一种能同时检测多种高耐药基因的检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及一种能同时检测多种高耐药基因的检测试剂盒及其应用，具体涉及一种能够同时快速检测目前所有已知blakpc，blandm和mcr高耐药基因的三重实时pcr引物、探针、试剂盒，属于生物检测
技术领域：
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背景技术：
：ndm是新德里金属β-内酰胺酶(newdelhimetallo-β-lactamase)的英文缩写，由英国著名医学杂志《theinfectiousdiseases》首次报道，英国卡迪福大学的蒂姆·沃尔什将该超级细菌命名为“新德里金属蛋白酶”，由于携带该基因的细菌会产生一种特殊的β-内酰胺酶，且活性部位为金属离子又首先在印度首都新德里出现所以得名：ndm。产ndm的细菌一般以大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌为主，这些细菌既可引起医院内感染，也有社区感染，包括尿路感染、血流感染、肺炎、导管相关感染、伤口感染等。全球上市的近200种抗生素对这种新型超级细菌几乎束手无策。此外，众所周知，碳青霉烯类和多黏菌素药物是对抗革兰氏阴性菌严重感染的最后一道屏障。然而，随着临床的广泛使用，特别是滥用，已经陆续出现了高耐药基因(blakpc和mcr)，包含blakpc和mcr基因的微生物使耐碳青霉烯类和多黏菌素药物失去作用。已经有越来越多的临床患者出现了blakpc，blandm和mcr高耐药基因中两种或者三种微生物感染，导致治疗极其困难，经常出现贻误治疗时机的情况，给感染患者的生命健康及经济造成严重影响，同时也给社会造成了沉重的负担及形成了巨大压力。到目前为止，临床对包含上述高致病耐药基因耐药菌的检测仍然主要是通过对标本进行选择性培养计数菌落数后，再通过传统药敏试验和pcr扩增并与标准文库对比。随着分子生物学的发展以及分子生物学技术在微生物的应用，特别是荧光pcr技术出现，由于其具有省时省力、敏感性高、特异性强、操作简单快速等特点，且不受试验时间限制，而被广泛应用于临床诊断、疾病研究和病原体检测等方面。然而，迄今使用pcr鉴别诊断mcr耐药菌的方法仍然非常复杂，不仅耗时、费力，而且准确度并不比传统的药敏试验更佳，特别是，当微生物感染的情况非常复杂，同时包含多种高耐药基因(blakpc，blandm和mcr)时，现有的检测技术或者检测试剂盒产品都是只能够检测单一的耐药基因，例如只能够检测blandm-1、mcr-1耐药基因中的一种或者部分，导致确切一一鉴别不同高耐药基因型具有效率低、成本高的缺陷。因此，寻找一种能有效鉴别包含各种耐药基因的“超级细菌”的方法已经迫在眉睫。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种鉴别并诊断各种包含blakpc，blandm和/或mcr的两种以上基因耐药菌的荧光pcr检测试剂盒及其制备方法、检测方法，可用于检测并诊断包含blakpc，blandm和/或mcr的两种以上基因耐药菌的感染，用于临床对可疑感染患者进行病原学鉴别诊断。本多重pcr可以检测目前所有已知blakpc基因型，包括blakpc-2到blakpc-19(blakpc-1和blakpc-2是相同的)；同样，本多重pcr可以检测blandm-1到blandm-16。目前已经确定的mcr基因只有两个基因型，mcr-1和mcr-2，这两种基因型在本多重pcr中都能被检测出来，该技术不仅简便、快速、准确、灵敏，而且目前国内外尚未见类似的技术报道。本发明的第一个目的是提供一种能够检测两种以上耐药基因的耐药菌的检测引物，所述引物包括a、b、c中的两对以上引物；其中a引物对包括序列如seqidno：1和seqidno：2的两条核苷酸序列，b引物对包括序列如seqidno：4和seqidno：5的两条核苷酸序列，c引物对包括序列如seqidno：7和seqidno：8的两条核苷酸序列。在一种实施方式中，所述两种以上基因是指blakpc，blandm、mcr基因中的两种或者三种。在一种实施方式中，所述a引物检测包含blakpc基因的耐药菌，组成如下：上游引物：5’-cgcggaaccattcgctaa-3’(seqidno：1)下游引物：5’-cgcgtacacaccgatgga-3’(seqidno：2)。在一种实施方式中，所述b引物检测包含blandm基因的耐药菌，组成如下：上游引物：5’-gaccgcccagatcctcaa-3’(seqidno：4)下游引物：5’-attggcataagtcgcaatcc-3’(seqidno：5)。在一种实施方式中，所述c引物检测包含mcr基因耐药菌的检测引物的组成如下：上游引物：5’-ggcacatcgacggcgtat-3’(seqidno：7)下游引物：5’-ggtatttggcggtatcgacatc-3’(seqidno：8)。本发明的第二个目的是提供一种包含blakpc、blandm、mcr中任意两种以上基因耐药菌的检测试剂盒，所述检测试剂盒中包括本发明的检测引物。在一种实施方式中，所述检测试剂盒中，还包括用于荧光pcr的探针。在一种实施方式中，所述探针包括探针a1、b1、c1中的任意两条以上；其中与引物对a对应的a1探针序列如seqidno：3所示；与引物对b对应的b1探针序列如seqidno：6所示；与引物对c对应的c1探针序列如seqidno：9所示。在一种实施方式中，所述探针的一端标记有荧光报告基团，探针另一端标记有荧光淬灭基团。在一种实施方式中，所述探针的5’端包括荧光报告基团，3’端包括荧光淬灭基团。在一种实施方式中，所述探针a1为5’-荧光报告基团-ctcgaacaggactttgg-荧光淬灭基团-3’(seqidno：3)。在一种实施方式中，所述探针b1为5’-荧光报告基团-agatcaacctgccggtcgcg-荧光淬灭基团-3’(seqidno：6)。在一种实施方式中，所述探针c1为5’-荧光报告基团-gtgccgtgtatgttcag-荧光淬灭基团-3’(seqidno：9)。在一种实施方式中，所述荧光报告基团为fam、vic、rox、cy5、joe或者quasar705荧光基团中的任意一种。在一种实施方式中，所述荧光淬灭基团为bhq或者eclipse系列。在一种实施方式中，所述检测试剂盒中还包括普通pcr或者荧光pcr扩增用的pcrbuffer和h2o。在一种实施方式中，所述pcrbuffer中含有优化的双阳离子缓冲液、dntps、pcr增强剂、pcr稳定剂。在一种实施方式中，所述检测试剂盒中还包括pcr酶、阴性对照品及阳性对照品中的至少一种。在一种实施方式中，所述酶为dna聚合酶，比如taqdna聚合酶。在一种实施方式中，所述阳性对照品为灭活或减毒阳性菌株的dna或相应的对照质粒。在一种实施方式中，所述阴性对照品为depc-h2o。在一种实施方式中，所述检测试剂盒为荧光检测试剂盒，包括本发明的引物、探针、qpcrmastermix、taqdna聚合酶。优选地，还包括水或te。在一种实施方式中，所述检测试剂盒，包括荧光pcr检测混合液，所述荧光pcr检测混合液中含有a、b、c中的两对以上的引物对和对应的探针。在一种实施方式中，所述荧光pcr检测混合液还含有pcrmix和h2o。本发明的第三个目的是提供所述的检测引物在制备包含blakpc，blandm、mcr中的两种以上基因的耐药菌检测试剂中的应用。本发明的第四个目的是包含blakpc，blandm、mcr中的两种以上基因的耐药菌的检测方法，是利用本发明的所述引物或者检测试剂盒进行检测。在一种实施方式中，所述耐药菌为以下任意一种或多种：鲍氏不动杆菌acinetobacterbaumannii，弗罗因德(氏)枸橼酸杆菌citrobacterfreundii，产气肠杆菌enterobacteraerogenes，阴沟肠杆菌enterobactercloacae，大肠杆菌escherichiacoli，催产克雷白(氏)杆菌klebsiellaoxytoca，臭鼻克雷白氏杆菌klebsiellaozaenae，肺炎克雷伯氏菌klebsiellapneumoniae，摩根(氏)菌morganellamorganii，奇异变形杆菌proteusmirabilis，雷氏普罗威登斯菌providenciarettgeri，绿浓杆菌pseudomonasaeruginosa，灵杆菌serratiamarcescens和念珠菌candidaspecies。在一种实施方式中，所述检测方法，是采用荧光pcr进行检测。在一种实施方式中，荧光pcr扩增体系包括(20μl体系)：8～12μl的qpcrmastermix(2x)、一定浓度的引物和探针、0.1～1μl的taqdna聚合酶、一定浓度的待测品、其余为水。在一种实施方式中，荧光pcr扩增体系为：10μl的qpcrmastermix(2x)，引物探针混合液，0.3μl的taqdna聚合酶，待检dna模板5μl，加灭菌去离子水补足体积到20μl。在一种实施方式中，荧光pcr扩增体系制备方法如下：三种上游引物共1μl/test；下游引物1μl/test；探针1μl/test；qpcrmix10μl/test；dna聚合酶0.3μl/test，待检dna模板5μl/test，工艺用水1.7μl/test。在一种实施方式中，所述pcr酶由0.3μltaq酶(5u/μl)，无尿嘧啶-n-糖基化酶制成。在一种实施方式中，荧光pcr扩增体系制备方法如下的制备方法如下：取荧光pcrmix10μl，与0.3μldna聚合酶混合，再加入3μl的kpc-ndm-mcr引物探针混合液和1.7μl的ddh2o混合，取15μl上述混合液加入5μl待测品，获得反应总体系为20μl的pcr反应液。在一种实施方式中，，所述的kpc-ndm-mcr引物探针混合液由等体积的10pmol/μl的三种上游引物、10pmol/μl的三种下游引物和5pmol/μl三种探针组成。在一种实施方式中，所述待测品为样本的dna模板溶液、阳性对照品或阴性对照品(depc-h2o)。在一种实施方式中，所述阳性对照品中，对照质粒可以单独包装也可以混合包装。本发明针对鉴别并诊断包含blakpc，blandm和mcr基因耐药菌的荧光pcr检测的试剂盒所用的方法，采用的是taqman荧光定量pcr原理，分别针对耐药基因设计特异性引物，扩增特异性核酸序列，同时分别设计taqman探针，并标记不同的荧光报告基团，并位于上下游引物之间。探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记非荧光淬灭基团。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着pcr的进行，taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5’→3’外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。因此，本发明采用的荧光定量pcr技术具有实时检测、定量和高通量检测等特点，且操作简便、灵敏度高、特异性好等优点。使用本发明针对包含blakpc，blandm和mcr基因耐药菌的荧光pcr检测试剂盒检测时，其使用方法如下：1)提取待测样本的dna，得到dna模板溶液；2)加入本发明制备的检测混合溶液，制备反应体系；3)pcr扩增并检测。本发明pcr检测的待测样本来自atcc定性清楚菌株、疾控中心(cdc)、本公司实验室从获得的患者标本，包括，但不限于粪便、尿液、痰、血液、组织液、分泌物等获取的菌株。样本的核酸提取为现有细菌dna提取技术，具体可根据取样方式不同，按各核酸提取说明书操作进行。检测加样的方法为：每个反应取10μl的qpcrmastermix(2x)与0.3μltaqpcr酶(taq酶5u/μl)，混合，再加入3μl的kpc-ndm-mcr引物探针混合液和1.7μlddh2o，振荡混匀数秒，3000rpm离心5秒，获得混合液。取前述混合液15μl置于pcr管中，然后将5μl的dna模板溶液、阳性对照品、或者阴性对照品加入pcr反应管中，盖好pcr反应管盖，立即进行pcr扩增反应。本发明推荐的pcr反应条件：abi7500fastdx仪器：95℃2min，(95℃15s，60℃30s)40个循环博日9600plus仪器：94℃2min，(94℃10s，60℃40s)40个循环。pcr反应阈值设定：阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品检测荧光曲线的最高点。本发明荧光pcr质量控制：阴性对照品检测结果在ct栏显示undetermined(abi7500)或n/a(cfx96)或noct(slan)；阳性对照品检测结果应为：fam通道、vic通道和cy5通道ct值均≤35(其他荧光标记结果判断依据同此)；否则实验视为无效。具体见表2。表2试验结果的判断标准序列通道结果判断1undetermined/noct/(n/a)阴性2ct≤35阳性338≤ct≤40待定，复测若待检样本ct值在38～40之间，需重复测定，如重复测定得到的ct值仍在38～40之间，则判为低于检测限，报告为阴性。本发明最后公开了前述针对包含blakpc，blandm和mcr基因耐药菌的荧光pcr检测用引物及探针、前述包含blakpc，blandm和mcr基因耐药菌的荧光pcr检测试剂盒在制备和/或检测试剂中的应用。本发明的有益效果：本发明的试剂盒及其应用大大缩短检测时间，操作简便。特异性引物和和探针的设计保证了引物和探针的高度保守和特异性，避免了两对引物和探针之间无互补配对或交叉扩增的情况。附图说明图1实施例8中blakpc灵敏度的第一天的扩增曲线图；图2实施例8中blakpc灵敏度的第二天的扩增曲线图；图3实施例8中blakpc灵敏度的第三天的扩增曲线图；图4实施例8中blandm灵敏度的第一天的扩增曲线图；图5实施例8中blandm灵敏度的第二天的扩增曲线图；图6实施例8中blandm灵敏度的第三天的扩增曲线图；图7实施例8中mcr灵敏度的第一天的扩增曲线图；图8实施例8中mcr灵敏度的第二天的扩增曲线图；图9实施例8中mcr灵敏度的第三天的扩增曲线图；图10实施例10中blakpc批内重复性的扩增曲线图；图11实施例10中blandm批内重复性的扩增曲线图；图12实施例10中mcr批内重复性的扩增曲线图；图13实施例10中批间重复性第一天blakpc的扩增曲线图；图14实施例10中批间重复性第一天blandm的扩增曲线图；图15实施例10中批间重复性第一天mcr的扩增曲线图；图16实施例10中批间重复性第二天blakpc的扩增曲线图；图17实施例10中批间重复性第二天blandm的扩增曲线图；图18实施例10中批间重复性第二天mcr的扩增曲线图；图19实施例10中批间重复性第三天blakpc的扩增曲线图；图20实施例10中批间重复性第三天blandm的扩增曲线图；图21实施例10中批间重复性第三天mcr的扩增曲线图；图22实施例11的blakpc线性度的扩增曲线图；图23实施例11的blandm线性度的扩增曲线图；图24实施例11的mcr线性度的扩增曲线图；图25检测blakpc、blandm、mcr基因线性度的标准曲线；图26blakpc特异性的扩增曲线图；图27blandm特异性的扩增曲线图；图28mcr特异性的扩增曲线图。具体实施方案下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。实施例1核酸测定试剂盒引物探针的设计和合成1在探针的5’标记fam荧光基团，探针的3’标记bhq1荧光基团。合成针对产各种blakpc，blandm和mcr耐药菌的pcr检测的引物、探针(5’-3’)：kpc上游引物：cgcggaaccattcgctaa(序列如seqidno：1)kpc下游引物：cgcgtacacaccgatgga(序列如seqidno：2)kpc探针：fam-ctcgaacaggactttgg-bhq1(序列如seqidno：3)ndm上游引物：5’-gaccgcccagatcctcaa-3’(seqidno：4)ndm下游引物：5’-attggcataagtcgcaatcc-3’(seqidno：5)。ndm探针：fam-agatcaacctgccggtcgcg-bhq1(序列如seqidno：6)mcr上游引物：ggcacatcgacggcgtat(序列如seqidno：7)mcr下游引物：ggtatttggcggtatcgacatc(序列如seqidno：8)mcr探针：fam-gtgccgtgtatgttcag-bhq1(序列如seqidno：9)实施例2核酸测定试剂盒引物探针的设计和合成2在探针的5’标记vic荧光基团，探针的3’标记bhq1荧光基团。合成针对产各种blakpc，blandm和mcr耐药菌的pcr检测的引物、探针(5’-3’)：kpc上游引物：cgcggaaccattcgctaakpc下游引物：cgcgtacacaccgatggakpc探针：vic-ctcgaacaggactttgg-bhq1ndm上游引物：5’-gaccgcccagatcctcaa-3’ndm下游引物：5’-attggcataagtcgcaatcc-3’ndm探针：vic-agatcaacctgccggtcgcg-bhq1mcr上游引物：ggcacatcgacggcgtatmcr下游引物：ggtatttggcggtatcgacatcmcr探针：vic-gtgccgtgtatgttcag-bhq1实施例3核酸测定试剂盒引物探针的设计和合成3在探针的5’标记rox荧光基团，探针的3’标记bhq2荧光基团。合成针对产各种blakpc，blandm和mcr耐药菌的pcr检测的引物、探针(5’-3’)：kpc上游引物：cgcggaaccattcgctaakpc下游引物：cgcgtacacaccgatggakpc探针：rox-ctcgaacaggactttgg-bhq2ndm上游引物：5’-gaccgcccagatcctcaa-3’ndm下游引物：5’-attggcataagtcgcaatcc-3’ndm探针：rox-agatcaacctgccggtcgcg-bhq2mcr上游引物：ggcacatcgacggcgtatmcr下游引物：ggtatttggcggtatcgacatcmcr探针：rox-gtgccgtgtatgttcag-bhq2实施例4核酸测定试剂盒引物探针的设计和合成4在探针的5’标记cy5荧光基团，探针的3’标记bhq2荧光基团。合成针对产各种blakpc，blandm和mcr耐药菌的pcr检测的引物、探针(5’-3’)：kpc上游引物：cgcggaaccattcgctaakpc下游引物：cgcgtacacaccgatggakpc探针：cy5-ctcgaacaggactttgg-bhq2ndm上游引物：5’-gaccgcccagatcctcaa-3’ndm下游引物：5’-attggcataagtcgcaatcc-3’ndm探针：cy5-agatcaacctgccggtcgcg-bhq2mcr上游引物：ggcacatcgacggcgtatmcr下游引物：ggtatttggcggtatcgacatcmcr探针：cy5-gtgccgtgtatgttcag-bhq2实施例5核酸测定试剂盒引物探针的设计和合成5在探针的5’标记quasar705荧光基团，探针的3’标记bhq3荧光基团。合成针对产各种blakpc，blandm和mcr耐药菌的pcr检测的引物、探针(5’-3’)：kpc上游引物：cgcggaaccattcgctaakpc下游引物：cgcgtacacaccgatggakpc探针：quasar705-ctcgaacaggactttgg-bhq3ndm上游引物：5’-gaccgcccagatcctcaa-3’ndm下游引物：5’-attggcataagtcgcaatcc-3’ndm探针：quasar705-agatcaacctgccggtcgcg-bhq3mcr上游引物：ggcacatcgacggcgtatmcr下游引物：ggtatttggcggtatcgacatcmcr探针：quasar705-gtgccgtgtatgttcag-bhq3实施例6核酸测定试剂盒引物探针的设计和合成6在探针的5’标记joe荧光基团，探针的3’标记dab荧光基团。合成针对产各种blakpc，blandm和mcr耐药菌的pcr检测的引物、探针(5’-3’)：kpc上游引物：cgcggaaccattcgctaa(序列如seqidno：1)kpc下游引物：cgcgtacacaccgatgga(序列如seqidno：2)kpc探针：joe-ctcgaacaggactttgg-dab(序列如seqidno：3)ndm上游引物：5’-gaccgcccagatcctcaa-3’(seqidno：4)ndm下游引物：5’-attggcataagtcgcaatcc-3’(seqidno：5)。ndm探针：joe-agatcaacctgccggtcgcg-dab(序列如seqidno：6)mcr上游引物：ggcacatcgacggcgtat(序列如seqidno：7)mcr下游引物：ggtatttggcggtatcgacatc(序列如seqidno：8)mcr探针：joe-gtgccgtgtatgttcag-dab(序列如seqidno：9)实施例7核酸测定试剂盒的制备及使用1、核酸荧光pcr检测混合液的制备：制备方法如下：配制10pmol/μl的kpc-ndm-mcr上游引物、kpc-ndm-mcr下游引物以及5pmol/μl的kpc-ndm-mcr探针，再取等体积的上述引物探针混匀制成一管引物探针混合液。取qpcrmastermix(2x)10μl，与3μl的引物探针混合液、0.3μl的taqdna聚合酶、工艺用水1.7μl混合，获得体积为15μl的核酸荧光pcr检测混合液。制备n×15μl核酸荧光pcr检测混合液(n为反应管数)。2、加样每支pcr管中取上述混合液15μl，然后向每支pcr管中再分别加入待测样品dna制备液5μl，盖好pcr管盖，立即进行pcr扩增反应。3、pcr扩增反应管置于定量荧光pcr仪上，推荐循环参数设置：abi7500fastdx仪器：95℃2min，(95℃15s，60℃30s)40个循环博日9600plus仪器：94℃2min，(94℃10s，60℃40s)40个循环。实施例8核酸测定试剂盒的灵敏度分析根据美国临床实验室标准化研究所的指导方针确定了本多重实时pcr检测灵敏度实验方案。(1)制备三管106cfu/ml浓度的菌悬液：blakpc基因采用菌株atccbaa-17052，blandm基因采用菌株cdc88，mcr基因采用菌株cdc346。(2)制备一管菌混合液，该菌混合液中上述三个菌株的浓度为106cfu/ml，再将该菌混合液逐级稀释成8个浓度梯度的稀释液，各稀释浓度分别见下表3-1，3-2，3-3。将稀释浓度约100cfu/ml浓度的菌混合液液按照标准微生物学方法进行细菌计数。(3)提取上述8个浓度梯度稀释液的菌混合液dna，备用。(4)实时pcr分析本多重实时pcr检测的灵敏度。每个稀释度三个重复，重复三天，故每个稀释度一共得到9个数据，利用spss统计软件版本22.0(95％阳性率水平)统计本多重实时pcr的灵敏度。本多重实时pcr对blakpc，blandm和mcr的分析灵敏度分别为567cfu/ml，829cfu/ml和405cfu/ml，扩增曲线分别见附图1-9，数据结果分别见下表3-1、表3-2和表3-3。目前国内有两家生产kpc检测试剂盒的公司，上海之江生物科技和深圳普瑞康生物技术，两家生产的kpc检测试剂盒的检测限为1000copies/ml，并且国内临床并没有同时检测多种耐药基因(blakpc，blandm和mcr)的试剂盒或检查方法。表3-1多重pcr对blakpc灵敏度分析结果表3-2多重pcr对blandm灵敏度分析结果表3-3多重pcr对mcr灵敏度分析结果实施例9核酸测定试剂盒的精确度分析根据美国临床实验室标准化研究所的规程确定了本pcr检测灵敏度实验方案。通过检测以下类型的样本，对本实时pcr检测的准确性进行了评估，菌株的来源：(1)参考菌株从atcc或者cdc获得，n＝88；(2)为某高流行kpc教学医院的临床样本，n＝200；(3)单个或多个外添加目标基因的标本，n＝13。参考菌株从atcc、cdc(n＝88)或者本实验室收集的患者样本(n＝200)，以及单个或多个外添加目标基因的标本(n＝13)，共301株样本，其中包括283株革兰氏阴性菌株和5种念珠菌，如下：鲍氏不动杆菌acinetobacterbaumannii(n＝17)，弗罗因德(氏)枸橼酸杆菌citrobacterfreundii(n＝1)，产气肠杆菌enterobacteraerogenes(n＝2)，阴沟肠杆菌enterobactercloacae(n＝12)，大肠杆菌escherichiacoli(n＝165)，催产克雷白(氏)杆菌klebsiellaoxytoca(n＝1)，臭鼻克雷白氏杆菌klebsiellaozaenae(n＝2)，肺炎克雷伯氏菌klebsiellapneumoniae(n＝55)，摩根(氏)菌morganellamorganii(n＝1)，奇异变形杆菌proteusmirabilis(n＝1)，雷氏普罗威登斯菌providenciarettgeri(n＝1)，绿浓杆菌pseudomonasaeruginosa(n＝21)，灵杆菌serratiamarcescens(n＝4)和念珠菌candidaspecies(n＝5)。从atcc或cdc获得的菌株是否含有耐药基因，在菌株说明书中都有详细的说明；而对于临床菌株，采用illuminamiseq或hiseq对菌株全基因组测序，再在全基因组序列的基础上，采用基因从头组装技术来确定临床菌株中是否含有blakpc、blandm、mcr基因，其中确定的kpc阳性样本45份，ndm阳性样本共39份，mcr阳性样本共15份。提取这301份样本的dna，采用本实时荧光定量pcr检测这301份样本blakpc、blandm、mcr基因。结果见表4-1，4-2，4-3，其中blakpc阳性标本45份(包括全部19种已知耐药基因型)，与已知的阳性样本数一致，敏感性、特异性和总体精度都达到了100％；blandm阳性标本39份(包括全部16种已知耐药基因型)，总体精度、敏感性100％和特异性都达到了100％；mcr阳性标本15份(包括全部2种已知耐药基因型)，与已知的阳性样本数一致，敏感性、特异性和总体精度都达到了100％。表4-1本pcr对blakpc基因精确度的检测结果表4-2本pcr对blandm基因精确度的检测结果表4-3本pcr对mcr基因精确度的检测结果实施例10核酸测定试剂盒的重复性分析1、批内重复性以美国临床和实验室标准协会(clsi)的定性分析方法为指南检测本多重pcr实验的批内重复性。准备含blakpc，blandm和mcr基因浓度为108cfu/ml菌悬液，制备高中低三个浓度(浓度分别为107、105、103cfu/ml)的菌悬液提取dna备用。实时pcr分析本多重实时pcr检测的批内重复性，每个稀释度每次三个重复，计算得到的三个ct值的平均值和标准差(sd)，结果见表5-1，5-2，5-3，扩增曲线图见附图10，11，12。实验结果表明，本多重pcr对blakpc，blandm和mcr三种目标基因检测的批内重复性都达到了100％。表5-1多重pcr检测blakpc基因批内重复性结果表5-2多重pcr检测blandm基因批内重复性结果样本名称浓度单位(cfu/ml)ndm结果ctct平均值ct标准差稀释度11.00e+07pos19.8319.820.08稀释度11.00e+07pos19.90稀释度11.00e+07pos19.74稀释度21.00e+05pos26.1826.280.22稀释度21.00e+05pos26.54稀释度21.00e+05pos26.13稀释度31.00e+03pos34.2733.640.60稀释度31.00e+03pos33.56稀释度31.00e+03pos33.09表5-3多重pcr检测mcr基因批内重复性结果2、批间重复性以美国临床和实验室标准协会(clsi)的定性分析方法为指南检测本多重pcr实验的批间重复性。准备含kpc-ndm-mcr混合基因的菌悬液，制备4个浓度的菌悬液提取dna备用。每个浓度每次两个重复，连续做三天，则每个浓度得到6个数据。计算得到的6个ct值的平均值和标准差(sd)。结果见表6-1，6-2，6-3，各pcr扩增曲线图见附图13-21。本多重pcr检测blakpc基因批间重复性为95.8％(23/24)，检测blandm基因批间重复性为100％(24/24)，检测mcr基因批间重复性为100％(24/24)，整体间的重复性为98.6％(71/72)。表6-1多重pcr检测blakpc基因批间重复性结果表6-2多重pcr检测blandm基因批间重复性结果表6-3多重pcr检测mcr基因批间重复性结果实施例11核酸测定试剂盒的线性分析制备含blakpc，blandm和mcr各靶基因10cfu/ml到108cfu/ml的8个浓度的稀释液，提取各稀释液dna备用。运用本多重pcr检测对三种耐药基因的线性度，线性度的扩增曲线见附图22-24，线性度的标准曲线见附图25。如图22-25所示，本pcr对blakpc，blandm，mcr基因的线性度检测结果跨度超过七个对数单位。实施例12本核酸测定试剂盒的特异性分析为了研究本多重pcr的分析特异性，本实验分析了88株参考菌株的耐药性，其中包括了常见的多重耐药革兰氏阴性菌，如鲍氏不动杆菌acinetobacterbaumannii(n＝14)，产气肠杆菌enterobacteraerogenes(n＝2)，阴沟肠杆菌enterobactercloacae(n＝9)，大肠杆菌escherichiacoli(n＝15)，奥克西托克雷白杆菌klebsiellaoxytoca(n＝1)，臭鼻克雷白氏杆菌klebsiellaozaenae(n＝2)，肺炎克雷伯氏菌klebsiellapneumoniae(n＝23)，摩根(氏)菌morganellamorganii(n＝1)，奇异变形杆菌proteusmirabilis(n＝1)，雷氏普罗威登斯菌providenciarettgeri(n＝1)，铜绿假单胞菌pseudomonasaeruginosa(n＝12)，粘质沙雷氏菌serratiamarcescens(n＝2)，念珠菌candidaspecies(n＝5)。这88株菌株中，11株blakpc阳性，14株blandm阳性，2株mcr阳性，其余为耐药基因阴性菌株。提取这88份样本的dna，研究本实时pcr对blakpc，blandm，mcr特异性，结果扩增曲线如附图26-28所示，blakpc阳性结果为11株，blandm阳性结果为14株，mcr阳性结果为2株，与已知的一致，其余为耐药基因阴性菌株，本pcr正确检测所有的耐药基因，无交叉反应。对于干扰物质的研究中，本实验采用了高水平的人类血红蛋白和粪便标本进行了分析，均不会干扰本pcr检测。结论本研究中的三重pcr同时检测革兰氏阴性菌株中的blakpc，blandm和mcr基因，具有良好的灵敏度、精确度和可重复性，本三重pcr实验中所用到的针对每个靶基因的引物探针能够检测到目前所有描述的等位基因，这是目前其他的同类pcr无法做到的。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。sequencelisting<110>北京紫萌医药科技有限公司<120>一种能同时检测多种高耐药基因的检测试剂盒及其应用<130>3<160>9<170>patentinversion3.3<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列<400>1cgcggaaccattcgctaa18<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列<400>2cgcgtacacaccgatgga18<210>3<211>17<212>dna<213>人工序列<400>3ctcgaacaggactttgg17<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4attggcataagtcgcaatcc20<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列<400>5tggagcatgtggtttaattcga22<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6agatcaacctgccggtcgcg20<210>7<211>18<212>dna<213>人工序列<400>7ggcacatcgacggcgtat18<210>8<211>22<212>dna<213>人工序列<400>8ggtatttggcggtatcgacatc22<210>9<211>17<212>dna<213>人工序列<400>9gtgccgtgtatgttcag17当前第1页12