、0.001％时均能有效扩增，检测灵敏度可达到0.001％。4)试剂盒的特异性：分别以突变异常基因、正常基因、其他较为常见序列相似的突变非目标基因作为检测模板进行检测，以检测试剂盒的特异性。结果如图4所示，其中a为对突变异常基因扩增、b为对正常基因扩增、c为对tp53基因扩增、d为kit基因扩增、e为对非目标基因混合物扩增。结果表明本发明提供的用于检测人类egfr基因t790m突变的试剂盒可特异检测egfr基因t790m(c.2369c>t)位点突变。综上所述，本发明提供的检测人类egfr基因t790m突变的试剂盒可检测egfr基因t790m(c.2369c>t)位点突变，且试剂盒具有较高的灵敏度及特异性，是检测人类egfr基因t790m突变的一种理想选择。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。序列表<110>广州健天基因技术有限公司<120>用于检测人类egfr基因t790m突变的引物、检测方法及试剂盒<150>2017109552044<151>2017-10-13<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>33<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tctgcctcacctccaccgtgcagctcatcatgc33<210>2<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2aatattgtctttgtgttcccggac24<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3agctcatcacgcagctcat19当前第1页12