专利名称：细菌耐药基因检测芯片及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种高通量的细菌耐药基因检测芯片及其应用。基因芯片的探针选择包括超广谱β内酰胺酶、头孢菌素酶、碳青霉烯酶、整合酶类基因、四环素家族耐药基因、氨基糖甙类药物耐药基因、耐消毒剂基因、红霉素耐药相关基因、大环内酯类外排基因、耐万古霉素耐药基因、多药耐药外排泵基因、耐莫匹罗星基因、磺胺类耐药基因、泰洛星耐药基因、氟喹诺酮类药物耐药基因、氯霉素酰基转移酶、常用基因工程载体耐药基因等17 大类耐药基因，共117条基因探针，可用于病原菌耐药基因的检测。本发明及应用涉及的技术领域是医学检验和基因芯片技术。
背景技术：
近几十年来，随着广谱抗生素的广泛不合理使用，导致大多数细菌有多重耐药性， 尤其近年来出现了超级细菌，极易引起医院获得性感染。据报道，全球60亿人口，每年3亿人住院，1500万人患医院感染，150万人死于医院感染。中国内地院内感染发生率约为8%， 且漏报率很高，给临床治疗造成很大困难，也构成了严重的公共卫生问题。因此对这些病原菌快速检测确定其耐药性，不仅在指导临床合理选用抗菌药有重要价值，也为预防和控制耐药细菌感染和传播提供依据，为耐药疫情监控和监测检验提供了可靠的技术手段，具有重要的现实意义
细菌耐药性严重的现况引起了很多国家的重视，为了预防、控制病原菌的传播，各国政府都加大投入开发快速有效的诊断方法来检测、诊断和控制病原菌。目前，一般检测耐药性的方法有药物敏感试验、质粒消除试验、质粒指纹图谱技术、分子杂交技术，PCR等，但这些检测方法在临床上难以及早进行病原学诊断和耐药性测定，无法满足临床救治危重感染者的需要。比如细菌的培养，根据不同的病原菌类型需要从1 到数天不等，对于个别细菌 (如结核分枝杆菌)需要更长的时间，甚至需要专门的实验室生长条件。临床上细菌耐药性检测主要使用药敏试验，其优点在于方便、简捷、易判定，但只能对少量样品进行一对一检测分析，也无法反映出细菌耐药的来源和传播机制。近年来分子杂交技术和PCR也已经广泛应用于细菌耐药性的检测，弥补了药敏试验的不足，分子杂交技术特异性较好，但操作步骤繁琐，耗时长，而常规PCR技术往往只限制于单一耐药基因的的检测，要对细菌众多的耐药基因进行检测需要做大量的工作，甚至难以实现。基因芯片技术(Gene chip)于上世纪90年代发展起来，是将多种寡核苷酸分子固定于固相载体上形成DNA微阵列，将样品核酸用同位素和荧光等方法标记，与芯片探针杂交检测样本内的多种特异DNA序列，通过计算机系统分析，迅速得到获得样品中大量基因序列特征或基因表达特征信息。基因芯片为感染性疾病的临床诊断提供了有力的工具，与传统检测方法相比有多种优点能同时进行高通量分析；无需机体免疫应答反应，能早期检测诊断；对检测样品需要量少，效率高；可用于大规模的病原菌分类鉴定，耐药性及毒力因子检测等。因此，基因芯片在医学领域中已有了广泛的应用。
多种病原微生物的基因组序列已被阐明，各种各样的耐药基因被克隆、测序，为建立细菌耐药基因检测芯片奠定了基础。研制细菌耐药基因检测芯片，能为快速确定病原菌的抗药性、临床正确选用抗菌药提供依据，对预防和控制耐药细菌感染和传播有重大意义。
发明内容
本发明目的是针对上述不足之处提供一种细菌耐药基因检测芯片及其应用，是建立一种检测17大类耐药基因的基因芯片，可对病原菌进行高通量快速检测，17大类耐药基因包括超广谱β内酰胺酶、头孢菌素酶、碳青霉烯酶、整合酶类基因、四环素家族耐药基因、氨基糖甙类药物耐药基因、耐消毒剂基因、红霉素耐药相关基因、大环内酯类外排基因、 耐万古霉素耐药基因、多药耐药外排泵基因、耐莫匹罗星基因、磺胺类耐药基因、泰洛星耐药基因、氟喹诺酮类药物耐药基因、氯霉素酰基转移酶、常用基因工程载体耐药基因等。根据NCBI数据库提供的耐药基因序列，从17大类耐药基因中筛选了 117条基因探针，用于制备基因芯片，建立基因芯片的检测及分析方法，并进行应用。该基因芯片可用于含17大类耐药基因的病原菌检测、分型、合理用药、感染病监测及流行病学调查。—种细菌耐药基因检测芯片及其应用是采取以下技术方案实现
一种细菌耐药基因检测芯片包括(1)17大类耐药基因的117条寡核苷酸探针组合和质量控制探针；(2)寡核苷酸探针通过手臂分子固化在载体材料上形成的探针阵列；
所述的寡核苷酸探针是指化学合成的多种耐药基因序列的高度保守区的互补寡聚核苷酸，长度为十到五十个碱基；
所述的细菌耐药基因检测芯片是指能检测17大类耐药基因的寡核苷酸阵列，17大类耐药基因包括超广谱β内酰胺酶、头孢菌素酶、碳青霉烯酶、整合酶类基因、四环素家族耐药基因、氨基糖甙类药物耐药基因、耐消毒剂基因、红霉素耐药相关基因、大环内酯类外排基因、耐万古霉素耐药基因、多药耐药外排泵基因、耐莫匹罗星基因、磺胺类耐药基因、泰洛星耐药基因、氟喹诺酮类药物耐药基因、氯霉素酰基转移酶、常用基因工程载体耐药基因；
所述的质量控制探针至少包括两种探针，即阳性对照和阴性对照；阴性对照用于检测杂交信号错误或污染，阳性对照用于检测是否正常杂交的和准确定位； 所述的手臂分子指具有双活性基团的长链有机化合物；
所述寡核苷酸固定为寡聚核苷酸的末端有一特定基团，固化在载体材料基质表面时与表面修饰的手臂分子的末端基团形成共价键；
所述的117条基因探针，其中探针的任何组合，用于基因芯片等的制备，固相载体材料包括但不仅限于玻片、金属片、硅片、陶瓷片、塑料片、硝酸纤维膜、尼龙膜等。所述的细菌耐药基因检测芯片，用于含有17大类耐药基因的病原菌检测、分型、 合理用药、感染病监测及流行病学调查。这些探针的固相载体材料包括多种方法处理的玻片、金属片、硅片、陶瓷片、塑料片、硝酸纤维膜、尼龙膜和其它高分子聚合物制成的膜及片等。这些固相载体表面以具有双活性基团的长链有机化合物进行修饰，常用的有戊二醛、三羟甲基氨基硅烷(APTES)、N, N- 二乙氧基氨基丙基三乙氧基硅烷、多聚赖氨酸，可采用其中的一种或其中的两种的组合。17大类耐药基因的117条基因探针选择及设计原则根据NCBI数据库中17大类耐药基因的序列，选择探针长度在40 50nt，5’末端进行氨基化修饰并附加10个碱基T。其它参数如退火温度Tm和GC%含量等按照设计原则进行严格控制。每种探针均经两种以上生物学软件筛选，再以人工选定和调整，Blast验证，最终选择具有各类耐药基因代表性的序列作为检测探针。探针设计的原则如下 (1)高度的特异性和敏感性
筛选出的探针应该位于基因序列的高保守区，以保证探针的特异性和敏感性；同时，筛选的探针应该于人基因组序列、其他细菌和微生物、相关动物的基因组序列、环境中常见植物基因序列尽可能同源性低，以避免假阳性结果。寻找和筛选出高度特异性探针是至关重要的。(2) 17大类耐药基因探针的Tm值尽可能一致
因为在一张芯片是同时进行多条探针的杂交反应，在一定温度下，此时各探针Tm值至关重要，如果Tm值不一致，差距过大，杂交后的荧光信号强弱会受到相当的影响。一般Tm 值相差小于三度比较适宜。(3)各种探针有近似的碱基长度
芯片探针的长度，对检测的敏感性和特异性有一定的影响。各探针碱基长度一致，在一定程度上可消除杂交后芯片扫描仪扫描焦距定位所带来的差异，我们设计的探针碱基数目在 40 50nt。(4)筛选的探针尽可能避免二级结构
探针应该最好没有发夹结构，自身二聚体，错配等。否则容易形成错误结果。(5)避免选取G、C富集区域的序列做探针
(6) 17大类耐药基因探针的互补序列之间不形成二聚体和错配探针筛选的方法
登陆美国生物技术中心(National Center for Biotechnology Information , NCBI) 主页，从NCBI数据库中检索了 17大类耐药基因的序列，比较同一类别耐药基因序列有无存在变异情况，根据上述探针设计原则，用I^imer Primers5. 0, 01igo6. 0等生物学软件在耐药基因的碱基对齐图上找出所有可能的探针，结合Clustal W等同源性分析软件找处特定耐药基因靶基因DNA序列的高度保守区，选择核酸序列的Blast，进行数据库类似检索 (同时检索GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库)，筛选的探针于已知人类基因组序列，其它常见细菌和微生物、相关动物的基因组序列、环境中常见植物基因序列尽可能同源性低，碱基数 40 50nt左右，Tm值平均83 84°C之间，G+C含量约为50%，根据Blast结果，再结合需求和经验，手工对筛出的探针进行微调和整修。然后对得到的这17大类耐药基因探针用RNA Mructure软件进行分析，以排除不同探针互补序列间形成影响和干扰杂交的二级结构。阳性内参照探针采用的是与抗生素耐药基因无同源性的植物基因序列片段。在后面实际的芯片杂交检测中，根据总体的需要和检测的结果，调整了部分使用的探针。设计筛选的17大类耐药基因的117条基因探针
所述的检测17大类耐药基因的117条寡核苷酸基因探针如下 整合酶类基因探针选自I类整合酶基因(IntIl)和II类整合酶基因(IntI2)，每个基因选取正负链探针各一条，共4条探针
intll 基因正链探针 5’ -NH2-T(10)CCAGTGGACATMGCCTGTT0GGTT0GTMACTGTMTGCMGTAGC-3，intll 基因负链探针 5，-NH2-T (10) CTCTACGACGATGATTTACACGCATGTGCTGAAAGTTGGCG-3' intI2 基因正链探针 5，-NH2-T (10)GGGCATTTAAAGCGATTTTCTGCGTGTTTATGGCTACATGTCTG-3' intI2 基因负链探针 5，-NH2-T (10) ATGCTTGCGTTTGCGGGTTAAAGATTTTGATTTTGATAATGGCTG-3' 四环素家族耐药基因探针选择tetM基因，设计正负链探针各一条，Tet(M)是研究得最多的核糖体保护蛋白，具有核糖体依赖的GTP水解酶活性，共2条探针
tetM 基因正链探针 5，-NH2-T (10) AGTGGGAAMTACGMGGTGMCATCATAGACACGCCAGGACA-3' tetM 基因负链探针 5' -NH2-T (10)MGCGGATCACTATCTGAGATTTCCAAMGGGCATCMGCM-3' 氨基糖甙类药物耐药基因探针，选取了易于传播并且危害较大的氨基糖甙类修饰酶基因有 aac (3) -I、aac (3) -11、aac (3) -III、aac (3) -IV、aac (6，)-I、aac (6，) -11、aphA6， ant (3') -I和ant (2’ ’)-I共9种，每个基因选取正负链探针各一条，共18条探针
aac (3)-1 基因正链探针 5，-NH2-T (10)GGTGCTTATGTGATCTACGTGCAAGCAGATTACGGTGACGATC-3' aac (3)-1 基因负链探针 5，-NH2-T (10)GAAAAGATCAAGAGCAGCCCTCATGGATTTGACTTGGTCAGG-3' aac (3)-11 基因正链探针 5，-NH2-T (10)GTCGAAACTATAGCAAATGCTTACGTGAAGCTCGGTCGCCAT-3' aac (3)-II 基因负链探针 5，-NH2-T (10) AATCGAGAATGCCGTTTGAATCGTATTCTGATGCCGTTTTCC-3' aac ⑶-III 基因正链探针 5，-NH2-T (10) TGGCTMACTGGTGGCMTAGMGGATA0GTGCTGATGCTTG-3， aac (3)-III 基因负链探针 5' -NH2-T (10) CTATCCGTATGACGCTGAGTCACCGAACCGTGATTCAAGC-3' aac ⑶-IV 基因正链探针 5，-NH2-T (10) CTCAAGGAGAAGAGCCTTCAGMGGAAGGTCCAGTCGGTCAT-3' aac ⑶-IV 基因负链探针 5，-NH2-T (10) GTACCAACTTGCCATCCTGAAGAATGGTGCAGTGTCTCGG-3' aac (6，) -Ib 基因正链探针 5，-NH2-T (10) ACTTGCTGA0GTACAGGMCAGTACTTGCCMGCGTTTTAGCG-3， aac (6，) -Ib 基因负链探针 5，-NH2-T (10) ACTGGTCTATTC0GCGTACTCCTGGAT0GGTTTCTTCTTCCC-3， aac (6，) -II 基因正链探针 5，-NH2-T (10) GGTGGGAAGATGAAACTGATCCAGGAGTGCGAGGAATAGACC-3' aac (6，) -II 基因负链探针 5，-NH2-T (10) GTAGTGTTCCAGCACTTCATCMGAGT0GGT0GCTCTT0GTC-3， aphA6 基因正链探针 5，-NH2-T (10) TTGCCCMTATTATTCMCMTTTATCGGMACAGCGTTTTAGAGCCA-3， aphA6 基因负链探针 5，-NH2-T (10) 0GATTAMAGMTMACATC0GATGGCGACTGACCMTTTTATTTGGC-3， ant ( 3，)-I 基因正链探针 5，-NH2-T (10) TTGATC0GGTTCCTGMCAGGATCTATTTGAGGCGCTMATG-3， ant( 3，)-1 基因负链探针 5，-NH2-T (10) AO5GAATGATGT0GT0GTGCACAACAATGGTGACTTCTACAG-3' ant (2，，) -I 基因正链探针 5，-NH2- T (10) TACMAGCACATAGAGTCCTACAGGCT0GCATGCACCTCACTC-3， ant (2，，) -I 基因负链探针 5，-NH2-T (10) CAT0GGCATAGTAMAGTMTCCCAGATGAT0GCCTCCCAGC-3， 耐消毒剂qacA/B家族基因探针，设计正负链探针各一条，共2条探针 qacA/B 基因正链探针 5' -NH2-T (10)GATTTAGCTCATGTAGCTGAAGAATCTGTAGTGGGCGCTGTCGAA-3' qacA/B 基因负链探针 5' -NH2-T (10) TGCCATGAAAATTGCTCAAGTAAAGCTCCTCCGATAATTGGTCC-3' 红霉素耐药相关基因探针，已发现Erm基因家族有20余种基因亚型，以ErmA，ErmB和 ErmC三型为主，每个基因选取正负链探针各一条，共6条探针
ErmA 基因正链探针 5' -NH2-T (10) GATCCCCTACGGCATCACCTCCGCCATCGTCGACTGGT-3' ErmA 基因负链探针 5' -NH2-T (10) ACCCGTCGAGGAGCTGGAACAGCGTGATCCACTGGTCG-3' ErmB 基因正链探针 5' -NH2-T (10) TTGAAAGCCATGCGTCTGACATCTATCTGATTGTTGAAGAAGGATTC-3' ErmB 基因负链探针 5，-NH2-T (10)GCMGAGCMCCCTAGTGTTCGGTGMTATCCMGGTACGCTT-3' EnnC 基因正链探针 5' -NH2-T(10)0GTGGMTA0GGGTTTGCTMMGAnAnMATACMM0GCTCATTGGC-3， ErmC 基因负链探针 5，-NH2-T(10)GGGTAMATGCCCTTTTCCTGAGC0GATTTCMAGATATTATCATGTTC-3，大环内酯类外排(mefA)基因探针，设计正负链探针各一条，共2条探针 mefA 基因正链探针 5，-NH2-T (10) TACCCCAGCACTCAATGCGGTTACACCACTTTTAGTACCAGAAGAA-3' mefA 基因负链探针 5，-NH2-T (10) TGCAATCACAGCACCCAATACGTCGATGGCAATAATAGCATTTAA-3' 耐万古霉素耐药基因探针，选用了由不同的耐药基因簇编码的VanA、VanB, VanCU VanC2,VanD, VanE6种表型，每个基因选取正负链探针各一条，共12条探针
VanA 基因正链探针 5' -NH2-T (10) AAMTCTTMTTGAGCAGGCTGTTTTGGGCTGTGAGGTCGGT-3' VanA 基因负链探针 5，-NH2-T (10) TACAMTCGCTGAGCTTTGMTATCGCAGCCTACAMGGGGA-3' VanB 基因正链探针 5' -NH2-T (10) ACGGMGMCTTMCGCTGCGATAGMGCGGCAGGACMTAT-3' VanB 基因负链探针 5，-NH2_T(10) CCGTATCMTGTTCGCAGCMTTTCTATTGCGGATTTTACCGA-3， VanCl 基因正链探针 5' -NH2-T (10) CTTGMCTMTGMCCTGCCTTATGTTGGTTGCCATGTCGCTG-3' VanCl 基因负链探针 5' -NH2-T (10) CACAGTAGAACCGTAAGCAAAAGCAGTCGTTAATGCAGATTGGAGC-3' VanC2 基因正链探针 5，-NH2-T (10) AMTCMTACTATGCCGGGCTTTACGAGTCACTCCCGCTATCC-3' VanC2 基因负链探针 5，-NH2-T (10) CGTCTACTMTGAMTGGCGTCACMGCACCGACAGTCAMGA-3' VanD 基因正链探针 5' -NH2-T (10) AGGAACATGATGTTTCAGTGAAATCTGCGATGGAGGTTGCA-3' VanD 基因负链探针 5' -NH2-T (10) ATGCGTGGATAACGGCTATAGGAAGTAAATCCAGGCATGGTGTTC-3' VanE 基因正链探针 5' -NH2-T (10) CATGGAGGTTATGGTGAGAATGGTGCTATGCAGGGAGTATTTGAG-3' VanE 基因负链探针 5' -NH2-T (10) TGTCGTTCCTTCAAATAGATACCAATGACCTTCTTCGGTGATCCCTA-3' 多药耐药外排泵基因探针，选择包括AcrAB- TolC, OprM和Sme DEF外排泵基因，每个基因选取正负链探针各一条，共6条探针
AcrAB-TolC 基因正链探针 5，-NH2-T(10)GCAGMGTT0GTCCTCMGTTAGCGGGATTATCCTGMGCGT-3， AcrAB-TolC 基因负链探针 5，-NH2-T (10) TTCAGCAGGATTTTGC0GMCTCTTCAGTAGAGGTCAGA0GC-3， OprM 基因正链探针 5' -NH2-T (10) CCAAMGAGGGCGGGATAGGCTAGAGCCCCTATAGCACTAGG-3' OprM 基因负链探针 5' -NH2-T (10) GTAGCTGCGCTGGGTCAGGTCGAAACTCTTCTGGTAGGTG-3' Sme DEF 基因正链探针 5' -NH2-T (10) AGTACCGATGGAAGTGATCCCCATGAAAAGTGCATCCCTGTT-3' Sme DEF 基因负链探针 5，-NH2-T (10) GTTGGACGAGCTGTTGGAGGAGMGTAGATCAGGCCATCAAG-3' 耐莫匹罗星(ileS)基因探针，设计正负链探针各一条，共2条探针 ileS 基因正链探针 5' -NH2-T (10)GAGCCGATTCTTTMGATGGGCCTTMTTTCGGATAGTGCTCCA-3' ileS 基因负链探针 5，-NH2-T (10) TTTCTGGTTATCAAAAGGATAATGATGCTGAGCAAACGGCATAGAGC-3' 磺胺类耐药基因探针，选择了 dfrA和dfrD两型，每个基因选取正负链探针各一条，共 4条探针
dfrA 基因正链探针 5，-NH2-T(10)GGMACCATTGCCMATAGA0GTM0GT0GTTCTCACTMCCMGCT-3， dfrA 基因负链探针 5，-NH2-T (10) (XT(XCATTACAAGTGTATTCCCAGTGGTCAGTTGTTTAACATGCTTT-3' dfrD 基因正链探针 5，-NH2-T(10)TTGTTGCGATGGATMGAMAGAGTMT0GGCMGGATM0GACATTC-3， dfrD 基因负链探针 5，-NH2-T(10)CCCTTC0GATTGATTGMGGTTCTTTCTACCTMTATGATTGCATGTCCT-3， 泰洛星(tlrB)耐药基因探针，设计正负链探针各一条，共2条探针 tlrB 基因正链探针 5，-NH2-T(10) CTACGGTCATGCGGMGMCGTCGTGCGATATCTGCGCTGTC-3， tlrB 基因负链探针 5' -NH2-T (10) AGCTTCGTCGGGCGTCTGAGCAGATTCACATAGCCCTGCC-3' 氟喹诺酮类(norA)药物耐药基因探针，norA基因介导的耐药在金葡菌中相当常见，设计正负链探针各一条，共2条探针norA 基因正链探针 5，-NH2-T (10) TCCTCACAAAGCAACTACTGATGGATTCCACCAATATCAACCTGAA-3' norA 基因负链探针 5，-NH2-T (10) TCGTCCAATAACCGTTTGCAAGCACTMCATAACGAGAACAATGG-3' β内酰胺酶类(BLA)耐药基因探针，划分为超广谱β内酰胺酶、头胞菌素酶、碳青霉烯酶、金黄色葡萄球菌(MRSA)金标准mecA基因。 其中超广谱β内酰胺酶(ESBLs)耐药基因，按不同编码基因同源性分为TEM型、 SHV型、CTX-M型(由于各亚型间⑶S核酸基因序列差异较大，根据其序列的同源性分3组)， PER型和VEB型，每个基因选取正负链探针各一条，共14条探针
TEM 基因正链探针 5' -NH2-T (10) TTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAA-3' TEM 基因负链探针 5，-NH2-T (10) GCGTCMCACGGGATMTACCGCACCACATAGCAGMCTTTM-3' SHV 基因正链探针 5' -NH2-T (10) TAACAAAGCAGAGCGCATCGTGGTGATTTATCTGCGGGATA-3' SHV 基因负链探针 5' -NH2-T (10) AGTAGTCCACCAGATCCTGCTGGCGATAGTGGATCTTTCGC-3' CTX-Ml 基因正链探针 5，-NH2-T (10) ATGAGACGTTTCGTCTGGATCGCACTGAACCTACGCTGAATA-3' CTX-Ml 基因负链探针 5' -NH2-T (10) CCGCCATAACTTTACTGGTACTGCACATTGGAAAGCGTTCATC-3' CTX-M2 基因正链探针 5' -NH2-T (10) AAGAAGAGCGACCTGGTTAACTACAATCCCATTGCGGAGAAACA-3' CTX-M2 基因负链探针 5' -NH2-T (10) CCCAGATGGGCAATCAGCTTATTCATGGCAGTATTGTCGCTAT-3' CTX-M3 基因正链探针 5' -NH2-T (10)GCGGTGCTGAAGAAAAGTGAAAGCGAACCGAATCTGTTAAATC-3' CTX-M3 基因负链探针 5' -NH2-T (10) CGTGAGCAATCAGCTTATTCATCGCCACGTTATCGCTGTACT-3' PER 基因正链探针 5，-NH2-T (10) CGGCCACTMTGATTTAGGTATCATTCTGTTGCCTGATGGACG-3， PER 基因负链探针 5，-NH2-T (10)GCACTGGAACACTAAACTCGTCTCCCTGATACGCTTTCATTATCGG-3' VEB 基因正链探针 5，-NH2-T (10) AGATTACCCCTCAAGACCTTTTGCCTAAAACGTGGAGTCCGATTAAA-3' VEB 基因负链探针 5' -NH2-T (10) TTTGATATTGGGTATTCCAATCCTTGTGCATTTGTTCTTCGTTTGCT-3' 头孢菌素酶(AmpC)耐药基因探针分为6组，几乎涵盖了所有的质粒AmpC基因序列，设计正负链探针各六条，共12条探针
AmpC 基因正链探针第一条 5，-NH2-T (10) AGCATCCAGCCGCTGCTCAAGGAGCACAGGATC-3' AmpC 基因负链探针第一条 5，-NH2-T (10) GCCTGCTTCGGCACATTGACATAGGTGTGGTGCAT-3' AmpC 基因正链探针第二条 5' -NH2-T (10) CCAGMCTGACAGGCAMMGTGGCAGGGTATCCGC-3' AmpC 基因负链探针第二条 5，-NH2-T (10) GTTTTCTCCTGAACGTGGCTGGCATCCATGTTGGC-3' AmpC 基因正链探针第三条 5，-NH2-T (10) CTTTCACAGGTGTGCTGGGTGCGGTTTCTGTGGC-3' AmpC 基因负链探针第三条 5，-NH2-T(10)GTA0GCATACTGGCTTTGCGCACTTTC0GGCACAGTMTMA-3， AmpC 基因正链探针第四条 5，-NH2-T (10) TATGGGTTAGCGGCAAMCAGCCTCAGCAGCCGGTTA-3' AmpC 基因负链探针第四条 5，-NH2-T(10)AGACTTTT0GC0GCMTCATCCCTAGCMACCAGTAC0GATA-3， AmpC 基因正链探针第五条 5' -NH2-T (10) CGCTTTTATCAAMCTGGCAGCCGCAGTGGMGCC-3' AmpC 基因负链探针第五条 5’ -NH2-T (10) 0GAGCTGCTTTTCAGGMTMATGCCA0GTAGCTGCCMAC-3’ AmpC 基因正链探针第六条 5，-NH2-T (10) CATGGCGMCTATGCCTA0GGCTATT0GMGGMGATMGCC-3， AmpC 基因负链探针第六条 5，-NH2-T(10)MCCCCATAGTTGMATAGTGGGCCTTGCCATCTTTCAGCAC-3， 碳青霉烯酶耐药基因探针，选取了常见的基因型IMPl型及通用型、0XA23型、OXAM型， VIM型和GES2型，每个基因选取正负链探针各一条，共11条探针
IMP 基因通用正链探针 5' -NH2-T(10)CACT0CATTTA0GGCTAMGATACTGMMGTTAGTCACTTGGTTTGTGG-3， IMPl 基因正链探针 5' -NH2-T (10) CATTTTCATAGCGACAGCACGGGCGGMTAGAGTGGCTTMT-3'IMPl 基因负链探针 5，-NH2-T (10) CCGCCTGCTCTMTGTMGTTTCAAGAGTGATGCGTCTCCMC-3' 0XA23 基因正链探针 5，-NH2-T(10) TTAAMTGTTGMTGCCCTGATCGGATTGGAGMCCAGAMGC-3' 0XA23 基因负链探针 5，-NH2-T (10) TGATGAATCACCTGATTATGTCCTTGAACAATCTGACTCGGGGTTT-3' 0XA24 基因正链探针 5，-NH2-T (10)MTGGGTGTTACTCCACAGGTAGGTTGGTTGACTGGTTGGGT-3' 0XA24 基因负链探针 5，-NH2-T (10)GCTGACAATGCCATTGCCTCACCTAAAGTCATATCTTTCTCCCAC-3' VIM 基因正链探针 5' -NH2-T (10) GTGATGGTGATGAGTTGCTTTTGATTGATACAGCGTGGGGTG-3' VIM 基因负链探针 5' -NH2-T (10) GTTGCGATATGCGACCAAACACCATCAGCAATCTGGTAAAGC-3' GES2 基因正链探针 5' -NH2-T(10) CTGCGGTGCAGCTTAGCGACMTGGGGCTACTMCCTCTTAC-3' GES2 基因负链探针 5，-NH2-T(10) CCGCCATAGAGGACTTTAGCCACAGTACGTGCCATAGCMTAGG-3， MRSA金标准mecA基因探针，选取正负链探针各一条，共2条探针 mecA 基因正链探针 5，-NH2-T (10) GAACTCAAAATGAAACAAGGAGAAACTGGCAGACAAATTGGGTGG-3' mecA 基因负链探针 5，-NH2-T (10) TGGTCTTTCTGCATTCCTGGMTMTGA0GCTATGATCCCMTCTMCT-3， 常用基因工程载体耐药基因探针，包括氯霉素酰基转移酶(Cat)基因、博莱霉素( Zeocin )基因、杀稻瘟菌素(Bsr)基因、嘌呤霉素(Puromycin)基因、卡那霉素(Kana)基因， 氨苄霉素(Amp)基因和四环素(Tet)基因，每个基因选取正负链探针至少各一条，共16条探针
Cat 基因正链探针 5，-NH2-T(10) CCTTGCAGCTTCATCATGCTGTATGTGATGGTTACCATGCTTC-3， Cat 基因负链探针 5，-NH2-T(10) CCMGGMTCATTGAMTCGGTAGGGTGTTTTCAGGTATCGGTTT-3' Zeocin 基因正链探针 5，-NH2-T (10)GAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGMCTT-3' Zeocin 基因负链探针 5' -NH2-T (10) TCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAGTGCACGCAGTTG-3' Bsr 基因正链探针 5，-NH2-T(10) CCATTCATCTCMTGAGCACAMGCAGTCAGGAGCATAGTCAGA-3' Bsr 基因负链探针 5' -NH2-T (10) AGGTCGCCACTGAGAAGATCACCATGCTCTATGAGGACAACA-3' Puromycin 基因正链探针 5' -NH2-T (10)GCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCT-3' Puromycin 基因负链探针 5' -NH2-T (10)GGTGACGGTGMGCCGAGCCGCTCGTAGMGGGGAGGTT-3' Kana 基因正链探针 5' -NH2-T (10) GMTGMTMCGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAG-3' Kana 基因负链探针 5' -NH2-T (10) CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTAT-3' Tet 基因正链探针 5' -NH2-T (10) CACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGG-3' Tet 基因负链探针 5，-NH2-T (10) CGTAGTCGATAGTGGCTCCAAGTAGCGAAGCGAGCAGGA-3' Amp 基因正链探针第一条 5，-NH2-T (10) CACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGA-3' Amp 基因负链探针第一条 5，-NH2-T (10) CGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTA-3' Amp 基因正链探针第二条 5，-NH2-T (10) GCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCC-3' Amp 基因负链探针第二条 5，-NH2-T (10) CGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTAT-3' 所述的细菌耐药基因检测芯片，其犄征在于所述的117条基因探针，其中探针的任何组合，用于基因芯片等的制备，固相载体材料包括但不仅限于玻片、金属片、硅片、陶瓷片、 塑料片、硝酸纤维膜、尼龙膜等。所述的细菌耐药基因检测芯片，用于含有17大类耐药基因的病原菌检测、分型、 合理用药、感染病监测及流行病学调查。
本发明细菌耐药基因检测芯片的制作选择载玻片为芯片的载体，玻片购自Fisher kientific公司，用铬酸洗液浸泡过夜， 然后用双蒸水清洗，在浸入25%的氨水中过夜，用双蒸水清洗。晾干后浸入含有氨丙基三甲氧基硅烷的95%乙醇(pH4. 5)中20min，再用95%乙醇超声清洗，换蒸馏水超声清洗，115°C 烘干。将已硅烷化的玻片浸泡在5%的戊二醛溶液中50min，超声lOmin，水洗两次，晾干备用。筛选出的基因探针由商业公司进行化学合成。将合成的探针在96孔板中用 3父55(溶解，用0111丨81~即11虹 MiniArrayer点样仪MCP360点样针，按设计的方案点样。 将17大类耐药基因的117条探针，1条空白对照探针，1条阳性内参探针设计形成一个点样阵列，每条探针重复4次，在阵列的右侧和下侧对应检测探针分别点上阳性内参探针，阳性参照同时起到定位作用，空白对照监控芯片本底信噪比。点样完毕，37°C水化ai，4°C保存备用。为了封闭玻片上未与寡核苷酸结合的醛基，按照以下程序对玻片进行处理0. 2% SDS洗两次，每次5min ；双蒸水洗两次，每次5min ；将玻片放入封闭(还原)液中20min。0. 2% SDS洗三次，每次Imin ；双蒸水洗两次，每次Imin ；玻片自然干燥，即可投入使用。样本核酸的提取及标记
我们收集样本，测试并比较优化了被检样本的处理方法，建立了快速抽提高质量的各类病原菌的全基因组DNA的标准操作程序。相同的样本尽量采取相同的处理方法。对于提取的细菌全基因组DNA用随机引物法荧光标记，用6mer的随机引物与变性双链DNA随机互补结合(退火)，以提供3’羟基端。接着在无5’一 3，外切酶活性的Klenow片段的作用下， 在引物的3’羟基末端逐个加上含有Cy3标记的核苷酸，逐步形成标记的DNA。基因芯片的检测及分析
将荧光标记的目标DNA与杂交液(含阳参)1 :1充分混勻，98°C变性5min冰浴。取出点在探针阵列区域，盖上大小合适的经硅烷化的盖玻片，将芯片放入杂交盒(盒内有适当的2XSSC以保持湿度)，42°C杂交4小时。取出芯片，依次用42°C预热的杂交洗液 I >11 >111(0. 2XSSC)各洗5min，最后用ddH20洗2min，自然晾干(以上过程均要求避光)，用 LuxScan 10K Version3. O微阵列芯片扫描仪扫描及图像分析。实验结果分析
实验结果表明，制备的17大类耐药基因检测芯片未见有特异性的交叉反应，并能够区分不同的基因型。对多份样品进行检测，均现实了较好的特异性和敏感性。基因芯片检测和17大类耐药基因的灵敏度是由扩增标记方法所限制的，灵敏度检测结果表明随机引物标记法没有PCR扩增标记灵敏度高，这是因为我们直接对全基因组DNA进行标记而非PCR 扩增，目标DNA在全基因组DNA中所占比例是有限的。然而，随着全基因组扩增技术(WGA)， 如多重置换扩增(MDA)逐步应用于基因芯片中，它能高度忠实的复制整个基因组DNA，扩增出10 100 kb大小的片段，能提供大量均一完整的全基因组序列，为芯片标记杂交提供足够的核酸量。本发明与现有技术相比具有的优点
(1)高特异性芯片检测的特异性是经过双重筛选的；
(2)高通量对多个基因的高通量平行检测；
(3)检测时间短，耗样量少，反应体积小；(4)可根据实际需要任意组合探针；
(5)易于自动化及检测。
以下将结合附图对本发明作进一步说明 图1是本发明整个芯片制作和检测过程。图2是本发明重组抗性基因芯片探针点样阵列示意图。图3是本发明重组抗性基因芯片灵敏度检测结果，其中A、B、C和D所对应的DNA 浓度分别为 80ng/^l，20ηδ/μ1，5ηδ/μ1。图4是本发明细菌耐药基因检测芯片点样矩阵示意图。图5是本发明超广谱β -内酰胺酶耐药菌的检测结果。图6是本发明头孢菌素耐药菌的检测结果。
具体实施例方式参照附图1 6，基因检测芯片包括(1)17大类耐药基因的117条寡核苷酸探针组合和质量控制探针；(2)寡核苷酸探针通过手臂分子固化在载体材料上形成的探针阵列；
所述的寡核苷酸探针是指化学合成的多种耐药基因序列的高度保守区的互补寡聚核苷酸，长度为十到五十个碱基；
所述的细菌耐药基因检测芯片是指能检测17大类耐药基因的寡核苷酸阵列，17大类耐药基因包括超广谱β内酰胺酶、头孢菌素酶、碳青霉烯酶、整合酶类基因、四环素家族耐药基因、氨基糖甙类药物耐药基因、耐消毒剂基因、红霉素耐药相关基因、大环内酯类外排基因、耐万古霉素耐药基因、多药耐药外排泵基因、耐莫匹罗星基因、磺胺类耐药基因、泰洛星耐药基因、氟喹诺酮类药物耐药基因、氯霉素酰基转移酶、常用基因工程载体耐药基因；
所述的质量控制探针至少包括两种探针，即阳性对照和阴性对照；阴性对照用于检测杂交信号错误或污染，阳性对照用于检测是否正常杂交的和准确定位； 所述的手臂分子指具有双活性基团的长链有机化合物；
所述寡核苷酸固定为寡聚核苷酸的末端有一特定基团，固化在载体材料基质表面时与表面修饰的手臂分子的末端基团形成共价键；
所述的检测17大类耐药基因的117条寡核苷酸基因探针如下 整合酶类基因探针选自I类整合酶基因(IntIl)和II类整合酶基因(IntI2)，每个基因选取正负链探针各一条，共4条探针
intll 基因正链探针 5’ -NH2-T(10)CCAGTGGACATMGCCTGTT0GGTT0GTMACTGTMTGCMGTAGC-3， intll 基因负链探针 5’ -NH2-T(10)CTCTACGACGATGATTTACACGCATGTGCTGAMGTTGGCG-3' intI2 基因正链探针 5，-NH2-T (10)GGGCATTTAAAGCGATTTTCTGCGTGTTTATGGCTACATGTCTG-3' intI2 基因负链探针 5，-NH2-T (10) ATGCTTGCGTTTGCGGGTTAAAGATTTTGATTTTGATAATGGCTG-3' 四环素家族耐药基因探针选择tetM基因，设计正负链探针各一条，Tet(M)是研究得最多的核糖体保护蛋白，具有核糖体依赖的GTP水解酶活性，共2条探针
tetM 基因正链探针 5，-NH2-T (10) AGTGGGAAMTACGMGGTGMCATCATAGACACGCCAGGACA-3' tetM 基因负链探针 5’ -NH2-T (10)MGCGGATCACTATCTGAGATTTCCAAMGGGCATCMGCM-3'氨基糖甙类药物耐药基因探针，选取了易于传播并且危害较大的氨基糖甙类修饰酶基因有 aac (3) -I、aac (3) -11、aac (3) -III、aac (3) -IV、aac (6’)-I、aac (6’) -11、aphA6， ant (3') -I和ant (2’ ’)-I共9种，每个基因选取正负链探针各一条，共18条探针
aac (3)-1 基因正链探针 5，-NH2-T (10)GGTGCTTATGTGATCTACGTGCAAGCAGATTACGGTGACGATC-3' aac (3)-1 基因负链探针 5，-NH2-T (10)GAAAAGATCAAGAGCAGCCCTCATGGATTTGACTTGGTCAGG-3' aac (3)-11 基因正链探针 5，-NH2-T (10)GTCGAAACTATAGCAAATGCTTACGTGAAGCTCGGTCGCCAT-3' aac (3)-II 基因负链探针 5，-NH2-T (10) AATCGAGAATGCCGTTTGAATCGTATTCTGATGCCGTTTTCC-3' aac ⑶-III 基因正链探针 5，-NH2-T (10) TGGCTMACTGGTGGCMTAGMGGATA0GTGCTGATGCTTG-3， aac (3)-III 基因负链探针 5’ -NH2-T (10) CTATCCGTATGACGCTGAGTCACCGAACCGTGATTCAAGC-3' aac ⑶-IV 基因正链探针 5，-NH2-T (10) CTCAAGGAGAAGAGCCTTCAGMGGAAGGTCCAGTCGGTCAT-3' aac ⑶-IV 基因负链探针 5，-NH2-T (10) GTACCAACTTGCCATCCTGAAGAATGGTGCAGTGTCTCGG-3' aac (6，) -Ib 基因正链探针 5，-NH2-T (10) ACTTGCTGA0GTACAGGMCAGTACTTGCCMGCGTTTTAGCG-3， aac (6，) -Ib 基因负链探针 5，-NH2-T (10) ACTGGTCTATTC0GCGTACTCCTGGAT0GGTTTCTTCTTCCC-3， aac (6，) -II 基因正链探针 5，-NH2-T (10) GGTGGGAAGATGAAACTGATCCAGGAGTGCGAGGAATAGACC-3' aac (6，) -II 基因负链探针 5，-NH2-T (10) GTAGTGTTCCAGCACTTCATCMGAGT0GGT0GCTCTT0GTC-3， aphA6 基因正链探针 5，-NH2-T (10) TTGCCCMTATTATTCMCMTTTATCGGMACAGCGTTTTAGAGCCA-3， aphA6 基因负链探针 5，-NH2-T (10) 0GATTAMAGMTMACATC0GATGGCGACTGACCMTTTTATTTGGC-3， ant ( 3，)-I 基因正链探针 5，-NH2-T (10) TTGATC0GGTTCCTGMCAGGATCTATTTGAGGCGCTMATG-3， ant( 3，)-1 基因负链探针 5，-NH2-T (10) AO5GAATGATGT0GT0GTGCACAACAATGGTGACTTCTACAG-3' ant (2，，) -I 基因正链探针 5，-NH2-T (10) TACMAGCACATAGAGTCCTACAGGCT0GCATGCACCTCACTC-3， ant (2，，) -I 基因负链探针 5，-NH2-T (10) CAT0GGCATAGTAMAGTMTCCCAGATGAT0GCCTCCCAGC-3， 耐消毒剂qacA/B家族基因探针，设计正负链探针各一条，共2条探针 qacA/B 基因正链探针 5' -NH2-T (10)GATTTAGCTCATGTAGCTGAAGAATCTGTAGTGGGCGCTGTCGAA-3' qacA/B 基因负链探针 5' -NH2-T (10) TGCCATGAAAATTGCTCAAGTAAAGCTCCTCCGATAATTGGTCC-3' 红霉素耐药相关基因探针，已发现Erm基因家族有20余种基因亚型，以ErmA，ErmB和 ErmC三型为主，每个基因选取正负链探针各一条，共6条探针
ErmA 基因正链探针 5' -NH2-T (10) GATCCCCTACGGCATCACCTCCGCCATCGTCGACTGGT-3' ErmA 基因负链探针 5' -NH2-T (10) ACCCGTCGAGGAGCTGGAACAGCGTGATCCACTGGTCG-3' ErmB 基因正链探针 5' -NH2-T (10) TTGAAAGCCATGCGTCTGACATCTATCTGATTGTTGAAGAAGGATTC-3' ErmB 基因负链探针 5' -NH2-T (10)GCAAGAGCAACCCTAGTGTTCGGTGAATATCCAAGGTACGCTT-3' EnnC 基因正链探针 5' -NH2-T(10)0GTGGMTA0GGGTTTGCTMMGAnAnAMTACMM0GCTCATTGGC-3， EraiC 基因负链探针 5' -NH2-T(10)GGGTMMTGQXTTTT0CTGAGC0GATTTCMAGATAnATCATGTTC-3， 大环内酯类外排(mefA)基因探针，设计正负链探针各一条，共2条探针 mefA 基因正链探针 5，-NH2-T (10) TACCCCAGCACTCAATGCGGTTACACCACTTTTAGTACCAGAAGAA-3' mefA 基因负链探针 5，-NH2-T (10) TGCAATCACAGCACCCAATACGTCGATGGCAATAATAGCATTTAA-3' 耐万古霉素耐药基因探针，选用了由不同的耐药基因簇编码的VanA、VanB, VanCU VanC2,VanD, VanE6种表型，每个基因选取正负链探针各一条，共12条探针
VanA 基因正链探针 5' -NH2-T (10) AAMTCTTMTTGAGCAGGCTGTTTTGGGCTGTGAGGTCGGT-3' VanA 基因负链探针 5' -NH2-T (10) TACAMTCGCTGAGCTTTGMTATCGCAGCCTACAMGGGGA-3'VanB 基因正链探针 5’ -NH2-T (10) ACGGMGMCTTMCGCTGCGATAGMGCGGCAGGACMTAT-3' VanB 基因负链探针 5，-NH2_T(10) CCGTATCMTGTTCGCAGCMTTTCTATTGCGGATTTTACCGA-3， VanCl 基因正链探针 5’ -NH2-T (10) CTTGMCTMTGMCCTGCCTTATGTTGGTTGCCATGTCGCTG-3' VanCl 基因负链探针 5’ -NH2-T (10) CACAGTAGAACCGTAAGCAAAAGCAGTCGTTAATGCAGATTGGAGC-3' VanC2 基因正链探针 5，-NH2-T (10) AMTCMTACTATGCCGGGCTTTACGAGTCACTCCCGCTATCC-3' VanC2 基因负链探针 5，-NH2-T (10) CGTCTACTMTGAMTGGCGTCACMGCACCGACAGTCAMGA-3' VanD 基因正链探针 5' -NH2-T (10) AGGAACATGATGTTTCAGTGAAATCTGCGATGGAGGTTGCA-3' VanD 基因负链探针 5' -NH2-T (10) ATGCGTGGATAACGGCTATAGGAAGTAAATCCAGGCATGGTGTTC-3' VanE 基因正链探针 5' -NH2-T (10) CATGGAGGTTATGGTGAGAATGGTGCTATGCAGGGAGTATTTGAG-3' VanE 基因负链探针 5' -NH2-T (10) TGTCGTTCCTTCAAATAGATACCAATGACCTTCTTCGGTGATCCCTA-3' 多药耐药外排泵基因探针，选择包括AcrAB- TolC, OprM和Sme DEF外排泵基因，每个基因选取正负链探针各一条，共6条探针
AcrAB-TolC 基因正链探针 5，-NH2-T(10)GCAGMGTT0GTCCTCMGTTAGCGGGATTATCCTGMGCGT-3， AcrAB-TolC 基因负链探针 5，-NH2-T (10) TTCAGCAGGATTTTGC0GMCTCTTCAGTAGAGGTCAGA0GC-3， OprM 基因正链探针 5，-NH2-T (10) CCAAAAGAGGGCGGGATAGGCTAGAGCCCCTATAGCACTAGG-3' OprM 基因负链探针 5，-NH2-T (10)GTAGCTGCGCTGGGTCAGGTCGAAACTCTTCTGGTAGGTG-3' Sme DEF 基因正链探针 5' -NH2-T (10) AGTACCGATGGAAGTGATCCCCATGAAAAGTGCATCCCTGTT-3' Sme DEF 基因负链探针 5，-NH2-T (10) GTTGGACGAGCTGTTGGAGGAGAAGTAGATCAGGCCATCAAG-3' 耐莫匹罗星(ileS)基因探针，设计正负链探针各一条，共2条探针 ileS 基因正链探针 5，-NH2-T (10)GAGCCGATTCTTTAAGATGGGCCTTMTTTCGGATAGTGCTCCA-3' ileS 基因负链探针 5，-NH2-T (10) TTTCTGGTTATCAAAAGGATAATGATGCTGAGCAAACGGCATAGAGC-3' 磺胺类耐药基因探针，选择了 dfrA和dfrD两型，每个基因选取正负链探针各一条，共 4条探针
dfrA 基因正链探针 5，-NH2-T(10)GGMACCATTGCCMATAGA0GTM0GT0GTTCTCACTMCCMGCT-3， dfrA 基因负链探针 5，-NH2-T (10) (XT(XCATTACAAGTGTATTCCCAGTGGTCAGTTGTTTAACATGCTTT-3' dfrD 基因正链探针 5，-NH2-T(10)TTGTTGCGATGGATMGAMAGAGTMT0GGCMGGATM0GACATTC-3， dfrD 基因负链探针 5，-NH2-T(10)CCCTTC0GATTGATTGMGGTTCTTTCTACCTMTATGATTGCATGTCCT-3， 泰洛星(tlrB)耐药基因探针，设计正负链探针各一条，共2条探针 tlrB 基因正链探针 5，-NH2-T(10) CTACGGTCATGCGGMGMCGTCGTGCGATATCTGCGCTGTC-3， tlrB 基因负链探针 5' -NH2-T (10) AGCTTCGTCGGGCGTCTGAGCAGATTCACATAGCCCTGCC-3' 氟喹诺酮类(norA)药物耐药基因探针，norA基因介导的耐药在金葡菌中相当常见，设计正负链探针各一条，共2条探针
norA 基因正链探针 5，-NH2-T (10) TCCTCACAAAGCAACTACTGATGGATTCCACCAATATCAACCTGAA-3' norA 基因负链探针 5，-NH2-T (10) TCGTCCAATAACCGTTTGCAAGCACTAACATAACGAGAACAATGG-3' β内酰胺酶类(BLA)耐药基因探针，划分为超广谱β内酰胺酶、头胞菌素酶、碳青霉烯酶、金黄色葡萄球菌(MRSA)金标准mecA基因。 其中超广谱β内酰胺酶(ESBLs)耐药基因，按不同编码基因同源性分为TEM型、 SHV型、CTX-M型(由于各亚型间⑶S核酸基因序列差异较大，根据其序列的同源性分3组)， PER型和VEB型，每个基因选取正负链探针各一条，共14条探针TEM 基因正链探针 5’ -NH2-T (10) TTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAA-3’ TEM 基因负链探针 5，-NH2-T (10) GCGTCMCACGGGATMTACCGCACCACATAGCAGMCTTTM-3' SHV 基因正链探针 5' -NH2-T (10) TAACAAAGCAGAGCGCATCGTGGTGATTTATCTGCGGGATA-3' SHV 基因负链探针 5' -NH2-T (10) AGTAGTCCACCAGATCCTGCTGGCGATAGTGGATCTTTCGC-3' CTX-Ml 基因正链探针 5，-NH2-T (10) ATGAGACGTTTCGTCTGGATCGCACTGAACCTACGCTGAATA-3' CTX-Ml 基因负链探针 5' -NH2-T (10) CCGCCATAACTTTACTGGTACTGCACATTGGAAAGCGTTCATC-3' CTX-M2 基因正链探针 5' -NH2-T (10) AAGAAGAGCGACCTGGTTAACTACAATCCCATTGCGGAGAAACA-3' CTX-M2 基因负链探针 5，-NH2-T (10) CCCAGATGGGCAATCAGCTTATTCATGGCAGTATTGTCGCTAT-3' CTX-M3 基因正链探针 5' -NH2-T (10)GCGGTGCTGAAGAAAAGTGAAAGCGAACCGAATCTGTTAAATC-3' CTX-M3 基因负链探针 5' -NH2-T (10) CGTGAGCAATCAGCTTATTCATCGCCACGTTATCGCTGTACT-3' PER 基因正链探针 5，-NH2-T (10) CGGCCACTMTGATTTAGGTATCATTCTGTTGCCTGATGGACG-3， PER 基因负链探针 5，-NH2-T (10)GCACTGGAACACTAAACTCGTCTCCCTGATACGCTTTCATTATCGG-3' VEB 基因正链探针 5，-NH2-T (10) AGATTACCCCTCAAGACCTTTTGCCTAAAACGTGGAGTCCGATTAAA-3' VEB 基因负链探针 5' -NH2-T (10) TTTGATATTGGGTATTCCAATCCTTGTGCATTTGTTCTTCGTTTGCT-3' 头孢菌素酶(AmpC)耐药基因探针分为6组，几乎涵盖了所有的质粒AmpC基因序列，设计正负链探针各六条，共12条探针
AmpC 基因正链探针第一条 5' -NH2-T (10) AGCATCCAGCCGCTGCTCAAGGAGCACAGGATC-3' AmpC 基因负链探针第一条 5，-NH2-T (10) GCCTGCTTCGGCACATTGACATAGGTGTGGTGCAT-3' AmpC 基因正链探针第二条 5' -NH2-T (10) CCAGMCTGACAGGCAMMGTGGCAGGGTATCCGC-3' AmpC 基因负链探针第二条 5，-NH2-T (10) GTTTTCTCCTGAACGTGGCTGGCATCCATGTTGGC-3' AmpC 基因正链探针第三条 5，-NH2-T (10) CTTTCACAGGTGTGCTGGGTGCGGTTTCTGTGGC-3' AmpC 基因负链探针第三条 5，-NH2-T(10)GTA0GCATACTGGCTTTGCGCACTTTC0GGCACAGTMTMA-3， AmpC 基因正链探针第四条 5，-NH2-T (10) TATGGGTTAGCGGCAAMCAGCCTCAGCAGCCGGTTA-3' AmpC 基因负链探针第四条 5，-NH2-T(10)AGACTTTT0GC0GCMTCATCCCTAGCMACCAGTAC0GATA-3， AmpC 基因正链探针第五条 5，-NH2-T (10) CGCTTTTATCAAAACTGGCAGCCGCAGTGGAAGCC-3， AmpC 基因负链探针第五条 5’ -NH2-T (10) 0GAGCTGCTTTTCAGGMTMATGCCA0GTAGCTGCCMAC-3’ AmpC 基因正链探针第六条 5，-NH2-T (10) CATGGCGMCTATGCCTA0GGCTATT0GMGGMGATMGCC-3， AmpC 基因负链探针第六条 5，-NH2-T(10)MCCCCATAGTTGMATAGTGGGCCTTGCCATCTTTCAGCAC-3， 碳青霉烯酶耐药基因探针，选取了常见的基因型IMPl型及通用型、0XA23型、OXAM型， VIM型和GES2型，每个基因选取正负链探针各一条，共11条探针
IMP 基因通用正链探针 5' -NH2-T(10)CACT0CATTTA0GGCTAMGATACTGMMGTTAGTCACTTGGTTTGTGG-3， IMPl 基因正链探针 5' -NH2-T (10) CATTTTCATAGCGACAGCACGGGCGGMTAGAGTGGCTTMT-3' IMPl 基因负链探针 5，-NH2-T (10) CCGCCTGCTCTMTGTMGTTTCAAGAGTGATGCGTCTCCMC-3' 0XA23 基因正链探针 5，-NH2-T(10) TTAAMTGTTGMTGCCCTGATCGGATTGGAGMCCAGAMGC-3' 0XA23 基因负链探针 5，-NH2-T (10) TGATGAATCACCTGATTATGTCCTTGAACAATCTGACTCGGGGTTT-3' 0XA24 基因正链探针 5，-NH2-T (10)MTGGGTGTTACTCCACAGGTAGGTTGGTTGACTGGTTGGGT-3' 0XA24 基因负链探针 5，-NH2-T (10)GCTGACAATGCCATTGCCTCACCTAAAGTCATATCTTTCTCCCAC-3' VIM 基因正链探针 5' -NH2-T (10) GTGATGGTGATGAGTTGCTTTTGATTGATACAGCGTGGGGTG-3' VIM 基因负链探针 5，-NH2-T (10)GTTGCGATATGCGACCAAACACCATCAGCAATCTGGTAAAGC-3'GES2 基因正链探针 5，-NH2-T (10) CTGCGGTGCAGCTTAGCGACAATGGGGCTACTAACCTCTTAC-3' GES2 基因负链探针 5，-NH2-T (10) CCGCCATAGAGGACTTTAGCCACAGTACGTGCCATAGCAATAGG-3' MRSA金标准mecA基因探针，选取正负链探针各一条，共2条探针 mecA 基因正链探针 5，-NH2-T (10) GAACTCAAAATGAAACAAGGAGAAACTGGCAGACAAATTGGGTGG-3' mecA 基因负链探针 5，-NH2-T (10) TGGTCTTTCTGCATTCCTGGMTMTGACGCTATGATCCCMTCTMCT-3， 常用基因工程载体耐药基因探针，包括氯霉素酰基转移酶(Cat)基因、博莱霉素( Zeocin )基因、杀稻瘟菌素(Bsr)基因、嘌呤霉素(Puromycin)基因、卡那霉素(Kana)基因， 氨苄霉素(Amp)基因和四环素(Tet)基因，每个基因选取正负链探针至少各一条，共16条探针
Cat 基因正链探针 5，-NH2-T(10) CCTTGCAGCTTCATCATGCTGTATGTGATGGTTACCATGCTTC-3， Cat 基因负链探针 5，-NH2-T (10) CCAAGGAATCATTGAAATCGGTAGGGTGTTTTCAGGTATCGGTTT-3' Zeocin 基因正链探针 5，-NH2-T (10)GAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACTT-3' Zeocin 基因负链探针 5' -NH2-T (10) TCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAGTGCACGCAGTTG-3' Bsr 基因正链探针 5，-NH2-T (10) CCATTCATCTCAATGAGCACAAAGCAGTCAGGAGCATAGTCAGA-3' Bsr 基因负链探针 5' -NH2-T (10) AGGTCGCCACTGAGAAGATCACCATGCTCTATGAGGACAACA-3' Puromycin 基因正链探针 5' -NH2-T (10)GCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCT-3' Puromycin 基因负链探针 5' -NH2-T (10)GGTGACGGTGAAGCCGAGCCGCTCGTAGAAGGGGAGGTT-3' Kana 基因正链探针 5，-NH2-T (10) GAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAG-3' Kana 基因负链探针 5' -NH2-T (10) CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTAT-3’ Tet 基因正链探针 5，-NH2-T (10) CACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGG-3' Tet 基因负链探针 5’ -NH2-T (10) CGTAGTCGATAGTGGCTCCAAGTAGCGAAGCGAGCAGGA-3' Amp 基因正链探针第一条 5，-NH2-T (10) CACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGA-3' Amp 基因负链探针第一条 5，-NH2-T (10) CGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTA-3' Amp 基因正链探针第二条 5，-NH2-T (10)GCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCC-3' Amp 基因负链探针第二条 5，-NH2-T (10) CGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTAT-3' 所述的117条基因探针，其中探针的任何组合，用于基因芯片等的制备，固相载体材料包括但不仅限于玻片、金属片、硅片、陶瓷片、塑料片、硝酸纤维膜、尼龙膜等。所述的细菌耐药基因检测芯片，用于含有17大类耐药基因的病原菌检测、分型、 合理用药、感染病监测及流行病学调查。一种检测17大类耐药基因的检测基因芯片，包括了全基因组DNA的提取和扩增标记；载体如玻片、硅片等；载体表面手臂分子的修饰；寡核苷酸探针(包括检测寡核苷酸探针和质量控制探针)及其固化；检测和分析等。所述的细菌耐药基因检测芯片，其特征在于所述的117条基因探针，其中探针的任何组合，用于基因芯片等的制备，固相载体材料包括但不仅限于玻片、金属片、硅片、陶瓷片、塑料片、硝酸纤维膜、尼龙膜等。所述的细菌耐药基因检测芯片，用于含有17大类耐药基因的病原菌检测、分型、 合理用药、感染病监测及流行病学调查。
实施例一.耐药基因芯片检测Kana、Amp耐药大肠杆菌用合成的基因探针制备基因芯片，检测含Kana、Amp耐药基因的基因工程重组大肠杆菌。1.样本核酸的提取及标记
细菌全基因组DNA制备采用Bacterial Genomic DNA Extraction kit试剂盒，按说明书要求进行操作。将DNA调整到 μβ/μ1，然后4倍梯度稀释，最终灵敏度实验的DNA浓度分别为80ngM,20ngM,5ngM,0. 8ngM，0. 2ngM，随机引物标记法将Cy3 dCTP掺入 DNA，反应体系见下
全基因组DNA2μδ
随机引物(2ηπιο1/μ1) 2μ1
加 ddH20 总体积至 l(^l，97°C，3min50s 后冰浴 3min。放置冰上，加入
IM Cy3 dCTP1. 5μ1
IOXdUTPs2. 5μ1
Klenow fragment Buffer2. 5M-I
ddH204. 5μ1
室温放置2min
Klenow fragment4M-1
Total25μ1
室温放置 5min 后，37°C反应 2. 5h。补加 2μ1 klenow fragment，37°C反应 2. 5h，65°C反应5min。于-20°C保存。2.芯片的制备选用经硅烷化处理的玻片为芯片载体，用5%戊二醛浸泡50min，ddH20超声清洗2次， 置干燥处备用。选择了 iTet SUKana A2、Kana Sl禾PAmp A2四条探针，将合成的探针溶于3X SSC。 根据图2阵列进行点样，另设有阳性内参和空白对照探针。点样后，水合作用37°C，2h。使用时，先用0. 2% SDS洗两次，每次5min ；双蒸水洗两次，每次5min ；将玻片放入封闭(还原) 液中20min。0. 2% SDS洗三次，每次Imin ；双蒸水洗两次，每次Imin ；玻片自然干燥待用。3.芯片的杂交检测
取5μ1标记的目标DNA与5μ1杂交液(含阳参)充分混勻，98°C变性5min冰浴，点在探针阵列区域，42°C杂交4h。取出芯片，依次用42°C预热的杂交洗液I、II、III各洗5min，最后用ddH20洗anin，自然晾干(以上过程均要求避光)，用LuxScanTM10K Version3. O微阵列芯片扫描仪扫描及图像分析。整个芯片制作和检测过程见图1。4.检测结果
每条探针的杂交信号值为4个重复点的信号值的平均值，采用信噪比(SNR)值作为标准进行判断。我们以目标基因探针杂交信号的信噪比均值低于1. 5为阴性(-)，高于1. 5 为阳性(+ )，任一点信号值小于杂交背景或重复点之间信号值差异高于3倍，均被认为无效。如图3所示，虽然当目标DNA浓度为5叫/>1时，可检测到基因芯片杂交信号，但采用 LuxScan 10K分析软件处理后信噪比均<1. 5，未达到有效标准。当目标DNA浓度为20ng/ μ 时，Kana Α2和Kana Sl各点信噪比均值分别为4和7，即芯片的检测灵敏度为20ngM的 DNA。实施例二.细菌耐药基因芯片检测超广谱β内酰胺酶耐药菌株
临床上3代头胞菌素等超广谱β内酰胺酶(ESBLs)抗生素的广泛使用，使得产ESBLs 菌株的检出率逐年上升，在国内其主要由SHV、CTX-M基因介导产生，表现为多重耐药，为临床治疗带来困难。基因芯片相比传统检测方法在感染性疾病检测中有着独特优势，本实验建立了细菌耐药基因检测芯片，优化确定芯片检测条件，对部分样本耐药性进行了检测。1.芯片的制备
选用经硅烷化处理的玻片为芯片载体，用5%戊二醛浸泡50min，ddH20超声清洗2次， 置干燥处备用。合成的117条探针，在96孔板中用3XSSC溶解，浓度为40 pmol/μ 。用 Calligrapher MiniArrayer点样仪MCP360点样针，按设计的方案点(见图4)，点样完毕， 37°C水化》i，4°C保存备用。使用时，先用0.2% SDS洗两次，每次5min ；双蒸水洗两次，每次5min ；将玻片放入封闭(还原)液中20min。0. 2% SDS洗三次，每次Imin ；双蒸水洗两次， 每次lmin;玻片自然干燥待用。2.核酸提取与标记
对各菌株进行增菌培养后，细菌全基因组DNA按照Bacterial Genomic DNA Extraction kit试剂盒使用说明中的操作规程进行提取，琼脂糖凝胶电泳评价DNA的质量和完整性。klenow fragment随机引物标记法将Cy3 dCTP掺入DNA，反应体系全基因组 DNA 2μδ, random primer 2μ1，加 ddH20 至 10μ1，97 反应 3min50s，冰浴 3min。放置冰上，加 Λ Cy3-dCTP 1. 5μ1, IOXdNTPs 2. 5μ1, Klenow fragment Buffer 2. 5μ1, Klenow fragment 4μ1，加 ddH20 至 25μ1。室温静置 5min，37°C 反应 2. 5h，加入 4μ1 klenow fragment，继续反应 2. 5h，65°C反应 5min。于 _20°C保存。3.杂交及芯片检测
将荧光标记的目标DNA与杂交液(含阳参)1 1充分混勻，98°C变性5min冰浴。取出点在探针阵列区域，盖上大小合适的经硅烷化的盖玻片，将芯片放入杂交盒(盒内有适当的2XSSC以保持湿度)，42°C杂交4小时。取出芯片，依次用42°C预热的杂交洗液1、11、 III各洗5min，最后用ddH20洗anin，自然晾干(以上过程均要求避光)，用LuXScanTM10K VersioM.O微阵列芯片扫描仪扫描及图像分析。整个芯片制作和检测过程见图1。4.检测结果
经耐药试验表明，4株为超广谱β内酰胺酶耐药菌。芯片初步应用检测结果显示4株临床菌均检测出ESBL-CTXM1-3共6条耐药基因，其中1、2株检出TEM基因，4株检出PER基因，见图5。芯片杂交扫描图像信号清晰，具有较低的整体背景和较高的信噪比(S/N>10)， 耐药基因型检测结果与细菌耐药表型一致，并能够区分不同的基因型。实施例三.细菌耐药基因芯片检测头孢菌素耐药菌株
在耐药革兰氏阴性菌中，头孢菌素耐药菌(AmpC)对健康威胁很大，AmpC有着比ESBL更宽的底物谱且对酶抑制剂不敏感，可导致细菌严重耐药，治疗困难，病死率高。快速、准确、 高通量诊断病原菌和检测耐药基因是预防控制感染性疾病的关键所在。我们建立了细菌耐药基因检测芯片，对部分样本进行了检测比较。1.细菌全基因组提取与标记对各菌株进行增菌培养后，细菌全基因组DNA按照Bacterial Genomic DNA Extraction kit试剂盒使用说明中的操作规程进行提取，琼脂糖凝胶电泳评价DNA的质量和完整性。klenow fragment随机引物标记法将Cy3 dCTP掺入DNA，反应体系全基因组 DNA 2μδ, random primer 2μ1，加 ddH20 至 10μ1，97 反应 3min50s，冰浴 3min。放置冰上，加 Λ Cy3-dCTP 1. 5μ1, IOXdNTPs 2. 5μ1, Klenow fragment Buffer 2. 5μ1, Klenow fragment 4μ1，加 ddH20 至 25μ1。室温静置 5min，37°C 反应 2. 5h，加入 4μ1 klenow fragment，继续反应 2. 5h，65°C反应 5min。于 _20°C保存。2.芯片的制备
选用经硅烷化处理的玻片为芯片载体，用5%戊二醛浸泡50min，ddH20超声清洗2次， 置干燥处备用。合成的117条探针，在96孔板中用3XSSC溶解，浓度为40 pmol/μ 。用 Calligrapher MiniArrayer点样仪MCP360点样针，按设计的方案点样(见图4)。之后， 37°C水化》i，4°C保存备用。使用时，先用0.2% SDS洗两次，每次5min ；双蒸水洗两次，每次5min ；将玻片放入封闭(还原)液中20min。0. 2% SDS洗三次，每次Imin ；双蒸水洗两次， 每次lmin;玻片自然干燥待用。3.芯片杂交
将荧光标记的目标DNA与杂交液(含阳参)1 :1充分混勻，98°C变性5min冰浴。取出点在探针阵列区域，42°C杂交4小时。取出芯片，依次用42°C预热的杂交洗液I、II、III各洗 5min，最后用ddH20洗aiiin，自然晾干(以上过程均要求避光)，整个芯片制作和检测过程见图1。4.检测结果
已知检测的病原菌是头孢菌素耐药菌。用LuXScanTM10K Version3.0微阵列芯片扫描仪扫描及图像分析细菌耐药芯片，检测结果表明，3株病原菌均检测出共12条AmpC耐药基因，与常规耐药试验结果相符，芯片背景和杂交信号值都比较稳定，未见有非特异杂交信号，结果符合实验设计，见图6。
权利要求
1. 一种细菌耐药基因检测芯片，其特征在于基因检测芯片包括(1)17大类耐药基因的 117条寡核苷酸探针组合和质量控制探针；(2)寡核苷酸探针通过手臂分子固化在载体材料上形成的探针阵列；所述的寡核苷酸探针是指化学合成的多种耐药基因序列的高度保守区的互补寡聚核苷酸，长度为十到五十个碱基；所述的细菌耐药基因检测芯片是指能检测17大类耐药基因的寡核苷酸阵列，17大类耐药基因包括超广谱β内酰胺酶、头孢菌素酶、碳青霉烯酶、整合酶类基因、四环素家族耐药基因、氨基糖甙类药物耐药基因、耐消毒剂基因、红霉素耐药相关基因、大环内酯类外排基因、耐万古霉素耐药基因、多药耐药外排泵基因、耐莫匹罗星基因、磺胺类耐药基因、泰洛星耐药基因、氟喹诺酮类药物耐药基因、氯霉素酰基转移酶、常用基因工程载体耐药基因；所述的质量控制探针至少包括两种探针，即阳性对照和阴性对照；阴性对照用于检测杂交信号错误或污染，阳性对照用于检测是否正常杂交的和准确定位； 所述的手臂分子指具有双活性基团的长链有机化合物；所述寡核苷酸固定为寡聚核苷酸的末端有一特定基团，固化在载体材料基质表面时与表面修饰的手臂分子的末端基团形成共价键；所述的检测17大类耐药基因的117条寡核苷酸基因探针如下 整合酶类基因探针选自I类整合酶基因(IntIl)和II类整合酶基因(IntI2),每个基因选取正负链探针各一条，共4条探针intll 基因正链探针 5’ -NH2-T(10)CCAGTGGACATAAGCCTGTTCGGTTCGTAAACTGTAATGCAAG TAGC-3’intll 基因负链探针 5，-NH2-T(10)CTCTACGACGATGATTTACACGCATGTGCTGAAAGTTGGCG-3，intI2 基因正链探针 5，-NH2-T (10) GGGCATTTAAAGCGATTTTCTGCGTGTTTATGGCTACATGTCTG-3，intI2 基因负链探针 5，-NH2-T(10)ATGCTTGCGTTTGCGGGTTAAAGATTTTGATTTTGATAATGGC TG-3，四环素家族耐药基因探针选择tetM基因，设计正负链探针各一条，Tet(M)是研究得最多的核糖体保护蛋白，具有核糖体依赖的GTP水解酶活性，共2条探针tetM 基因正链探针 5，-NH2-T (10) AGTGGGAAAATACGAAGGTGAACATCATAGACACGCCAGGACA-3，tetM 基因负链探针 5，-NH2-T (10) AAGCGGATCACTATCTGAGATTTCCAAAAGGGCATCAAGCAA-3，氨基糖甙类药物耐药基因探针，选取了易于传播并且危害较大的氨基糖甙类修饰酶基因有 aac (3) -I、aac (3) -11、aac (3) -III、aac (3) -IV、aac (6’)-I、aac (6’) -11、aphA6， ant (3') -I和ant (2’ ’)-I共9种，每个基因选取正负链探针各一条，共18条探针aac (3)-I 基因正链探针 5' -NH2-T (10) GGTGCTTATGTGATCTACGTGCAAGCAGATTACGGTGACG ATC-3'aac (3)-I 基因负链探针 5' -NH2-T (10) GAAAAGATCAAGAGCAGCCCTCATGGATTTGACTTGGTCA GG-3，aac(3)-II 基因正链探针 5’ -NH2-T (10) GTCGAAACTATAGCAAATGCTTACGTGAAGCTCGGTCGC CAT-3，aac(3)-II 基因负链探针 5' -NH2-T(10)AATCGAGAATGCCGTTTGAATCGTATTCTGATGCCGTTT TCC-3'aac(3)-III 基因正链探针 5，-NH2-T (10) TGGCTAAACTGGTGGCAATAGAAGGATACGTGCTGATG CTTG-3，aac(3)-III 基因负链探针 5，-NH2-T(10)CTATCCGTATGACGCTGAGTCACCGAACCGTGATTCAA GC-3'aac (3) -IV 基因正链探针 5，-NH2-T (10) CTCAAGGAGAAGAGCCTTCAGAAGGAAGGTCCAGTCGGT CAT-3，aac (3) -IV 基因负链探针 5，-NH2-T (10) GTACCAACTTGCCATCCTGAAGAATGGTGCAGTGTCTCGG-3，aac (6') - 基因正链探针 5，-NH2-T (10) ACTTGCTGACGTACAGGAACAGTACTTGCCAAGCGTTT TAGCG-3'aac (6') - 基因负链探针 5，-NH2-T (10) ACTGGTCTATTCCGCGTACTCCTGGATCGGTTTCTTCT TCCC-3'aac (6，)-II基因正链探针5，-NH2-T(10)GGTGGGAAGATGAAACTGATCCAGGAGTGCGAGGAATA GACC-3'aac (6，)-II基因负链探针5，-NH2-T(10)GTAGTGTTCCAGCACTTCATCAAGAGTCGGTCGCTCTT CGTC-3'aphA6 基因正链探针 5' -NH2-T (10) TTGCCCAATATTATTCAACAATTTATCGGAAACAGCGTTTTAG AGCCA-3'aphA6 基因负链探针 5' -NH2-T(10)CGATTAAAAGAATAAACATCCGATGGCGACTGACCAATTTTAT TTGGC-3，ant ( 3，)-I 基因正链探针 5，-NH2-T (10) TTGATCCGGTTCCTGAACAGGATCTATTTGAGGCGCTA AATG-3'ant ( 3' )-1 基因负链探针 5' -NH2-T (10) ACGGAATGATGTCGTCGTGCACAACAATGGTGACTTCT ACAG-3，ant (2'，) -I 基因正链探针 5' -NH2-T (10) TACAAAGCACATAGAGTCCTACAGGCTCGCATGCACCT CACTC-3，ant (2'，) -I 基因负链探针 5' -NH2-T (10) CATCGGCATAGTAAAAGTAATCCCAGATGATCGCCTCC CAGC-3'耐消毒剂qacA/B家族基因探针，设计正负链探针各一条，共2条探针qacA/B 基因正链探针 5' -NH2-T (10) GATTTAGCTCATGTAGCTGAAGAATCTGTAGTGGGCGCTGTC GAA-3，qacA/B 基因负链探针 5' -NH2-T(10)TGCCATGAAAATTGCTCAAGTAAAGCTCCTCCGATAATTGGT CC-3'红霉素耐药相关基因探针，已发现Erm基因家族有20余种基因亚型，以ErmA，ErmB和 ErmC三型为主，每个基因选取正负链探针各一条，共6条探针ErmA 基因正链探针 5’ -NH2-T (10) GATCCCCTACGGCATCACCTCCGCCATCGTCGACTGGT-3’ ErmA 基因负链探针 5' -NH2-T (10) ACCCGTCGAGGAGCTGGAACAGCGTGATCCACTGGTCG-3' ErmB 基因正链探针 5' -NH2-T (10) TTGAAAGCCATGCGTCTGACATCTATCTGATTGTTGAAGAAGGA TTC-3，ErmB 基因负链探针 5，-NH2-T (10) GCAAGAGCAACCCTAGTGTTCGGTGAATATCCAAGGTACGCTT-3'ErmC 基因正链探针 5' -NH2-T (10) CGTGGAATACGGGTTTGCTAAAAGATTATTAAATACAAAACGCT CATTGGC-3'ErmC 基因负链探针 5' -NH2-T (10)GGGTAAAATGCCCTTTTCCTGAGCCGATTTCAAAGATATTATCA TGTTC-3，大环内酯类外排(mefA)基因探针，设计正负链探针各一条，共2条探针 mefA 基因正链探针 5' -NH2-T (10) TACCCCAGCACTCAATGCGGTTACACCACTTTTAGTACCAGAAG AA-3，mefA 基因负链探针 5' -NH2-T (10) TGCAATCACAGCACCCAATACGTCGATGGCAATAATAGCATTTAA-3，耐万古霉素耐药基因探针，选用了由不同的耐药基因簇编码的VanA、VanB, VanCU VanC2,VanD, VanE6种表型，每个基因选取正负链探针各一条，共12条探针VanA 基因正链探针 5，-NH2-T (10) AAAATCTTAATTGAGCAGGCTGTTTTGGGCTGTGAGGTCGGT-3'VanA 基因负链探针 5，-NH2-T (10) TACAAATCGCTGAGCTTTGAATATCGCAGCCTACAAAGGGGA-3，VanB 基因正链探针 5，-NH2-T (10) ACGGAAGAACTTAACGCTGCGATAGAAGCGGCAGGACAATAT-3'VanB 基因负链探针 5，-NH2-T (10) CCGTATCAATGTTCGCAGCAATTTCTATTGCGGATTTTACCGA-3，VanCl 基因正链探针 5，-NH2-T(10)CTTGAACTAATGAACCTGCCTTATGTTGGTTGCCATGTCGCTG-3，VanCl 基因负链探针 5' -NH2-T(10)CACAGTAGAACCGTAAGCAAAAGCAGTCGTTAATGCAGATTGG AGC-3，VanC2 基因正链探针 5，-NH2-T(10)AAATCAATACTATGCCGGGCTTTACGAGTCACTCCCGCTATCC-3'VanC2 基因负链探针 5，-NH2-T (10) CGTCTACTAATGAAATGGCGTCACAAGCACCGACAGTCAAAGA-3，VanD 基因正链探针 5' -NH2-T (10) AGGAACATGATGTTTCAGTGAAATCTGCGATGGAGGTTGCA-3' VanD 基因负链探针 5' -NH2-T(10)ATGCGTGGATAACGGCTATAGGAAGTAAATCCAGGCATGGTGTTC-3'VanE 基因正链探针 5' -NH2-T (10) CATGGAGGTTATGGTGAGAATGGTGCTATGCAGGGAGTATTTGAG-3，VanE 基因负链探针 5' -NH2-T(10)TGTCGTTCCTTCAAATAGATACCAATGACCTTCTTCGGTGATCC CTA-3，多药耐药外排泵基因探针，选择包括AcrAB- TolC, OprM和Sme DEF外排泵基因，每个基因选取正负链探针各一条，共6条探针AcrAB-TolC 基因正链探针 5' -NH2-T (10) GCAGAAGTTCGTCCTCAAGTTAGCGGGATTATCCTGAA GCGT-3'AcrAB-TolC 基因负链探针 5，-NH2-T (10) TTCAGCAGGATTTTGCCGAACTCTTCAGTAGAGGTCAG ACGC-3'OprM 基因正链探针 5，-NH2-T (10) CCAAAAGAGGGCGGGATAGGCTAGAGCCCCTATAGCACTAGG-3，OprM 基因负链探针 5' -NH2-T (10) GTAGCTGCGCTGGGTCAGGTCGAAACTCTTCTGGTAGGTG-3' Sme DEF 基因正链探针 5' -NH2-T (10) AGTACCGATGGAAGTGATCCCCATGAAAAGTGCATCCCTGTT-3'Sme DEF 基因负链探针 5' -NH2-T (10) GTTGGACGAGCTGTTGGAGGAGAAGTAGATCAGGCCATCAAG-3，耐莫匹罗星(ileS)基因探针，设计正负链探针各一条，共2条探针 iIeS 基因正链探针 5，-NH2-T(10)GAGCCGATTCTTTAAGATGGGCCTTAATTTCGGATAGTGCTCCA-3，ileS 基因负链探针 5' -NH2-T(10)TTTCTGGTTATCAAAAGGATAATGATGCTGAGCAAACGGCATAG AGC-3，磺胺类耐药基因探针，选择了 dfrA和dfrD两型，每个基因选取正负链探针各一条，共 4条探针dfrA 基因正链探针 5' -NH2-T (10) GGAAACCATTGCCAAATAGACGTAACGTCGTTCTCACTAACCAA GCT-3，dfrA 基因负链探针 5' -NH2-T (10) CGTCCCATTACAAGTGTATTCCCAGTGGTCAGTTGTTTAACATG CTTT-3，dfrD 基因正链探针 5' -NH2-T (10) TTGTTGCGATGGATAAGAAAAGAGTAATCGGCAAGGATAACGAC ATTC-3，dfrD 基因负链探针 5，-NH2-T(10)CCCTTCCGATTGATTGAAGGTTCTTTCTACCTAATATGATTGCA TGTCCT-3'泰洛星(tlrB)耐药基因探针，设计正负链探针各一条，共2条探针tlrB 基因正链探针 5，-NH2-T (10) CTACGGTCATGCGGAAGAACGTCGTGCGATATCTGCGCTGTC-3'tlrB 基因负链探针 5' -NH2-T (10) AGCTTCGTCGGGCGTCTGAGCAGATTCACATAGCCCTGCC-3' 氟喹诺酮类(norA)药物耐药基因探针，norA基因介导的耐药在金葡菌中相当常见，设计正负链探针各一条，共2条探针norA 基因正链探针 5' -NH2-T (10) TCCTCACAAAGCAACTACTGATGGATTCCACCAATATCAACCTG AA-3，norA 基因负链探针 5' -NH2-T (10) TCGTCCAATAACCGTTTGCAAGCACTAACATAACGAGAACAATGG-3'β内酰胺酶类(BLA)耐药基因探针，划分为超广谱β内酰胺酶、头胞菌素酶、碳青霉烯酶、金黄色葡萄球菌(MRSA)金标准mecA基因；其中超广谱β内酰胺酶(ESBLs)耐药基因，按不同编码基因同源性分为TEM型、SHV 型、CTX-M型(由于各亚型间⑶S核酸基因序列差异较大，根据其序列的同源性分3组)，PER 型和VEB型，每个基因选取正负链探针各一条，共14条探针TEM 基因正链探针 5' -NH2-T (10) TTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAA-3' TEM 基因负链探针 5' -NH2-T (10) GCGTCAACACGGGATAATACCGCACCACATAGCAGAACTTTAA-3，SHV 基因正链探针 5' -NH2-T (10) TAACAAAGCAGAGCGCATCGTGGTGATTTATCTGCGGGATA-3' SHV 基因负链探针 5' -NH2-T (10) AGTAGTCCACCAGATCCTGCTGGCGATAGTGGATCTTTCGC-3' CTX-Ml 基因正链探针 5，-NH2-T(10)ATGAGACGTTTCGTCTGGATCGCACTGAACCTACGCTGAATA-3，CTX-Ml 基因负链探针 5' -NH2-T(10)CCGCCATAACTTTACTGGTACTGCACATTGGAAAGCGTTCATC-3'CTX-M2 基因正链探针 5' -NH2-T (10) AAGAAGAGCGACCTGGTTAACTACAATCCCATTGCGGAGAAA CA-3，CTX-M2 基因负链探针 5' -NH2-T(10)CCCAGATGGGCAATCAGCTTATTCATGGCAGTATTGTCGCTAT-3'CTX-M3 基因正链探针 5' -NH2-T (10) GCGGTGCTGAAGAAAAGTGAAAGCGAACCGAATCTGTTAAATC-3'CTX-M3 基因负链探针 5，-NH2-T(10)CGTGAGCAATCAGCTTATTCATCGCCACGTTATCGCTGTACT-3'PER 基因正链探针 5，-NH2-T (10) CGGCCACTAATGATTTAGGTATCATTCTGTTGCCTGATGGACG-3'PER 基因负链探针 5' -NH2-T (10)GCACTGGAACACTAAACTCGTCTCCCTGATACGCTTTCATTATCGG-3'VEB 基因正链探针 5' -NH2-T (10) AGATTACCCCTCAAGACCTTTTGCCTAAAACGTGGAGTCCGATTA AA-3，VEB 基因负链探针 5，-NH2-T(10)TTTGATATTGGGTATTCCAATCCTTGTGCATTTGTTCTTCGTTTG CT-3，头孢菌素酶(AmpC)耐药基因探针分为6组，几乎涵盖了所有的质粒AmpC基因序列，设计正负链探针各六条，共12条探针AmpC 基因正链探针第一条 5，-NH2-T (10) AGCATCCAGCCGCTGCTCAAGGAGCACAGGATC-3' AmpC 基因负链探针第一条 5，-NH2-T (10) GCCTGCTTCGGCACATTGACATAGGTGTGGTGCAT-3' AmpC 基因正链探针第二条 5，-NH2-T (10) CCAGAACTGACAGGCAAAAAGTGGCAGGGTATCCGC-3'AmpC 基因负链探针第二条 5，-NH2-T (10) GTTTTCTCCTGAACGTGGCTGGCATCCATGTTGGC-3' AmpC 基因正链探针第三条 5，-NH2-T (10) CTTTCACAGGTGTGCTGGGTGCGGTTTCTGTGGC-3，AmpC 基因负链探针第三条 5，-NH2-T (10) GTACGCATACTGGCTTTGCGCACTTTCCGGCACAGTAA TAAA-3'AmpC 基因正链探针第四条 5，-NH2-T (10) TATGGGTTAGCGGCAAAACAGCCTCAGCAGCCGGTTA-3，AmpC 基因负链探针第四条 5，-NH2-T (10) AGACTTTTCGCCGCAATCATCCCTAGCAAACCAGTACC GATA-3'AmpC 基因正链探针第五条 5，-NH2-T (10) CGCTTTTATCAAAACTGGCAGCCGCAGTGGAAGCC-3， AmpC 基因负链探针第五条 5，-NH2-T (10) CGAGCTGCTTTTCAGGAATAAATGCCACGTAGCTGCCA AAC-3，AmpC 基因正链探针第六条 5，-NH2-T (10) CATGGCGAACTATGCCTACGGCTATTCGAAGGAAGATA AGCC-3'AmpC 基因负链探针第六条 5，-NH2-T (10) AACCCCATAGTTGAAATAGTGGGCCTTGCCATCTTTCA GCAC-3，碳青霉烯酶耐药基因探针，选取了常见的基因型頂Pl型及通用型、0XA23型、OXAM型， VIM型和GES2型，每个基因选取正负链探针各一条，共11条探针IMP 基因通用正链探针 5' -NH2-T (10) CACTCCATTTACGGCTAAAGATACTGAAAAGTTAGTCACTT GGTTTGTGG-3'IMPl 基因正链探针 5，-NH2-T (10) CATTTTCATAGCGACAGCACGGGCGGAATAGAGTGGCTTAAT-3'IMPl 基因负链探针 5，-NH2-T (10) CCGCCTGCTCTAATGTAAGTTTCAAGAGTGATGCGTCTCCAAC-3'0XA23 基因正链探针 5，-NH2-T(10)TTAAAATGTTGAATGCCCTGATCGGATTGGAGAACCAGAAAGC-3'0XA23 基因负链探针 5' -NH2-T(10)TGATGAATCACCTGATTATGTCCTTGAACAATCTGACTCGGGG TTT-3，0XA24 基因正链探针 5，-NH2-T (10) AATGGGTGTTACTCCACAGGTAGGTTGGTTGACTGGTTGGGT-3'0XA24 基因负链探针 5' -NH2-T(10)GCTGACAATGCCATTGCCTCACCTAAAGTCATATCTTTCTCCC AC-3'VIM 基因正链探针 5' -NH2-T (10) GTGATGGTGATGAGTTGCTTTTGATTGATACAGCGTGGGGTG-3' VIM 基因负链探针 5' -NH2-T (10) GTTGCGATATGCGACCAAACACCATCAGCAATCTGGTAAAGC-3' GES2 基因正链探针 5，-NH2-T (10) CTGCGGTGCAGCTTAGCGACAATGGGGCTACTAACCTCTTAC-3'GES2 基因负链探针 5，-NH2-T(10)CCGCCATAGAGGACTTTAGCCACAGTACGTGCCATAGCAATAGG-3'MRSA金标准mecA基因探针，选取正负链探针各一条，共2条探针mecA 基因正链探针 5' -NH2-T (10) GAACTCAAAATGAAACAAGGAGAAACTGGCAGACAAATTGGGTGG-3'mecA 基因负链探针 5’ -NH2-T (10) TGGTCTTTCTGCATTCCTGGAATAATGACGCTATGATCCCAATC TAACT-3，常用基因工程载体耐药基因探针，包括氯霉素酰基转移酶(Cat)基因、博莱霉素( Zeocin )基因、杀稻瘟菌素(Bsr)基因、嘌呤霉素(Puromycin)基因、卡那霉素(Kana)基因， 氨苄霉素(Amp)基因和四环素(Tet)基因，每个基因选取正负链探针至少各一条，共16条探针Cat 基因正链探针 5，-NH2-T (10) CCTTGCAGCTTCATCATGCTGTATGTGATGGTTACCATGCTTC-3'Cat 基因负链探针 5，-NH2-T(10)CCAAGGAATCATTGAAATCGGTAGGGTGTTTTCAGGTATCGGTTT-3'Zeocin 基因正链探针 5，-NH2-T (10) GAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACTT-3'Zeocin 基因负链探针 5' -NH2-T (10) TCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAGTGCACGCAGTTG-3' Bsr 基因正链探针 5，-NH2-T (10) CCATTCATCTCAATGAGCACAAAGCAGTCAGGAGCATAGTCAGA-3，Bsr 基因负链探针 5' -NH2-T (10) AGGTCGCCACTGAGAAGATCACCATGCTCTATGAGGACAACA-3' Puromycin 基因正链探针 5' -NH2-T (10) GCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCT-3'Puromycin 基因负链探针 5，-NH2-T (10) GGTGACGGTGAAGCCGAGCCGCTCGTAGAAGGGGAGGTT-3'Kana 基因正链探针 5，-NH2-T(10)GAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAG-3，Kana 基因负链探针 5' -NH2-T (10) CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTAT-3' Tet 基因正链探针 5' -NH2-T (10) CACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGG-3' Tet 基因负链探针 5' -NH2-T (10) CGTAGTCGATAGTGGCTCCAAGTAGCGAAGCGAGCAGGA-3' Amp 基因正链探针第一条 5，-NH2-T (10) CACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGA-3' Amp 基因负链探针第一条 5，-NH2-T (10) CGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTA-3' Amp 基因正链探针第二条 5，-NH2-T (10)GCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCC-3' Amp 基因负链探针第二条 5，-NH2-T (10) CGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTAT-3'。
2.根据权利要求1所述的细菌耐药基因检测芯片，其特征在于所述的117条基因探针， 其中探针的任何组合，用于基因芯片的制备，固相载体材料包括但不仅限于玻片、金属片、 硅片、陶瓷片、塑料片、硝酸纤维膜、尼龙膜。
3.权利要求1所述的细菌耐药基因检测芯片，用于含有17大类耐药基因的病原菌检测、分型、合理用药、感染病监测及流行病学调查。
全文摘要
本发明涉及的是一种高通量的细菌耐药基因检测芯片及其应用。基因芯片含有117条基因探针，耐药基因探针选自17大类耐药基因，包括超广谱β内酰胺酶、头孢菌素酶、碳青霉烯酶、整合酶类基因、四环素家族耐药基因、氨基糖甙类药物耐药基因、耐消毒剂基因、红霉素耐药相关基因、大环内酯类外排基因、耐万古霉素耐药基因、多药耐药外排泵基因、耐莫匹罗星基因、磺胺类耐药基因、泰洛星耐药基因、氟喹诺酮类药物耐药基因、氯霉素酰基转移酶、常用基因工程载体耐药基因。该芯片用于病原菌耐药基因的检测。其特征在于芯片包括(1)17大类耐药基因的117条寡核苷酸探针组合和质量控制探针；(2)寡核苷酸探针通过手臂分子固化在载体材料上形成的探针阵列。
文档编号C12Q1/68GK102321763SQ201110276409
公开日2012年1月18日 申请日期2011年9月19日 优先权日2011年9月19日
发明者傅雅丽, 李越希, 潘明洁, 潘英 申请人:李越希