专利名称：一种碘普罗胺高效降解菌的提取方法
技术领域：
本发明属于含氮的芳香杂环化合物的降解菌的提取领域，特别涉及一种碘普罗胺高效降解菌的提取方法。
背景技术：
ΕΙ^^^^Α^ Μβπ (pharmaceuticals andpersonal care products, PPCPs)成为了受到国内外广泛关注的新型痕量污染物。尽管这类物质在环境中的浓度很低，其中有些药品在环境中通常以ng/L μ g/L水平存在，但是考虑到污染物在环境中的累积效应，因此不能排除其对环境的不利影响。在常见的PPCPs化合物中，抗生素、消炎药、抗癫痫药物、碘化造影剂在各类环境介质中均有检出。碘普罗胺(分子结构如图1所示)，是用于血管造影、肾动脉造影、尿路造影、CT的对比增强检查、体腔显示(关节腔造影，子宫输卵管造影，娄道造影)的一种碘化造影剂(iodinated contrast media compounds，ICM)。随着现代放射诊断技术和介入治疗技术的发展，ICM市场需求日益增加，其全球年销量达到3. 5 X IO3吨，在中国，碘普罗胺的销量在ICM中居第二位。ICM的使用剂量较高，每个成人每日ICM的消费剂量可高达200g，且其具有极强的生化稳定性，人体注射后，大部分不经新陈代谢而直接排出体外，大量ICM进入城市污水处理厂。然而碘普罗胺是含氮的芳香杂环化合物，城市污水处理厂的常规工艺对其几乎没有去除效果，从而使其随污水处理厂出水进入地表径流，地下水，甚至饮用水中。 欧洲一些国家如德国已经在各种水体环境中频繁检测到碘普罗胺，有时浓度高达10μ g/L， 对饮水安全造成了潜在的危害。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种碘普罗胺高效降解菌(Pseudomonas sp) 1-24的提取方法，该提取方法中种源易得，且分离纯化方法简便快捷；该细菌在共代谢条件下可以有效地降解碘普罗胺，易于灭活，保证了使用的生态安全性。本发明的一种碘普罗胺高效降解菌(Pseudomonas sp) 1-24的提取方法，包括将城市污水处理厂二沉池的回流污泥经定向驯化培养，然后将驯化培养后的样品通过富集分离和纯化，即得该碘普罗胺高效降解菌。所述的定向驯化培养为将活性污泥按5%的接入量接种于无机盐培养基中，以梯度压力式驯化法驯化；其中碘普罗胺浓度为10mg/L、50mg/L、80mg/L、100mg/L、130mg/L、 150mg/L, 150mL锥形瓶中装填量lOOmL，在30°C、160r/min的摇床中避光振荡培养，总驯化时间为2个月。所述的无机盐培养基为NH4Cl 2. lg, K2HPO4 4. 35g，KH2PO4 1. 7g，MgSO4 0. 2g， CaCl2 · 2H20 0. 03g, MnSO4 0. 05g, FeSO4 · 7H20 0. Olg,蒸馏水 IOOOmL, pH = 6. 8 7. 0。所述的富集分离和纯化为将驯化培养后的样品静置30分钟，取上层水样lmL，作 IO-1 ΙΟ,梯度稀释，然后将每种稀释浓度分别取ImL菌液涂布于固体培养基中，并将其倒置于30°C培养箱中培养48h;挑取形态清晰的单一菌落，编号，在固体培养基上划线，将培养皿倒置于30°C培养箱中培养48h，再观察结果；反复几次，并在电子显微镜下观察，确保是纯的单一菌株后，将分离出的菌种接种到斜面培养基上，4°C下保存于冰箱中。上述的富集培养基为牛肉膏3. 0g，蛋白胨10. 0g，NaCl 5. 0g，琼脂粉18g，蒸馏水 IOOOmL, ρΗ = 7. 0 7. 2。经16S rDNA序列测定及在NCBI数据库中进行同源性比较，得到与本发明的碘普罗胺高效降解菌最相近的种属是假单胞菌属(Pseudomonas)，同源性达到99%。结合细菌形态特征、生理生化鉴定结果确定该碘普罗胺高效降解菌为假单胞菌属，其16S rDNA序列在 GenBank 中的登录号为 JN226399，命名为(Pseudomonas sp)I_24。该碘普罗胺高效降解菌(Pseudomonas sp) 1_24经16S rDNA序列测定，基因全序列如下TGCTCCCCGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTCCGAAAGGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGTGGGGGATCTTCGGACCTCACGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCTGCAAGTTAATACCTTGTAGTTTTGACGTTACCAACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGGTAAGATGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCATAACTGCCTGACTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGATCCTTGAGATCTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGT-GGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGTCCGGAATCCTGCAGAGATGTGGGAGTGCCTTCGGGAATCGGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCGGGTTATGCCGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCACAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGG。所述的碘普罗胺高效降解菌(Pseudomonas sp) 1-24为阴性革兰氏杆菌，好氧，菌体大小为(0. 2μπι 0.4μπι)Χ (0.9μπι 1.3μπι)，其电镜扫描图见图3 ；在固体培养基中，其菌落直径大小为1. 5-2mm,圆形，低突起，表面光滑，边缘整齐，有光泽，呈乳黄色；在无机盐培养基中的培养特征为乳黄色悬浊液。
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所述的固体培养基为牛肉膏3. 0g，蛋白胨10. 0g, NaCl 5. 0g，琼脂粉18g，蒸馏水 IOOOmL, pH = 7. 0 7. 2 ；所述的无机盐培养基为 K2HPO4 4. 35g，KH2PO4 1. 7g，NH4Cl 2. lg， MgSO4 0. 2g, MnSO4 0. 05g, FeSO4 · 7H20 0. Olg, CaCl2 · 2H20 0. 03g，蒸馏水 IOOOmL, pH = 6. 8-7. O。所述的碘普罗胺高效降解菌(Pseudomonas sp) 1-24在共代谢条件下对碘普罗胺具有高效降解作用。所述的碘普罗胺高效降解菌(Pseudomonas sp) 1-24在紫外线照射2h后，即失去活性。本发明提取得到的碘普罗胺高效降解菌需氧性试验好氧，革兰氏染色、尿素酶试验、葡萄糖产气、葡萄糖发酵、甲基红试验、V-P试验、产硫化氢试验、吲哚试验、明胶试验、西蒙氏枸橼酸盐试验等均呈阴性，氧化酶试验、淀粉水解试验、过氧化氢酶试验等均呈阳性。将(Pseudomonassp) 1-24 接种至含碘普罗胺 30mg/L、淀粉 100mg/L、pH 为 7. 0 的 IOOrnl无机盐培养基中，在160r/min、3(TC摇床中避光振荡培养，在第0、1、2、3、4、5、6天时分别取样测定培养液中0D600和碘普罗胺的残留浓度，其实验结果见图4。由图可以看出， 开始阶段(0-1天)碘普罗胺的降解较缓慢，接下来在1-2天之间碘普罗胺降解非常快，到第2天时，碘普罗胺的残留浓度即为5. 55mg/L,降解率达到81. 6%，到第4天时，碘普罗胺残留浓度为0. 85mg/L,降解率达到97%。并且在一定范围内，(Pseudomonas sp) 1-24对碘普罗胺的降解速率会随淀粉含量的增大而提高。另外，葡萄糖、酵母、蛋白胨都可作为该菌种降解碘普罗胺的共代谢基质。而且该菌种能在相对较高浓度的碘普罗胺基质条件下(碘普罗胺浓度约为180mg/L)良好生长。针对碘普罗胺为含氮的芳香杂环化合物，属于难生物降解的有机物，借助生物强化技术的思想，从城市污水处理厂二沉池的回流污泥中经驯化、富集分离、纯化后，得到一株对碘普罗胺具有高效降解作用的细菌；该菌株是废水处理系统中降解碘普罗胺的优势菌株，因此该菌株能适应复杂的实际条件，这使得该菌的应用前景广阔。有益效果(1)本发明所提供的假单胞菌(Pseudomonas sp) 1_24的种源为城市污水处理厂的活性污泥，种源易得且分离纯化方法简便快捷；(2)本发明所提取的假单胞菌(Pseudomonas sp) 1_24在共代谢条件下可以有效地降解碘普罗胺，当以淀粉为共代谢基质时，2天后其对碘普罗胺的降解率可达81. 6%，4 天后降解率即达到97% ；(3)本发明所提取的假单胞菌(Pseudomonas sp) 1-24在紫外线照射2h后即失去活性，易于灭活，保证了使用的生态安全性。
图1为碘普罗胺的分子结构式。图 2 为(Pseudomonas sp) 1-24 的系统进化树。图 3 为(Pseudomonas sp) 1-24 的扫描电镜(X 10000)。图4为(Pseudomonas sp) 1-24生长与碘普罗胺的降解曲线图。其中方框线表示培养液的0D600值，表征(Pseudomonas sp) 1-24的菌浓度；三角线表示培养液中碘普罗胺的残留浓度。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1本发明的所述的碘普罗胺高效降解菌获取的
具体实施例方式(1)取自城市污水处理厂二沉池的活性污泥按5%的接入量接种于无机盐培养基中，其中无机盐培养基为 K2HPO4 4. 35g，KH2PO4 1. 7g，NH4Cl 2. lg，MgSO4 0. 2g，MnSO4O. 05g, FeSO4 · 7H20 0. Olg, CaCl2 · 2H20 0. 03g,蒸馏水 IOOOmL, pH = 6. 8-7. 0。以梯度压力式驯化法驯化，碘普罗胺浓度为10、50、80、100、130、150mg/L，在30°C、160r/min, 150mL锥形瓶中装填量IOOmL的摇床培养条件下进行驯化培养，总驯化时间为2个月。(2)取驯化2个月后的样品，静置30分钟，取上层水样lmL，作10—1 10,梯度稀释。每种稀释浓度分别取ImL菌液于培养皿内，然后将每种稀释浓度分别取ImL菌液涂布于固体培养基中，并将其倒置于30°C培养箱中培养48h;挑取形态清晰的单一菌落，编号， 在固体培养基上划线，将培养皿倒置于30°C培养箱中培养48h，再观察结果。反复几次，并在电子显微镜下观察，确保是纯的单一菌株后，将分离出的菌种接种到斜面培养基上，4°C 下保存于冰箱中待后续进行降解试验。其中固体培养基为牛肉膏3. 0g，蛋白胨10. Og5NaCl 5. Og,琼脂粉 18g，蒸馏水 IOOOmL, pH = 7. 0 7. 2。(3)分别挑取一定量的经分离纯化后的单一菌落于各自的无机盐培养基中，各无机盐培养基中均含有30mg/L的碘普罗胺，在30°C、160r/min，150mL锥形瓶中装填量IOOmL 的条件下进行培养，培养时间为6天。培养后通过测定0D600观察菌量生长情况并测定溶液中碘普罗胺的剩余浓度，发现各单菌落对碘普罗胺的降解率并不明显，最好的单菌落1-24 的降解率也只有6%，随后在菌液中加入100mg/L的葡萄糖继续培养六天，1-24的降解率提高到48%，从而确定出对碘普罗胺具有高效降解作用的菌株。利用高效液相色谱法测定测定碘普罗胺的残留浓度，色谱条件色谱柱为Eclipse XDB C18(4.6X25(kim，5ym)；流动相为乙腈水=9 91(V V)；测定波长为242nm ；流速为0. 4ml/min ；柱温为25°C。碘普罗胺是同分异构体，其两个峰的保留时间分别约为Smin 和 8. 8min。实施例2将(Pseudomonassp) 1-24 接种至含碘普罗胺 30mg/L、淀粉 100mg/L、pH 为 7. 0 的 IOOrnl无机盐培养基中，在160r/min、3(TC摇床中避光振荡培养，在第0、1、2、3、4、5、6天时分别取样测定培养液中0D600和碘普罗胺的残留浓度，其实验结果见图4。由图可以看出， 开始阶段(0-1天)碘普罗胺的降解较缓慢，接下来在1-2天之间碘普罗胺降解非常快，到第2天时，碘普罗胺的残留浓度即为5. 55mg/L,降解率达到81. 6%，到第4天时，碘普罗胺残留浓度为0. 85mg/L,降解率达到97%。并且在一定范围内，(Pseudomonas sp) 1-24对碘普罗胺的降解速率会随淀粉含量的增大而提高。淀粉作为(Pseudomonas sp) 1_24的生长基质，其代谢过程为该菌株生长提供了足够的碳源和能源，并诱导其产生相应的降解酶来降解碘普罗胺。
权利要求
1.一种碘普罗胺高效降解菌(Pseudomonas sp) 1-24的提取方法，包括将城市污水处理厂二沉池的回流污泥经定向驯化培养，然后将驯化培养后的样品通过富集分离和纯化，即得该碘普罗胺高效降解菌。
2.根据权利要求1所述的一种碘普罗胺高效降解菌的提取方法，其特征在于所述的定向驯化培养为将活性污泥按5%的接入量接种于无机盐培养基中，以梯度压力式驯化法驯化；其中碘普罗胺浓度为 10mg/L、50mg/L、80mg/L、100mg/L、130mg/L、150mg/L，150mL 锥形瓶中装填量IOOmL,在30°C、160r/min的摇床中避光振荡培养，总驯化时间为2个月。
3.根据权利要求2所述的一种碘普罗胺高效降解菌的提取方法，其特征在于所述的无机盐培养基为 NH4Cl 2. lg, K2HPO4 4. 35g，KH2PO4 1. 7g，MgSO4 0. 2g，CaCl2 · 2H20 0. 03g， MnSO4 0. 05g, FeSO4 · 7H20 0. Olg,蒸馏水 IOOOmL, pH = 6. 8 7. 0。
4.根据权利要求1所述的一种碘普罗胺高效降解菌的提取方法，其特征在于所述的富集分离和纯化为将驯化培养后的样品静置30分钟，取上层水样ImL作ICT1 10_1(1梯度稀释，然后将每种稀释浓度分别取ImL菌液涂布于固体培养基中，并将其倒置于30°C培养箱中培养48h;挑取形态清晰的单一菌落，编号，在固体培养基上划线，将培养皿倒置于30°C 培养箱中培养48h，再观察结果；反复几次，并在电子显微镜下观察，确保是纯的单一菌株后，将分离出的菌种接种到斜面培养基上，4°C下保存于冰箱中。
5.根据权利要求4所述的一种碘普罗胺高效降解菌的提取方法，其特征在于所述的固体培养基为牛肉膏3.0g，蛋白胨10. 0g，NaCl 5. 0g，琼脂粉18g，蒸馏水lOOOmL，pH = 7.0 7. 2。
全文摘要
本发明涉及一种碘普罗胺高效降解菌的提取方法，包括将城市污水处理厂二沉池的回流污泥经定向驯化培养，然后将驯化培养后的样品通过富集分离和纯化，即得。本发明的碘普罗胺高效降解菌的提取的种源为城市污水处理厂的活性污泥，种源易得且分离纯化方法简便快捷；本发明所得的碘普罗胺高效降解菌在共代谢条件下可以有效地降解碘普罗胺，且易于灭活，在紫外线照射2h后即失去活性，保证了使用的生态安全性。
文档编号C12R1/38GK102329748SQ201110276469
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月16日 优先权日2011年9月16日
发明者冯菲, 刘亚男, 刘凯英, 刘振鸿, 刘琼, 吴瑶, 李姗珊, 杨琦, 杨萍, 石为民, 薛罡 申请人:东华大学